El objetivo de este estudio fue evaluar el papel de 2 compuestos fenólicos naturales ampliamente distribuidos, el ácido gálico (AG) y el galato de metilo (GM), en un modelo in vitro de urolitiasis, utilizando la metodología de formación de cristales de oxalato de calcio, el tipo más común de cálculos urinarios o renales.
Material y métodosLos compuestos AG y GM fueron sometidos a actividades de «anticristalización» en diferentes concentraciones (0,003-0,03mg/mL), y la cantidad y morfología de los cristales se determinó por microscopia después de 60min.
ResultadosEl AG inhibió alrededor del 44-57% de la formación total de cristales de cristales de oxalato de calcio, mientras que el GM inhibió alrededor del 48,35%, en comparación con las muestras expuestas al vehículo (agua destilada; grupo de control negativo). La exposición a AG y GM inhibió la formación de cálculos de tipo monohidrato, considerada la categoría de cristales más común y dañina. Los compuestos también disminuyeron la absorbancia, lo que a su vez está relacionado con una reducción de la agregación y precipitación de cristales de oxalato de calcio.
ConclusionesEn conjunto, este estudio muestra, por primera vez, que el AG y el GM son compuestos prometedores con propiedades antiurolitiásicas, brindando nuevas perspectivas para futuros estudios in vivo del potencial de estos compuestos en el tratamiento y/o prevención de los cálculos urinarios o renales.
This study aimed to evaluate the role of 2 widely distributed natural phenolic compounds, gallic acid (GA) and methyl gallate (MG), in an in vitro model of urolithiasis, by using the methodology of calcium oxalate crystals formation, which is the most common type of urinary or kidney stones.
Material and methodsThe compounds GA and MG were subjected to anti-crystallization activities in different concentrations (0.003-0.03mg/mL), and the quantity and morphology of crystals were determined by microscopy after 60min.
ResultsGA inhibited about 44-57% of the total calcium oxalate crystals formation, while MG inhibited about 48.35%, when compared to vehicle-exposed samples (distilled water; negative control group). GA and MG exposure inhibited monohydrate type calculi formation, which is considered the most common and harmful crystal category. The compounds also decreased absorbance, which in turn is related to reduced calcium oxalate crystals aggregation and precipitation.
ConclusionsAltogether, this study shows, for the first time, that GA and MG are promising compounds with antiurolithiatic properties, opening new perspectives for future in vivo evaluations of the potential of these compounds in the treatment and/or prevention of urinary or kidney stones.
La urolitiasis, también conocida como enfermedad por cálculos renales, es un problema de salud pública de alto coste y creciente a nivel mundial, cuyo tratamiento tiene un alto impacto sobre la calidad de vida de los pacientes. Su prevalencia e incidencia han ido en aumento en las últimas décadas, afectando a cerca del 12% de la población mundial1. Provoca, entre otros síntomas, molestias y dolores intensos causados principalmente por la dilatación, el estiramiento y el espasmo debidos a la obstrucción ureteral aguda. Además, al menos el 50% de los pacientes también experimentan náuseas y vómitos2.
La composición química más frecuente de los cálculos renales es el oxalato de calcio (CaOx), que inicia la formación de los cálculos mediante la cristalización, crecimiento cristalino, agregación cristalina y adherencia de los cristales a las células, lo que lleva a la invasión de los cristales a través de la matriz extracelular al intersticio renal3. Clínicamente, aún no existen estrategias eficaces para la disolución farmacológica de estos cristales y el manejo se centra principalmente en la eliminación física y la prevención, especialmente en lo que respecta a los pacientes con episodios frecuentes de urolitiasis recurrente. Su prevención se centra en cambios en la dieta, principalmente aumentando la ingesta de agua, y en el uso adecuado o la evitación de ciertos medicamentos4.
