Artículo original
Fragmentación del ADN espermático empleando el método de TUNEL
Fragmentation of sperm DNA using the TUNEL method
P.H. Chenlo, S.M. Curi, M.N. Pugliese, J.I. Ariagno, M. Sardi-Segovia, M.J. Furlan, H.E. Repetto, E. Zeitler, M. Cohen, G.R. Mendeluk
Autor para correspondencia
Departamento de Bioquímica Clínica, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Universidad de Buenos Aires, Hospital de Clínicas José de San Martín, Buenos Aires, Argentina
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La colina es introducida en la célula a través de transportadores específicos, y una vez en su interior es fosforilada por la enzima colina-cinasa para dar lugar a la fosfocolina. Este es el primer paso de los 3 que componen la cascada enzimática conocida como vía de Kennedy, cuyo producto final es la fosfatidilcolina o lecitina. La fosfatidilcolina —principal fosfolípido de membrana— es sintetizada en 2 pasos mediante una reacción catalizada por la fosfocolina citidiltransferasa y a través de la fosfocolina transferasa.</p>" ] ] ] "autores" => array:1 [ 0 => array:2 [ "autoresLista" => "M.M. Navarro-Pelayo Láinez, A. Rodríguez-Fernández, M. Gómez-Río, F. Vázquez-Alonso, J.M. Cózar-Olmo, J.M. Llamas-Elvira" "autores" => array:6 [ 0 => array:2 [ "nombre" => "M.M." "apellidos" => "Navarro-Pelayo Láinez" ] 1 => array:2 [ "nombre" => "A." "apellidos" => "Rodríguez-Fernández" ] 2 => array:2 [ "nombre" => "M." "apellidos" => "Gómez-Río" ] 3 => array:2 [ "nombre" => "F." 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Hasta el momento los 3 pilares diagnósticos lo constituyen la movilidad, la morfología y el recuento espermático, sin embargo la bibliografía refiere un bajo poder predictivo para estas pruebas, especialmente para los procedimientos de fertilización asistida de alta complejidad<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0005"><span class="elsevierStyleSup">1,2</span></a>. Surgieron así nuevos ensayos tendientes a explorar el estado del material genético a transferir, resultando los que determinan la integridad del ADN espermático los más difundidos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0015"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a>. Estas pruebas pueden llevarse a cabo a través de diferentes metodologías tales como el ensayo de la estructura de la cromatina espermática (SCSA)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0020"><span class="elsevierStyleSup">4</span></a>, la dispersión de la cromatina (SCD)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0025"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a>, la electroforesis en gel (COMET)<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0030"><span class="elsevierStyleSup">6,7</span></a> y el ensayo de marcación del extremo terminal con dUTP por medio de la deoxinucleotidil transferasa (TUNEL)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0040"><span class="elsevierStyleSup">8</span></a>. Los 2 primeros resultan medidas indirectas del estado de fragmentación del ADN, mientras que los 2 últimos permiten identificar el daño real. En nuestra experiencia la prueba de TUNEL, tanto por citometría de flujo como por microscopía de fluorescencia, pudo ser validada con adecuados parámetros analíticos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0045"><span class="elsevierStyleSup">9</span></a>, lo que nos permitió poder transferirla a la práctica clínica. Para definir una prueba diagnóstica como adecuada es necesario considerar su validez, que se expresa por su sensibilidad, especificidad y valores predictivos. La validez clínica del estudio de TUNEL ha sido recientemente cuestionada en lo que respecta a su capacidad de predecir el éxito de embarazo, tanto para fertilización natural como por procedimientos instrumentales<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0050"><span class="elsevierStyleSup">10</span></a>. Por otro lado, la literatura resulta contradictoria cuando se intenta correlacionar el test de TUNEL con los parámetros seminales clásicos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0055"><span class="elsevierStyleSup">11,12</span></a>. Otro tema en discusión en nuestra práctica clínica es si la prueba de TUNEL debe realizarse en la muestra eyaculada o después de los procedimientos que se realizan en el laboratorio, tales como las técnicas de enriquecimiento, para poner así de manifiesto el verdadero estado del gameto a emplear en caso de decidirse una fertilización asistida.</p><p id="par0010" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Es objeto de este trabajo establecer la validez de la prueba de TUNEL en la determinación de la fragmentación del ADN espermático como diagnóstico de capacidad reproductiva, determinar la relación entre el grado de fragmentación del ADN espermático y los parámetros seminales: movilidad, morfología, recuento y vitalidad, y establecer sobre qué tipo de muestra efectuar la prueba para obtener mejor información sobre el estado del ADN de los espermatozoides que se verán involucrados en el proceso de fertilización.