Los pigmentos carotenoides poseen propiedades antioxidantes y beneficiosas para la salud de los seres humanos. Se ha sugerido la utilización de la espectroscopia de resonancia Raman (ERR) como un método fiable para su medición en tejidos como la dermis. No obstante, antes de poder utilizar esta técnica, es preciso recolectar datos sobre su variabilidad y reproducibilidad.
ObjetivoEvaluar la reproducibilidad de la técnica de ERR, para la detección de las concentraciones totales de β-carotenos en piel en adultos colombianos.
DiseñoUn total de 48 hombres y 30 mujeres saludables con diversos niveles de pigmentación fueron incluidos en el estudio. Se realizaron mediciones por ERR en región palmar, cara interna y externa de los brazos. Se calculó la odds ratio e intervalos de confianza del 95% ajustando por factores de confusión: índice de masa corporal, circunferencia de cintura, porcentaje de grasa corporal, edad, etnia, hábito de tabaquismo y sexo. La reproducibilidad de la técnica se estimó mediante el coeficiente de correlación intraclase (CCI).
ResultadosEl promedio de β-carotenos en hombres fue de 29,9±11,9 frente a 30,6±8,6 en mujeres (p=0,787). No se encontraron diferencias ni asociaciones significativas en los niveles de β-carotenos por los factores de confusión evaluados por sexo. Los CCI fueron: 0,89 en región palmar; 0,85 en cara interna de brazos, y 0,82 en cara externa de brazos.
ConclusiónLa EER constituye un método fiable para la medición no invasiva de las concentraciones de β-carotenos en piel y puede ser utilizado como un importante biomarcador del estatus antioxidante en estudios nutricionales y de salud en población humana.
Carotenoid pigments have antioxidant properties beneficial for human health. Use of resonance Raman spectroscopy (RRS) as a reliable method for measuring carotenoid levels in tissues such as dermis has been suggested. However, data about the variability and reproducibility of this technique should be collected before it can be used.
ObjectiveTo assess reproducibility of RRS for detection of total β-carotene levels in the skin of Colombian adults.
DesignForty-eight healthy men and 30 healthy women with various pigmentation levels were enrolled into the study. Measurements by RRS were performed in the palmar region and medial and lateral aspects of the arms. Odds ratio and 95% confidence intervals were calculated, adjusting for confounding factors: body mass index, waist circumference, percent body fat, age, race, smoking, and sex. Reproducibility of the technique was estimated using intraclass correlation coefficient (ICC).
ResultsMean β-carotene levels were 29.9±11.9 in men and 30.6±8.6 in women (P=.787). No differences or significant associations were found of β-carotene levels with confounding factors assessed by sex. ICCs were 0.89 in the palmar region, 0.85 in the medial aspect of arm, and 0.82 in the external aspect of arm.
ConclusionRRS spectroscopy is a reliable method for non-invasive measurement of β-carotene levels in skin, and may be used as an important biomarker of antioxidant status in nutritional and health studies in humans.
Los carotenoides son moléculas antioxidantes provenientes de pigmentos vegetales que se encuentran originalmente en plantas, animales y bacterias, muchas veces muy oxigenados o como cromoproteínas, siendo la parte prostética de estas1. Los más frecuentemente consumidos en dietas occidentales son el α-caroteno, el β-caroteno, el licopeno, la luteína, la zeaxantina y la β-criptoxantina2,3. Autores como Krinsky et al.4, Liu et al.5 y Mayne et al.6 mostraron que la ingesta de dietas ricas en carotenoides se asociaba inversamente con el riesgo de padecer enfermedades crónicas, especialmente algunos tipos de cáncer, enfermedad cardiovascular y síndrome metabólico.