Las plantas medicinales se utilizan actualmente para el manejo de la urolitiasis, destacando los bioactivos derivados naturalmente, de gran interés terapéutico por sus efectos favorables en la salud humana, principalmente los polifenoles. En este contexto, el ácido gálico (AG) y el galato de metilo (GM) son compuestos fenólicos naturales que se encuentran comúnmente en frutas y plantas medicinales, con efectos reportados sobre la promoción de la salud como antioxidantes, antiinflamatorios y antimicrobianos5,6. Además, estudios recientes han demostrado que tanto el AG como el GM presentan propiedades diuréticas in vivo en su administración en ratas7,8, pero su papel en la urolitiasis es aún desconocido. Teniendo en cuenta que los agentes diuréticos actúan aumentando la diuresis e indirectamente reduciendo la precipitación de calcio al aumentar la solubilidad, lo que ayuda a prevenir la recurrencia de la urolitiasis9,10, este estudio tuvo como objetivo evaluar las propiedades inhibitorias de los compuestos AG y GM en el modelo in vitro de cristalización urinaria de CaOx.
Material y métodosAislamiento de los compuestosEl GM y el AG se aislaron a partir de la fracción de acetato de etilo de las hojas de Mimosa bimucronata, tal y como describen detalladamente Schlickmann et al.7. Un espécimen de referencia de la planta fue depositado en el Herbário Barbosa Rodrigues con el número VCF 146. Los procedimientos dieron como resultado el aislamiento de 265mg de GM y 10mg de AG (grado de pureza≥96%). La identificación y determinación del grado de pureza de los compuestos se realizó mediante análisis de RMN y HPLC, comparados con muestras estándar obtenidas comercialmente (Supelco™ Analytical, Múnich, Alemania) y con datos de la literatura.
Cristalización urinaria de oxalato de calcio, análisis de absorbancia y medición microscópicaLa precipitación de CaOx se indujo añadiendo 40μl de oxalato de sodio 0,1M por mL de orina sintética (recién preparada según la descripción detallada proporcionada en Ghale-Salimi et al.11) a una temperatura de 37°C y un pH ajustado a 6,0. Se indujeron precipitaciones de CaOx en muestras de vehículo (agua destilada; grupo de control negativo), en el grupo de control positivo (citrato de potasio 10mg/mL) y en presencia de GM o AG en diferentes concentraciones (0,003, 0,01 y 0,03mg/mL). La morfología de los cristales se clasificó como monohidrato o dihidrato. Después de 60min, se registró la absorbancia de cada muestra a 620nm utilizando un espectrofotómetro (SPECTROstar Nano, BMG Labtech, São Paulo, Brasil), y se evaluó el número de cristales totales y diferenciados en cada grupo en 4 campos seleccionados al azar utilizando una cámara de Neubauer con el aumento ×400 usando un microscopio Olympus® CBA (Microscope, Tokyo, Japón). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.
Análisis estadísticoLos resultados se expresaron como media±error estándar de la media y se realizó un análisis de varianza de una vía seguido de la prueba de comparaciones múltiples de Dunnett utilizando GraphPad Prism versión 5.00 para Windows (GraphPad Software, La Jolla, CA, EE. UU.). Se consideró un nivel de p<0,05 como estadísticamente significativo.
Resultados y discusiónLos datos epidemiológicos han demostrado que el CaOx es el mineral predominante en la formación de cálculos renales. Estos cristales se forman en el túbulo distal, en el asa de la nefrona o en el túbulo colector, provocando dolor intenso y cólico renal. La mayoría de los cristales pasan desapercibidos en la orina. Sin embargo, en ocasiones los cristales se adhieren al epitelio tubular, con frecuencia en el sistema colector, y forman cristales semilla que conducen al desarrollo de cálculos2. Si se puede evitar la formación de cristales en la orina, se puede prevenir la urolitiasis. Algunos fitoconstituyentes de las plantas medicinales, como los compuestos fenólicos, han demostrado su eficacia en la prevención de la urolitiasis. Su potencial está relacionado con la actividad diurética, antiespasmódica y antioxidante, así como con la inhibición de la cristalización, la nucleación y la agregación de los cristales12.
En el presente estudio, el AG (fig. 1 a y c) inhibió la formación de cristales de CaOx total en las 3 concentraciones probadas, con porcentajes de inhibición del 57,91% a 0,003mg/mL (8,20±0,64×106/mL), del 44,61% a 0,01mg/mL (10,79±0,71×106/mL) y del 50,72% a 0,03mg/mL (9,6±0,34×106/mL), frente a las muestras tratadas solo con vehículo (19,48±2,17×106/mL). A pesar de que el AG es uno de los compuestos fenólicos más comunes y estudiados, hasta donde sabemos, esta es la primera descripción de su capacidad antiurolitiásica. Corroborando los resultados del presente estudio, Queiroz et al.13 conjugaron el quitosano ?conocido por inducir la formación de cálculos renales? con el AG en un intento de modular la acción del quitosano, y esta conjugación resultó en la disminución de la formación de cristales de CaOx.