</p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0070">Material y métodos</span><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las muestras fueron recolectadas por masturbación después de una abstinencia sexual de 3 a 5 días. Luego de la licuefacción (30-60<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min), se efectuó el análisis básico del semen según normativas OMS 2010. Para movilidad y recuento espermático se empleó un sistema CASA (SCA Microptic, España), validado previamente por nuestro grupo<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0065"><span class="elsevierStyleSup">13</span></a>.</p><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para establecer la validez diagnóstica se determinó la fragmentación del ADN espermático por la prueba de TUNEL/ioduro de propidio por citometría de flujo<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0070"><span class="elsevierStyleSup">14–16</span></a> en 40 muestras de semen, las cuales correspondían a 20 donantes sanos con fertilidad probada por nacimiento en los últimos 12 meses con edades comprendidas entre 20 y 45 años y 20 pacientes atendidos en la división Ginecología, Área de Infertilidad Matrimonial del Hospital de Clínicas José de San Martín, que habían fracasado en procedimientos de inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI) con mujeres menores de 35 años que aportaron ovocitos saludables.</p><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para establecer cuál será el material a emplear en el test, que pueda dar mayor información sobre el estado del ADN implicado en el proceso de fertilización, se efectuó la selección espermática mediante la técnica de <span class="elsevierStyleItalic">swim up</span>, utilizando HAM F-10 (Gibco) con suplemento sérico (Irvine Scientific), en 110 muestras correspondientes a hombres fértiles (n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>33) y pacientes que consultaban por infertilidad (n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>77). La prueba de TUNEL se evaluó en la muestra de semen basal y en los espermatozoides seleccionados post <span class="elsevierStyleItalic">swim up</span>. Se halló la relación entre el grado de fragmentación del ADN espermático y los parámetros seminales, movilidad, morfología, vitalidad y recuento espermático en ambos tipos de muestras.</p><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para realizar la prueba de TUNEL los espermatozoides de la muestra de semen y los de la muestra post selección fueron lavados con <span class="elsevierStyleItalic">buffer</span> fosfato salino ([PBS] pH 7,2) suplementado con albúmina 0,3% y ajustados a una concentración de 20 millones/ml; 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>μl de cada muestra fue fijada con 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>μl de paraformaldehído al 4% en PBS (pH 7,4) por 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a temperatura ambiente. Eliminado el fijador, se lavó 2 veces con PBS-albúmina, y se permeabilizó con 0,1% de Triton <span class="elsevierStyleSmallCaps">X</span>-100 (Sigma) en citrato de sodio 0,1%, durante 2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min en baño de hielo y posteriormente se lavó 2 veces con PBS. Antes de la incubación con la solución de TUNEL, una muestra adicional fue incubada durante 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C con 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>μl (8<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>U/μl) de DNasa I recombinante (Roche; 10.000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>U). Todas las muestras, incluido el control positivo, fueron incubadas en oscuridad durante 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C, con 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>μl de solución reactiva de TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein-Roche) constituida por una solución de desoxi uridín trifosfato (dUTP) marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) más la enzima terminal deoxinucleotidil transferasa (TdT) que permite la unión específica de uracilo al extremo -OH 3¿ terminal de un fragmento de ADN. Como controles negativos se emplearon muestras incubadas solo con la solución de marcado (fluorescein-dUTP) sin el agregado de la enzima. Concluida la marcación cada muestra se lavó 2 veces con PBS para eliminar la solución no unida, se resuspendió en un volumen final de 400<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>μl y se añadió 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>μl de ioduro de propidio al 0,1% en PBS para eliminar del análisis los eventos sin ADN. Las muestras fueron leídas en un citómetro de flujo Facscalibur y 10.000 eventos por muestra fueron analizados. Los resultados fueron obtenidos mediante el programa Winmdi. En el caso de muestras oligozoospérmicas severas o con recuperaciones muy bajas, las suspensiones fueron concentradas por centrifugación y las lecturas fueron hechas mediante microscopia de fluorescencia (Olympus CX31), evaluando al menos 100 espermatozoides por duplicado por 2 operadores diferentes.</p><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los participantes recibieron una hoja informativa y firmaron el consentimiento que cuenta con el aval del comité de ética del hospital, no existiendo conflicto de intereses en el presente estudio.