No obstante, varios autores ponen en discusión la validez de las encuestas dietéticas como indicador de la ingesta alimentaria para determinar objetivamente el consumo de este importante biomarcador antioxidante5–7. En clínica e investigación, los carotenoides comunes se pueden medir por métodos bioquímicos en sangre u otros tejidos, después de su extracción, y se sabe que las concentraciones se correlacionan con la ingesta en la dieta5.
Hasta la fecha, los estudios de consumo de frutas y vegetales se han basado en la determinación de los carotenoides en tejidos mediante el uso de HPLC (High-performance liquid chromatography). Esta técnica es la de referencia (gold standard), pero tiene destacadas desventajas como su elevado coste, y algunos aspectos metodológicos como la extracción, el almacenamiento, el procesamiento y el análisis de la muestra, entre muchas otras8. Otra desventaja es la fluctuación en la concentración de carotenoides en los diferentes tejidos en respuesta a ingestas recientes, especialmente con el consumo de β-caroteno y licopeno9.
La espectroscopia de resonancia Raman (ERR) es una técnica espectroscópica utilizada en física de la materia condensada y también en química para el estudio de los modos vibracionales, rotacionales y otros de baja frecuencia en un sistema. Esta técnica se basa en la dispersión inelástica, o dispersión Raman, de la luz monocromática, que por lo general procede de un láser. Los carotenoides son moléculas bien adaptadas a la dispersión de la luz por la ERR, ya que todas tienen una fuerte columna de absorción en las cadenas de carbono conjugada (C=C). Asimismo en los sistemas biológicos, la intensidad de la ERR se relaciona linealmente con la concentración de carotenoides.
Los trabajos de Ermakov et al.10,11 han mostrado la utilidad y validez de la ERR para la medición no invasiva de los carotenoides en tejidos como la piel. El estudio de Mayne et al.6 en 28 sujetos sanos mostró que los niveles dérmicos de carotenoides totales, determinados por ERR, se correlacionaban significativamente con las concentraciones de carotenoides totales determinados por HPLC en biopsias de piel (r=0,66; p=0,0001). Otros autores han mostrado que los niveles de β-carotenos en piel se correlacionan con la ingesta de la dieta y sus concentraciones en plasma12–14.
Recientemente, las concentraciones consideradas como protectoras del β-caroteno han estimulado la investigación científica en el contexto de prevención primaria por la participación de esta molécula en el mantenimiento del estatus antioxidante, un importante mecanismo de defensa, por lo que su estimación fiable, rápida y no invasiva proporcionaría información del estado de salud del individuo15. El propósito de este estudio fue evaluar la reproducibilidad de la técnica por ERR para la detección de las concentraciones totales de β-carotenos en piel de adultos colombianos.
Material y métodosDurante el primer semestre del 2011 se realizó un estudio descriptivo, transversal, en 78 sujetos saludables (n=48 hombres; n=30 mujeres), entre los 18 y los 65 años de edad, procedentes del área nororiental y metropolitana de la ciudad de Cali en Colombia. La selección de la muestra se llevó a cabo mediante convocatoria voluntaria y muestreo por intención, y se excluyeron participantes con diagnostico médico o clínico de enfermedad sistémica mayor (incluidos procesos malignos como cáncer), diabetes mellitus tipo 1 o 2, hipertensión arterial, hipo/hipertiroidismo, antecedentes de historia de abuso de drogas o alcohol, consumo de preparados multivitamínicos y procesos inflamatorios (traumatismos, contusiones) o infecciosos. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de cada participante y el Comité Ético del centro académico aprobó el estudio, siguiendo las normas deontológicas reconocidas por la Declaración de Helsinki y la normativa legal vigente colombiana que regula la investigación en seres humanos (Resolución 008430 del Ministerio de Salud de Colombia). Los participantes que aceptaron y firmaron el consentimiento informado fueron citados en ayunas en el Laboratorio del Centro para la Investigación en Salud y Rendimiento Humano y en el Centro de Convenciones Alférez Real, para los siguientes procedimientos.
