Background: To analyse whether the molecular diagnosis in FH patients is useful to predict the response to treatment with simvastatin in a south European population.
Subjects and Method: A randomised clinical trial with no control group, with 20 mg/day of simvastatin was conducted in 27 genetically diagnosed FH subjects (11 male) from 8 FH families, randomly selected from 30 FH families with a molecular diagnosis. Clinical features and lipid parameters at baseline and after simvastatin treatment were compared between subjects classified as null mutations (FH Valencia 1 and 2; n = 11) and defective mutations (n = 16).
Results: FH with null mutations (FH Valencia 1 and 2) have a poor response to simvastatin treatment. The mean reduction of plasma LDLc levels in subjects with null mutations were significantly lower (32.6% [9.5] vs 42.8% [12.2]; p = 0.03) than in subjects with defective mutations. Baseline and after treatment plasma HDLc values were also significantly lower in FH group with null mutations. No statistically significant differences were found at baseline, after treatment and in the response to treatment between males and females.
Conclusions: FH subjects with null alleles (FH Valencia 1 and 2) showed a poor response to simvastatin treatment. The type of LDL receptor gene mutation could predict the response to simvastatin in our south European FH population.
La hipercolesterolemia familiar (HF) es una enfermedad autosómica dominante frecuente, que viene definida molecularmente por mutaciones localizadas en el gen del receptor de LDL (rLDL) y se caracteriza por concentraciones elevadas de colesterol LDL (cLDL), xantomas tendinosos y cardiopatía isquémica temprana1,2. La expresión fenotípica de la enfermedad es muy variable, como lo es su respuesta terapéutica a estatinas, fármacos de elección en su tratamiento. Se considera que la variable expresión fenotípica depende de factores como la edad, dieta, índice de masa corporal y tipo de mutación del rLDL o de otros genes3-5.
Se han descrito más de 700 mutaciones localizadas en el gen del rLDL causantes de la HF. Estas mutaciones han sido clasificadas fenotípicamente o funcionalmente en 5 clases o tipos. Los alelos o mutaciones nulas (clase I) son aquellas en las que no existe receptor inmunoprecipitable y sólo expresan el receptor sano2. Las de clase II se caracterizan por alterar el transporte del receptor hasta la membrana celular; las de clase III, por afectar a la unión con la lipoproteína LDL; las de clase IV alteran la internalización del complejo partícula LDL-receptor, y finalmente las de clase V afectan al reciclado del receptor2.
En poblaciones caucasianas centroeuropeas y americanas los estudios acerca de la influencia del tipo de mutación del rLDL sobre la respuesta terapéutica a estatinas ofrecen resultados contradictorios. En general, los sujetos con HF con mutaciones «graves» presentan valores superiores de colesterol total y cLDL, mayor prevalencia de xantomas, peor respuesta terapéutica a estatinas y mayor riesgo de cardiopatía isquémica temprana3-8. Dentro de las mutaciones graves se incluyen las nulas, en las que no se sintetiza rLDL y que no presentan ARNm ni receptor detectable, y las mutaciones que afectan a la zona de repeticiones del exón 4 del gen rLDL, imprescindible para la unión con la apo B7. En cambio, en poblaciones mediterráneas del sur de Europa, incluida la española, no existen todavía estudios sobre la respuesta terapéutica a estatinas en sujetos con HF dependiendo de la mutación del rLDL presentada.
Hemos llevado a cabo un estudio de intervención, sin grupo control, con el fin de valorar la influencia del tipo de mutación del rLDL, clasificándolos en nulos (HF Valencia 1 y 2) y no nulos, sobre la respuesta terapéutica a simvastatina. Nuestro objetivo es probar la hipótesis de que las mutaciones nulas tienen menor respuesta al tratamiento farmacológico en sujetos con HF de poblaciones mediterráneas del sur de Europa.
Sujetos y método
Sujetos
Hemos estudiado a 27 sujetos heterocigotos con HF con diagnóstico genético de la enfermedad, 11 varones y 16 mujeres. Estos 27 sujetos pertenecen a 8 familias con HF que fueron seleccionadas por muestreo aleatorio según los criterios de inclusión y exclusión de un total de 30 familias con HF con diagnóstico genético. Del total de las 30 familias con HF con diagnóstico molecular, fueron seleccionadas de forma aleatoria 18 para participar en el ensayo. De éstas 18, se excluyó a 6 por presentar mutaciones localizadas en la zona de repeticiones de cisteínas del exón 4 y a otras cuatro por presentar mutaciones no clasificables. Además, los 27 sujetos finalmente incluidos cumplían todos los criterios de inclusión y ninguno de exclusión del estudio (véanse criterios de inclusión y exclusión en el apartado «Diseño del estudio»).
Todos los participantes residen en la Comunidad Valenciana y son controlados de forma regular en la Unidad de Lípidos y Arteriosclerosis de nuestro hospital. El comité de ética de nuestro Centro aprobó el protocolo de tratamiento y todos los sujetos dieron su consentimiento por escrito para participar en el estudio.