</p><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0075">Métodos estadísticos</span><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se determinó el área bajo la curva característica operativa del receptor (ROC) y se calculó el valor de corte, su sensibilidad y especificidad a partir de los resultados de la prueba en individuos fértiles e infértiles. Para las comparaciones entre los resultados pre y post <span class="elsevierStyleItalic">swim up</span> se empleó el test de Wilcoxon para muestras apareadas, y el test Mann-Whitney (muestras independientes) para establecer diferencias entre los grupos de pacientes. Se estimó la correlación lineal entre los parámetros seminales y los resultados de TUNEL con el programa el MedCalc versión 9.5.0.0 (MedCalc Software, Mariakerke, Bélgica). En todos los casos se consideró como significativo un α<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,05.</p></span></span><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0080">Resultados</span><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El análisis de los resultados obtenidos de la curva ROC (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig. 1</a>) llevada a cabo con el grupo de individuos fértiles e infértiles permitió estimar un valor de corte de 26% para la prueba de TUNEL, con sensibilidad de 85% y especificidad de 89%. El área bajo la curva fue de 0,917 (error estándar 0,0461) p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,001.</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El estudio de las medianas e intercuartiles de los resultados de TUNEL pre y post <span class="elsevierStyleItalic">swim up</span> en las 110 muestras no mostró diferencia significativa (mediana pre: 17,0% [8,0-24,0]; mediana post: 12,9% [5,7-23,0] p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,2122). Sin embargo, en 43 muestras (39,1%) se observó una diferencia superior a 15 en valor absoluto entre los resultados del TUNEL basal y post <span class="elsevierStyleItalic">swim up</span>, lo que se consideró relevante. En 18 casos (16,4%) se incrementó la fragmentación del ADN, de los cuales 2 ya tenían un TUNEL basal elevado pero 16 (14,5%) eran muestras sin daño en el ADN que después del procedimiento de selección se incrementó su valor superando el de corte. En 25 casos (22,7%) se observó disminución de la fragmentación del ADN, de los cuales 15 (13,6%) presentaban un valor basal patológico que el procedimiento de selección mejoró. En las muestras correspondientes a hombres con fertilidad probada se obtuvo mejora significativa en el estado del ADN posterior al tratamiento de selección (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a>).</p><elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El estudio de correlación lineal de la morfología, movilidad progresiva, recuento y vitalidad mostró reducida significación estadística con la prueba de TUNEL en las muestras basales (r: –0,2204, p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,0239; r: –0,2679, p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,0047; r: –0,031 p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,7561; r: –0,2838, p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,0027), sin embargo cuando estos mismos parámetros del semen se estudiaron en relación con el TUNEL post <span class="elsevierStyleItalic">swim up</span> se obtuvo incremento en la correlación con resultados altamente significativos (r: –0,394, p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,0001; r: –0,461, p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,0001; r: –0,323 p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,0006; r: –0,526, p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,0001).</p></span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0085">Discusión</span><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El test de TUNEL, mediante la incorporación enzimática de un uracilo marcado al extremo-OH 3¿ terminal de un fragmento de ADN, mide en forma directa el daño, a diferencia de otros test empleados en los estudios de la cromatina espermática. Por otro lado, el empleo de la citometría de flujo permite evaluar más de 10.000 eventos por muestra, objetivar el estudio y documentar los resultados. La prueba fue validada en el laboratorio para la práctica clínica, empleando muestras de semen de varones sanos con fertilidad natural en el último año y de varones con fracaso en ICSI cuyas parejas carecían de factor femenino en infertilidad. Se estableció un valor de corte de 26%, con sensibilidad y especificidad de 85 y 89% respectivamente. Estos datos son similares a los reportados por otros autores<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0085"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a>. Los resultados de TUNEL de 77 pacientes que consultaron por fertilidad en nuestro hospital en el período 2012-2013, a quienes se les había solicitado el estudio, presentaron un rango que iba de 0,6 a 71,2%, siendo tan amplio como el de los parámetros clásicos del semen. Estos resultados muestran qué porcentaje de espermatozoides presentan