Medición de β-carotenos mediante espectroscopia de resonancia RamanInicialmente se evaluó el estado cutáneo en la palma de la mano, la parte interna y la parte externa del antebrazo. Se sabe que los carotenoides se concentran en la palma de la mano, de tal modo que este lugar era la elección más obvia para las mediciones. Los demás lugares de medición fueron seleccionados por conveniencia para el estudio de reproducibilidad de la tecnica.
Los participantes fueron citados a primera hora de la mañana en ayunas. Los detalles para la medición de β-carotenos en tejidos humanos in vivo mediante la técnica ERR ha sido descirta en detalle en otros trabajos11–15. En síntesis, el instrumento consta de una cámara y varias líneas láser de argón para producir luz UV azul a 488nm (fig. 1A). La respuesta óptica de la piel se conoce como dispersión de Rayleigh, y corresponde a la morfología rígida y externa del tejido dérmico (estrato córneo). La intensidad de fluorescencia de los dobles enlaces carbono-carbono (C=C), se conocen como intensidad Raman, generada a partir del cambio de frecuencia a 1.524cm-1, siendo proporcional a la cantidad de carotenoides cutáneos totales (figs. 1 B y C). Esta técnica utiliza un láser de potencia <10mW y un tiempo de exposición de 15s, con un tamaño de punto elíptico de 2mm por 3mm14,15 (Pharmanex® BioPhotonic Scanner, EE. UU.). Todas las medidas se tomaron por triplicado, y se utilizó el promedio para el análisis de los datos.
A. Representación esquemática de un equipo para espectroscopia de resonancia Raman. 1: láser de argón; 2,4: fibras ópticas; 3: sistema de adquisición de imagen óptica; 5: espectrógrafo; 6: cámara; 7: computador. B. Ejemplo del espectro de absorción de 2 tipos de carotenoides: β-carotenos (línea continua) y licopeno (línea discontinua) en solución de etanol. C. Espectro típico de Raman de β-carotenos obtenidos a partir de lecturas en dermis humana in vivo a 514,5-nm mediante láser de argón. D. Histograma de distribución de señales por espectroscopia resonante Raman.
De cada participante se obtuvieron los siguientes datos: antecedentes familiares de riesgo cardiovascular; encuesta de antecedentes personales, recordatorio nutricional de 24h, y valoración antropométrica, que comprendió estatura, peso y circunferencia de cintura, mediante técnicas estandarizadas por López et al.16. La talla se registró con un antropómetro Krammer (Holtain Ltd., Crymych Dyfed, Reino Unido) de 4 segmentos y 1mm de precisión. El peso se midió con balanzas de piso (Health-o-Meter, Continental Scale Corp., Bridgeview, III, EE. UU.) con 500g de precisión, calibradas con pesos conocidos. Con estas variables se calculó el índice de masa corporal (IMC) en kg/m2. La circunferencia de cintura se midió en el punto medio entre las crestas ilíacas y el borde costal inferior con una cinta métrica plástica con una precisión de 0,5cm (Holtain Ltd., Crymych Dyfed, Reino Unido). Adicionalmente, a cada participante se le pidió que identificará la raza, y bajo la guía del asistente de investigación el color de piel (parte interna del brazo). Las citadas dimensiones se tomaron con dispositivos homologados y de acuerdo con las normas del programa biológico internacional, elaborado por el Internacional Council of Scientific Unions que recoge los procedimientos esenciales para el estudio biológico de las poblaciones humanas17.