También se probó el GM, otro compuesto fenólico ampliamente distribuido, que es el éster metílico del AG. El GM presentó capacidad antiurolitiásica en la formación total de cristales de CaOx a 2 concentraciones diferentes (fig. 1b y c), 0,01 y 0,03mg/mL, con un 48,35% (10,06±0,73×106/mL) y un 46,81% (10,36±0,54×106/mL) de inhibición, respectivamente, en comparación con las muestras tratadas con vehículo (19,48±2,17×106/mL). Algunos informes recientes en la literatura demuestran la inhibición de la formación de cristales de CaOx por bioactivos de origen natural, como el taraxasterol11 y el resveratrol10. Es relevante destacar que tanto el AG como el GM presentaron una gran propiedad antiurolitiásica a concentraciones muy bajas, lo que demostró su prometedor potencial en la prevención de la formación de cristales de CaOx.
Los cristales de CaOx existen en condiciones fisiológicas como 2 polimorfos cristalinos diferentes, el CaOx monoclínico monohidrato y el CaOx tetragonal dihidrato14. En nuestro estudio, los resultados microscópicos revelaron que el oxalato de sodio añadido a la orina sintética producía cristales de CaOx monohidrato, así como dihidrato (fig. 2 a-d), lo cual es interesante, ya que la combinación de ambos polimorfos se produce en más del 60% de los casos en la práctica clínica1.
Efectos del ácido gálico y del galato de metilo en el número de cristales de CaOx monohidrato (a y b) y dihidrato (c y d) y en la absorbancia en orina sintética (e y f). Los resultados se expresan como media±error estándar de la media. *p<0,05 frente al grupo VEH (vehículo). KC: citrato de potasio a 10mg/mL.
Se encontró que el AG a 0,003mg/mL (8,01±1,25×106/mL) y 0,03mg/mL (7,79±0,54×106/mL), así como el GM a 0,01mg/mL (9,22±0,90×106/mL) y 0,03mg/mL (9,52±0,71×106/mL) disminuyeron la formación de cristales CaOx monohidrato en el 57,40, 58,56, 50,95 y 49,36%, en comparación con el vehículo (fig. 2a y b; 18,80±2,62×106/mL), respectivamente (fig. 2a y b). Estos hallazgos son relevantes debido a que los cálculos monohidrato son la forma más estable y se considera el cristal de CaOx más dañino. Se detecta con mayor frecuencia en los cálculos clínicos y tiene una mayor afinidad por las células tubulares renales, por lo que es el principal responsable de la formación de cálculos en el riñón13. Además, son más difíciles de desintegrar mediante litotricia percutánea y extracorpórea que los cristales de CaOx dihidrato14. Por otra parte, aunque los resultados del análisis de los cristales de CaOx dihidrato apuntan a un crecimiento al alza en la formación de estos cristales, estos no fueron estadísticamente significativos en comparación con los valores obtenidos en la muestra de control (fig. 2c y d).
Además, los resultados mostraron que el AG y el GM disminuyeron la absorbancia (fig. 2e y f) en la muestra de orina en comparación con el grupo de control tratado con vehículo después de 60min. El AG (0,003mg/mL) disminuyó la absorbancia en un 45,83%, mientras que el GM (0,03mg/mL) lo hizo en un 48,55%. Estos hallazgos son interesantes, ya que el análisis in vitro del perfil de formación de cristales corresponde a las fases de agregación y precipitación cristalina13.
ConclusiónEste estudio muestra, por primera vez, el efecto antiurolitiásico in vitro de 2 conocidos compuestos fenólicos, ampliamente encontrados en la naturaleza: el AG y el GM. Ambos compuestos inhibieron la formación de cristales de CaOx total y monohidrato y pudieron disminuir la absorbancia en comparación con el grupo de control negativo. Por lo tanto, el uso de AG y GM en la dieta, o de productos naturales que los contengan, podrían ser una alternativa interesante como estrategias complementarias en relación con la enfermedad de cálculos renales.
FinanciaciónEste estudio contó con el apoyo financiero de la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Código Financiero 001) y de la Universidade do Vale do Itajaí.
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