fragmentación del ADN en la muestra de semen original, pero no indican el grado de fragmentación de los espermatozoides que se verán involucrados en el proceso de la fertilización asistida, en caso de que se decida realizarla. Una de las técnicas de preparación de semen para procedimientos de fertilidad asistida es la prueba de sobrenado o <span class="elsevierStyleItalic">swim up</span>, mediante la cual separamos los espermatozoides móviles del resto del semen, es decir, de las otras células, de los espermatozoides inmóviles, necrosados y del plasma seminal con su contenido de antioxidantes. La técnica involucra además una centrifugación posterior para concentrar el material a inseminar, que se sabe que puede provocar estrés oxidativo. Cuando el test de TUNEL fue efectuado sobre este material se obtuvo un rango muy amplio en los resultados nuevamente, que iba de 1,0 a 89,0%. La mediana del TUNEL en la muestra basal y post <span class="elsevierStyleItalic">swim up</span> no mostró diferencia significativa, sin embargo no todas las muestras se comportaron de la misma manera. En el 39% de los casos estudiados se halló una diferencia entre ambos resultados, ya sea en exceso o en defecto, superior a 15. El incremento de la fragmentación del ADN posterior a la prueba de selección en nuestra experiencia fue en el 14,5% de las muestras de los varones estudiados, y pondría en evidencia una mayor susceptibilidad de sus espermatozoides al procedimiento <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span>. Esta respuesta ha motivado la puesta en duda del valor diagnóstico de la prueba llevada a cabo en la muestra basal, especialmente en pacientes que recurren a técnicas de fertilización asistida que inevitablemente deberán atravesar por estos procedimientos. Las muestras en las cuales se observó un incremento importante en la fragmentación del ADN fueron confirmadas con una segunda muestra, lo que no podemos afirmar es que este mismo comportamiento ocurra con otras técnicas de selección u otros medios de cultivo<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0090"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a>. La disminución de la prueba de TUNEL posterior a la selección, especialmente en aquellas muestras con valor inicial patológico, puede atribuirse a muestras con elevada población de espermatozoides necrosados que incrementan el porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado de la muestra basal, pero que después de la selección no estarán presentes ni tampoco estarán involucrados en el proceso de fertilización. En nuestra experiencia esto ocurrió en el 13,6% de los varones estudiados.</p><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las correlaciones entre el daño en el ADN espermático y los parámetros clásicos del espermograma ha sido tema de estudio de numerosos autores<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0055"><span class="elsevierStyleSup">11,12</span></a>. Todos reportan alta significación, pero con coeficientes de correlación (r) variados, probablemente porque no hay consenso sobre en qué muestra fue efectuado el estudio, ni tampoco acerca de la metodología empleada para evaluarlo. Por otro lado, cabe aclarar que una correlación puede ser significativa estadísticamente, y no por ello tener relevancia clínica. Que el «r» sea estadísticamente significativo quiere decir que los datos se ajustan a un modelo lineal, de modo que la pendiente de la recta es diferente de 0, pero no dice cuán distinta de 0 es, aunque el p sea<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,0001. La relevancia clínica de la relación está dada por el coeficiente de determinación (R<span class="elsevierStyleSup">2</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>×<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>100), que nos indica qué porcentaje de la variación de la variable dependiente es explicado por la variable independiente. Habitualmente se considera clínicamente importante un R<span class="elsevierStyleSup">2</span> de al menos 0,5 (r<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,7), ya que <span class="elsevierStyleSmallCaps">X</span> explicaría aproximadamente el 50% de la variación de Y. En nuestro estudio hallamos correlación lineal altamente significativa (p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,0001) de la morfología, movilidad progresiva, recuento y vitalidad del semen con los resultados de TUNEL post selección espermática, con coeficientes de correlación negativos, semejantes a los reportados por Borini et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0095"><span class="elsevierStyleSup">19</span></a>, pero sin alta relevancia clínica. Podemos concluir que la fragmentación del ADN es un factor independiente de las pruebas tradicionales del semen<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0100"><span class="elsevierStyleSup">20</span></a>. No obstante, podemos hablar de una susceptibilidad al daño posterior al tratamiento que se realiza en el laboratorio, como es la preparación de la muestra de semen para técnicas de fertilidad asistida, que podría ser parcialmente predecible por la pobre calidad del semen.