Análisis estadísticoSe utilizó estadística descriptiva para estimar la distribución de las puntuaciones de la ERR en la población de estudio y los diferentes subgrupos. Mediante el test de Kolmogorov-Smirnov se aceptó la hipótesis de distribución normal para las variables estudiadas (fig. 1 D). Las diferencias en las variables binarias fueron estudiadas mediante la prueba de la t de Student, mientras que para las variables múltiples fue usado el test ANOVA unilateral. El coeficiente de correlación intra-clase (CCI) fue utilizado para evaluar la reproducibilidad de las medidas en el tiempo y en los 3 sitios escogidos para su determinación. Se calcularon odds ratio (OR) e intervalos de confianza del 95% (IC95%) ajustados por los factores de confusión: IMC, circunferencia de cintura, etnia, hábito tabáquico y sexo. Un análisis de regresión logística multivariado fue usado para evaluar las asociaciones entre la ingesta dietética mediante el cuestionario de recordatorio de 24h y las concentraciones dérmicas de β-carotenos por EER. Todas las pruebas se realizaron con el paquete estadístico SPSS 15.0 para Windows (Graphpad Instat, Graphpad Software, University of London, Reino Unido). Se consideró significativo un valor de p≤0,05.
ResultadosUn total de 48 hombres y 30 mujeres sanos con diversos niveles de pigmentación fueron incluidos en el estudio. El promedio de β-carotenos en hombres fue de 29,900±11,900 frente a 30,600±8,600 en mujeres (p=0,787). No se encontraron diferencias ni asociaciones significativas en los niveles de β-caroteno por los factores de confusión evaluados según sexo, excepto en el análisis de la población general en las variables edad≥33 años (OR=1,62; IC95%=1,31-2,01;p<0,05) e incremento del porcentaje de grasa≥25% (OR=1,87; IC95%=1,41-2,49;p<0,05) (tablas 1 y 2). Tampoco se hallaron correlaciones entre la ingesta dietética mediante el cuestionario de recordatorio de 24h y las concentraciones dérmicas de β-carotenos por EER.
Niveles de β-carotenos totales por espectroscopia de resonancia Raman y características clínicas de la población de estudio (n=78)
| Variables | n (%) | ERRa | Valor pb |
| Edad | |||
| ≤33 años | 40 (51,2) | 23,997±12,648 | 0,56 |
| >33 años | 38 (48,2) | 25,377±12,953 | |
| Sexo | 0,78 | ||
| Hombres | 48 (61,5) | 29,900±11,900 | |
| Mujeres | 30 (38,5) | 30,600±8,600 | |
| Raza/etnia | 0,92 | ||
| Blanca | 62 (79,4) | 20,097±8,879 | |
| Otras | 16 (20,6) | 21,889±10,376 | |
| Hábito tabáquico | 0,60 | ||
| Sí | 15 (19,3) | 16,446±7,508 | |
| No | 63 (80,7) | 18,660±8,069 | |
| Índice de masa corporal (IMC) | 0,79 | ||
| Peso saludable (IMC 18,5 a ≤25,0 kg/m2) | 52 (66,6) | 21,377±9,661 | |
| Sobrepeso (IMC 25,0 a≤30,0kg/m2) | 16 (20,4) | 18,549±7,319 | |
| Obesidad (IMC ≥30,0 kg/m2) | 10 (13,0) | 15,432±6,621 | |
| Circunferencia de cintura | 0,69 | ||
| <88 cm | 46 (59,0) | 21,320±9,939 | |
| ≥ 88 cm | 32 (41,0) | 19,985±8.665 | |
Odd ratio e intervalos de confianza del 95% de tener bajos niveles de β-carotenos totales por espectroscopia resonante Raman en la población de estudio
| Variables | Total (n=78) | Hombres (n=48) | Mujeres (n=30) |
| ORa (IC95%) | ORa (IC95%) | ORa (IC95%) | |
| Edad | |||
| ≥33 años | 1,62 (1,31-2.01)* | ||
| Raza/etnia | |||
| Blanca | 1,72 (0,46-1,12) | 1,55 (0,77-3,11) | 1,14 (0,74-1,74) |
| Hábito tabáquico | |||
| Sí | 1,02 (0,62-1,51) | 1,05 (0,66-1,77) | 1,13 (0,72-1,77) |
| Índice de masa corporal (IMC) | |||
| Sobrepeso/obesidad (IMC entre 25,0 y 35,0 kg/m2) | 2,2 (0,90-5,43) | 1,38 (0,45-4,20) | 4,00 (0,85-8,84) |
| Circunferencia de cintura | |||
| ≥88 cm | 1,23 (0,48-3,12) | 1,08 (0,32-3,65) | 1,42 (0,33-6,17) |
| Porcentaje de grasa corporal | |||
| ≥25% | 1,87 (1,41-2,49)* | 1,93 (1,31-2,87) | 1,96 (1,32-2,92) |
IC95%: intervalo de confianza del 95%; OR: odds ratio.
El CCI de las concentraciones dérmicas de β-carotenos en los 3 lugares de medición usados en este estudio (palma de la mano, antebrazo interno y parte externa del antebrazo) varió de 0,82 hasta 0,87, indicando una alta reproducibilidad de la técnica. El mayor CCI se encontró en la palma de la mano CCI=0,87, seguido de la parte interna del antebrazo CCI= 0,85, y el antebrazo externo CCI= 0,82, mostrando que los niveles de β-carotenos fueron reproducibles y coherentes con el tiempo de medición de cada parte del cuerpo.
DiscusiónEl objetivo principal de este estudio fue evaluar la reproducibilidad de la técnica de ERR para detección de las concentraciones totales de β-carotenos en piel en adultos colombianos. Durante años, la importancia nutricional de los carotenoides se debió sobre todo al hecho de que algunos poseen actividad provitamínica A, la cual sigue siendo objeto de estudio en la actualidad18,19. El interés por estos compuestos isoprenoides se ha multiplicado no solo en Latinoamérica20–22, sino a nivel mundial23,24, debido a su capacidad antioxidante25 y a sus beneficios potenciales en la prevención de diversas enfermedades, como ciertos tipos de cáncer26, trastornos oculares27 y vasculares28.
Varios autores29,30 han observado en fumadores una menor concentración en plasma de antioxidantes debido, por un lado, a la mayor implicación de los antioxidantes disponibles en el bloqueo de la cadena de radicales libres inducida por el tabaco y, por otro, a una dieta posiblemente disminuida en estos compuestos. En este trabajo no se encontraron diferencias ni asociaciones estadísticamente significativas entre los niveles de β-carotenos y el hábito tabáquico, hallazgo que coincide con lo descrito por Farchi et al.31. Estos autores analizaron el efecto del humo del tabaco con la ingesta de α y β-carotenos, retinol, ácido ascórbico, α-tocoferol y licopenos en 1.249 fumadores de ambos sexos. Tampoco se encontraron asociaciones entre el hábito tabáquico y la ingesta de frutas y vegetales, lo que también coincide con los trabajos de Zondervan et al.29 y Marangon et al.30. No obstante, Rodriguez-Castilla et al.32 demostraron en varones fumadores con características similares a las de este estudio, concentraciones menores de β-carotenos (0,34μmol/L; p<0,001) y retinol (1,98μmol/L; p<0,01) vs sujetos no fumadores (0,53μmol/L y 2,0μmol/L), respectivamente. Asimismo, fue hallada una modesta correlación entre los niveles de β-carotenos y el consumo de tabaco (r Spearman= 0,170; p=0,006). Sin embargo, se ha descrito que el consumo de cigarrillos afecta los niveles plasmáticos de otras sustancias con capacidad antioxidante como el licopeno, la luteína, el α-tocoferol y el β-tocoferol, pero en menor proporción las concentraciones de β-carotenos, para los que el tabaco se considera un determinante independiente de la ingesta dietética32.