</p><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Finalmente concluímos que el TUNEL es una prueba válida para su empleo en la clínica, que la fragmentación del ADN es un factor independiente de las pruebas tradicionales del semen, y en lo que respecta a la muestra de elección para evaluar el estado del ADN espermático consideramos que los resultados obtenidos en la muestra basal y post <span class="elsevierStyleItalic">swim up</span> son de interés, ya que ayudan a caracterizar al paciente infértil.</p></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0090">Financiación</span><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Trabajo financiado por UBACYT CB 06.</p></span><span id="sec0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0095">Conflicto de intereses</span><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de intereses.</p></span></span>" "textoCompletoSecciones" => array:1 [ "secciones" => array:11 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "xres378950" "titulo" => array:5 [ 0 => "Resumen" 1 => "Objetivos" 2 => "Materiales y métodos" 3 => "Resultados" 4 => "Conclusiones" ] ] 1 => array:2 [ "identificador" => "xpalclavsec357789" "titulo" => "Palabras clave" ] 2 => array:2 [ "identificador" => "xres378949" "titulo" => array:5 [ 0 => "Abstract" 1 => "Objectives" 2 => "Material and methods" 3 => "Results" 4 => "Conclusions" ] ] 3 => array:2 [ "identificador" => "xpalclavsec357790" "titulo" => "Keywords" ] 4 => array:2 [ "identificador" => "sec0005" "titulo" => "Introducción" ] 5 => array:3 [ "identificador" => "sec0010" "titulo" => "Material y métodos" "secciones" => array:1 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "sec0015" "titulo" => "Métodos estadísticos" ] ] ] 6 => array:2 [ "identificador" => "sec0020" "titulo" => "Resultados" ] 7 => array:2 [ "identificador" => "sec0025" "titulo" => "Discusión" ] 8 => array:2 [ "identificador" => "sec0030" "titulo" => "Financiación" ] 9 => array:2 [ "identificador" => "sec0035" "titulo" => "Conflicto de intereses" ] 10 => array:1 [ "titulo" => "Bibliografía" ] ] ] "pdfFichero" => "main.pdf" "tienePdf" => true "fechaRecibido" => "2014-01-10" "fechaAceptado" => "2014-02-02" "PalabrasClave" => array:2 [ "es" => array:1 [ 0 => array:4 [ "clase" => "keyword" "titulo" => "Palabras clave" "identificador" => "xpalclavsec357789" "palabras" => array:6 [ 0 => "Fragmentación del núcleo espermático" 1 => "TUNEL" 2 => "Validez de la prueba" 3 => "Parámetros espermáticos" 4 => "<span class="elsevierStyleItalic">Swim up</span>" 5 => "Susceptibilidad al daño en el laboratorio" ] ] ] "en" => array:1 [ 0 => array:4 [ "clase" => "keyword" "titulo" => "Keywords" "identificador" => "xpalclavsec357790" "palabras" => array:6 [ 0 => "Sperm nucleus fragmentation" 1 => "TUNEL" 2 => "Test validity" 3 => "Sperm parameters" 4 => "Swim up" 5 => "Susceptibility to damage in the laboratory" ] ] ] ] "tieneResumen" => true "resumen" => array:2 [ "es" => array:2 [ "titulo" => "Resumen" "resumen" => "<span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0010">Objetivos</span><p id="spar0005" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">Establecer la validez del test de TUNEL en la determinación de la fragmentación del ADN espermático, la relación entre el grado de fragmentación con los parámetros seminales y la muestra a emplear para efectuar la prueba.</p> <span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0015">Materiales y métodos</span><p id="spar0010" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">Se emplearon muestras de semen de varones sanos fértiles (n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>33), pacientes que consultaron por infertilidad con prescripción de test de TUNEL (n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>77) y pacientes con fracaso en ICSI (n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>20), analizadas según OMS 2010. Se efectuó el test de TUNEL/ioduro de propidio por citometría de flujo, en muestras basales y post <span class="elsevierStyleItalic">swim up</span>.</p> <span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0020">Resultados</span><p id="spar0015" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">El valor de corte de TUNEL (curvas ROC) fue de 26% con sensibilidad y especificidad de 85 y 89% respectivamente. Las medianas de los resultados de TUNEL pre y post <span class="elsevierStyleItalic">swim up</span> no mostró diferencia significativa (17,0 vs. 12,9%). Sin embargo, el 39,1% expuso una diferencia superior a 15 en valor absoluto entre los resultados del TUNEL basal y post <span class="elsevierStyleItalic">swim up</span>. El estudio de correlación lineal de la morfología, movilidad y vitalidad con el TUNEL post <span class="elsevierStyleItalic">swim up</span> mostró una correlación mayor que el pre selección, con resultados significativos (r: –0,394, p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,0001; r: –0,461, p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,0001; r: –0,526, p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,0001).