Junto al tabaquismo, la edad avanzada puede ser un factor adicional en la disminución de las concentraciones plasmáticas de vitaminas antioxidantes33. Moreiras y Carbajal34 encontraron que las concentraciones plasmáticas de α-tocoferol y de β-carotenos se relacionaban negativamente con el número de cigarrillos fumados (r=0,188) y la edad del fumador (r=0,304), p<0,05. En nuestro trabajo, esta relación solo fue encontrada en la población general (sujetos con edad≥ 33 años [OR=1,62; IC95%=1,31-2,01], p<0,05), sin diferencias por sexo. Coincidiendo con estos resultados, varios estudios han confirmado la influencia de la edad avanzada y una composición corporal alterada en los cambios en las concentraciones de sustancias antioxidantes35,36. Sin embargo, no hay trabajos que hayan evaluado esta relación con la técnica por ERR. Además, no detectamos diferencias o asociaciones por sexo entre las concentraciones dérmicas de β-carotenos y los factores de confusión evaluados (IMC, circunferencia de cintura y etnia), hallazgo que coincide con otros informes32–35,37–39.
Los resultados del presente estudio indican que la determinación no invasiva por ERR de β-carotenos en piel son reproducibles y fiables en seres humanos. Destacamos también que los niveles de β-carotenos en la población evaluada presentan una distribución normal, y los valores coinciden con las medias de estudios internacionales que han sugerido este tipo de mediciones poblacionales11–15.
Una importante ventaja del uso de la técnica de ERR es la rapidez para la determinación de las concentraciones de β-carotenos en piel, debido a que no se requiere una preparación de la muestra o condiciones especiales para su medida11–15. La ERR ha evolucionado rápidamente en los últimos años hasta convertirse en una prueba sencilla y accesible por su bajo coste y alta fiabilidad. Hoy en día es una importante técnica analítica para identificar el estatus antioxidante, y está siendo rápidamente adoptada por los especialistas en endocrinología y en nutrición en estudios clínicos40 y epidemiológicos41, aunque en menor proporción en la práctica clínica. En cuanto a la factibilidad de uso, los sujetos evaluados no presentaron respuestas adversas al escáner en cada medición, incluyendo la adquisición de datos y tiempo de procesamiento. Asimismo, nuestros hallazgos sugieren que la palma de la mano es uno de los mejores sitios para la determinación de los niveles de β-carotenos dérmicos mediante la técnica por ERR, pues fue el lugar con mayor concentración y con mayor CCI (probablemente relacionado con mayores niveles de β-carotenos), tal como fue descrito previamente por Mayne et al.6
Finalmente, la técnica por EER, aunque no es novedosa, plantea soluciones para el análisis rápido del estado nutricional de β-carotenos dérmicos en estudios poblaciones y tiene una alta probabilidad de usarse en la práctica clínica. Una limitación de nuestro estudio es el número de participantes con la piel muy pigmentada, lo que impide que seamos capaces de evaluar eficientemente el impacto de la melanina dérmica en las concentraciones de β-carotenos. Nuestra población de estudio se limitó a las personas menores de 65 años debido a que la calidad de la piel puede cambiar con la edad, aunque esto debe ser una preocupación menor en sitios como la palma de la mano. Los futuros estudios deben asegurar una representación adecuada de los participantes con una gama completa de pigmentación de la piel, con medidas directas del contenido de melanina, y rangos de edad mayor. Destacamos el reducido número de trabajos que han medido los niveles de carotenoides dérmicos y su repercusión en la salud humana11–15. Los futuros estudios podrán considerar la adición de este importante biomarcador en tejidos como la piel, como un indicador del estado nutricional y del estatus antioxidante. Será necesario incorporar las mediciones por ERR en estudios epidemiológicos antes de hacer inferencias clínicas acerca de las repercusiones que tiene este biomarcador sobre la salud.
En conclusión, la técnica de ERR constituye un método fiable para la medición no invasiva de las concentraciones de β-carotenos en piel y puede ser utilizado como un importante biomarcador del estatus antioxidante en estudios nutricionales y de salud en población humana.
Conflicto de InteresesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