</p> <span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0025">Conclusiones</span><p id="spar0020" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">La prueba de TUNEL es una prueba válida para su empleo en la clínica. La fragmentación del ADN es un factor independiente de las pruebas tradicionales del semen. Hallamos mayor susceptibilidad al daño generado en los procedimientos de laboratorio en las muestras de peor calidad. La muestra de elección para evaluar la fragmentación del ADN dependerá de si se trata de una fertilización natural o asistida.</p>" ] "en" => array:2 [ "titulo" => "Abstract" "resumen" => "<span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0035">Objectives</span><p id="spar0025" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">To establish the validity of the TUNEL assay in determining sperm DNA fragmentation, the relationship between the degree of fragmentation and the seminal parameters and the sample needed to conduct the test.</p> <span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0040">Material and methods</span><p id="spar0030" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">We used semen samples from healthy fertile men (n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>33), patients who consulted for infertility with a prescription for the TUNEL assay (n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>77) and patients with intracytoplasmic sperm injection failure (n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>20), analyzed according to the 2010 WHO. The TUNEL/propidium iodide test was performed by flow cytometry, on baseline and post-swim-up samples.</p> <span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0045">Results</span><p id="spar0035" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">The cutoff value for the TUNEL assay (ROC curves) was 26%, with a sensitivity and specificity of 85% and 89%, respectively. The pre-swim-up and post-swim-up medians of the results from the TUNEL assay showed no significant differences (17.0% vs. 12.9%, respectively). However, 39.1% of the samples showed a difference greater than 15 in absolute value between the results of the baseline and post-swim-up TUNEL assays. The linear correlation study of the morphology, mobility and vitality using the post-swim-up TUNEL assay showed a greater correlation than preselection, with significant results (r: –0.394, <span class="elsevierStyleItalic">P</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>.0001; r: –0.461, <span class="elsevierStyleItalic">P</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>.0001; r: –0.526, <span class="elsevierStyleItalic">P</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>.0001).</p> <span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0050">Conclusions</span><p id="spar0040" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">The TUNEL assay is a valid test for clinical use. DNA fragmentation is a factor independent from traditional semen tests. We found a greater susceptibility to damage generated in the laboratory procedures in the samples with lower quality. The sample of choice for evaluating DNA fragmentation will depend on whether the clinician is treating a natural or assisted fertilization.</p>" ] ] "multimedia" => array:2 [ 0 => array:7 [ "identificador" => "fig0005" "etiqueta" => "Figura 1" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr1.jpeg" "Alto" => 1424 "Ancho" => 1382 "Tamanyo" => 97627 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "<p id="spar0045" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">Curva ROC de fragmentación del ADN espermático por prueba de TUNEL.</p>" ] ] 1 => array:7 [ "identificador" => "tbl0005" "etiqueta" => "Tabla 1" "tipo" => "MULTIMEDIATABLA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "tabla" => array:3 [ "leyenda" => "<p id="spar0055" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">Diferencias significativas (Mann-Whitney test, muestras independientes).</p>" "tablatextoimagen" => array:1 [ 0 => array:2 [ "tabla" => 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style="border-bottom: 2px solid black">Hombres infértiles con fracaso en ICSI (n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>=<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>24)</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-head\n \t\t\t\t " align="" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t" style="border-bottom: 2px solid black"> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-head\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t" style="border-bottom: 2px solid black">Mediana \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-head\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t" style="border-bottom: 2px solid black">Rangos intercuartílicos \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-head\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t" style="border-bottom: 2px solid black">Mediana \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-head\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t" style="border-bottom: 2px solid black">Rangos intercuartílicos \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-head\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t" style="border-bottom: 2px solid black">Mediana \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-head\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t" style="border-bottom: 2px solid black">Rangos intercuartílicos \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Edad \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">28 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">25,00-34,00 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">38 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">33,75-41,00 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">40 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">35,00-43,50 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Ez/ey (E 10<span class="elsevierStyleSup">6</span>) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">172,85 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">96,955-301,680 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">127,71 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">69,145-250,390 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">- \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">- \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Ez/ml (E 10<span class="elsevierStyleSup">6</span>) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">59,80 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">33,450-105,950 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">52,30 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">31,750-99,000 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">17,5<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0015"><span class="elsevierStyleSup">c</span></a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">2,070-96,750 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Móviles totales (%) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">48,10 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">39,100-60,900 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">42,50 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">30,000-51,900 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">26<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020"><span class="elsevierStyleSup">d</span></a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">17,500-42,000 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Móviles progresivos (%) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">45,00 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">34,450-51,550 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">33,10 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">22,475-43,400 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">- \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">- \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Vivos \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">90,00 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">80,000-95,000 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">82,00 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">71,500-90,000 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">- \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">- \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Morfología (%) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">16,50 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">8,000-22,500 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">9,00<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0010"><span class="elsevierStyleSup">b</span></a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">4,250-14,750 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">3,00<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0025"><span class="elsevierStyleSup">e</span></a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">2,000-9,500 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">TUNEL (%) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">17,35 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">9,600-24,000 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">16,00 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">7,750-24,750 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">32,00<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0030"><span class="elsevierStyleSup">f</span></a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">24,250-36,750 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">TUNEL post <span class="elsevierStyleItalic">swim up</span> (%) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">7,55<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005"><span class="elsevierStyleSup">a</span></a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">4,000-12,900 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">15,00 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">6,750-28,000 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">- \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="char" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">- \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr></tbody></table> """ ] "imagenFichero" => array:1 [ 0 => "xTab576550.png" ] ] ] "notaPie" => array:6 [ 0 => array:3 [ "identificador" => "tblfn0005" "etiqueta" => "a" "nota" => 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