A todos ellos se les realizaron una historia clínica y exploración física completas. El índice de masa corporal (IMC) se calculó dividiendo el peso entre la talla al cuadrado (kg/m2). La presión arterial se midió con el paciente en sedestación con un esfingomanómetro de Von Recklinghausen, después de 5 min de reposo. Se consideró la media de tres determinaciones. La cardiopatía isquémica se definió por una historia clínica documentada de infarto agudo de miocardio (clínica, elevación de CPK-MB y electrocardiograma [EGG] patológico).
Diseño del estudio
El estudio se llevó a cabo en la consulta externa de la Unidad de Lípidos y Arteriosclerosis bajo la supervisión de un médico y una educadora-dietista. Tanto éstos como los pacientes desconocían el tipo de mutación presentada.
En la semana 6 (visita 1) se explicaron a los pacientes las diferentes fases del estudio, verificándose los criterios de inclusión y exclusión, y obteniendo el consentimiento informado. La visita incluyó una historia clínica y exploración física completas, así como extracciones para estudio de laboratorio (hemograma, bioquímica estándar, lípidos y apo B). Una vez incluido el paciente y firmado el consentimiento informado, se suspendió la medicación hipolipemiante.
Los criterios de inclusión fueron: HF heterocigota con mutación detectada en el gen del rLDL, edad entre 18 y 65 años, varones y mujeres (posmenopáusicas o en edad fértil con anticoncepción no hormonal y test de embarazo negativo). Los criterios de exclusión fueron: HF homocigota, enfermedad endocrinometabólica (hipotiroidismo, diabetes mellitus y obesidad grave), hepática renal o vascular (insuficiencia cardíaca congestiva o angina inestable) grave, toma de fármacos que afectaran al metabolismo lipídico e ingestión de etanol superior a 30 g/día, mutaciones del gen rLDL no clasificables, mutaciones del gen del rLDL que afectan a las zonas de repetición del exón 4, ya que, siendo no nulas, desde un punto de vista fenotípico se comportan en algunos estudios como tales7.
Cumplidas las 6 semanas de período de lavado, en la visita 0 todos los pacientes seleccionados recibieron 20 mg/día de simvastatina, en dosis única nocturna, durante 6 semanas (visita 0 hasta visita 2). Por razones éticas, no se administró placebo, ya que se incluyeron pacientes con cardiopatía isquémica y dado el alto riesgo cardiovascular de la HF. En la visita 0 se efectuaron una exploración física completa, historia dietética, consejo dietético y recogida de muestras para pruebas de laboratorio (hemograma, química estándar, lípidos y apo B). El cumplimiento terapéutico se valoró mediante recuento de comprimidos en las semanas 3 y 6 (visitas 1 y 2). A los pacientes se les interrogó sobre la presencia de efectos secundarios durante el seguimiento clínico cada 3 semanas (visitas 0, 1 y 2), sin que apareciese ninguno significativo. Los lípidos plasmáticos y la apo B se midieron en la visita 0 (basal) y 2 (tras 6 semanas de tratamiento con 20 mg/día de simvastatina). Durante el seguimiento clínico del estudio los pacientes recibieron consejo dietético y mantuvieron una dieta isocalórica hipolipemiante similar a la NCEP-I para mantener el peso. Las necesidades energéticas de la dieta isocalórica se calcularon con la fórmula de Harris-Benedict y aplicando un factor de corrección según la actividad física desarrollada por cada individuo. Los sujetos mantuvieron su estilo de vida y actividad física durante el estudio.
Métodos de laboratorio
Medición de lípidos y apo B. Tras 12-14 h de ayuno se recogió una muestra de sangre de la vena antecubital en tubos con EDTA (sistema Vacutainer) siendo centrifugadas en menos de 4 h. La extracción de ADN se realizó con un método estandarizado9. El colesterol y los triglicéridos se midieron por técnicas enzimáticas10,11. El colesterol HDL (cHDL) se determinó tras precipitación de lipoproteínas con apo B con polianiones12, y el colesterol VLDL (cVLDL) tras separación de VLDL (d < 1.006 g/ml) por ultracentrifugación13. El colesterol LDL (cLDL) se calculó de la resta sobre el colesterol total del cVLDL y cHDL. Las concentraciones plasmáticas totales de apo B se midieron por inmunoturbimetría14. Los coeficientes de variación para los lípidos y lipoproteínas de nuestro laboratorio son inferiores al 5%.
Métodos genéticos. El diagnóstico genético de HF se estableció siguiendo un protocolo escalonado de diagnóstico molecular. Las muestras de ADN genómico fueron inicialmente investigadas para la presencia de mutaciones localizadas en el gen de apo B causantes del defecto familiar de unión de apo B 100 (R3480P, R3500Q, R3500W y R3531C), dado que presenta idéntico fenotipo que la HF15.
Si son negativas, se realiza una detección de grandes reordenamientos del gen con técnica de Southern blot, utilizando inicialmente digestiones con Bg/II e hibridación con una mezcla de sondas que abarcan todo el gen y con KpnI + XbaI e hibridación con una sonda correspondiente al exón 216. Si se detectan bandas anormales, se confirma su existencia utilizando otras enzimas de restricción para descartar polimorfismos de restricción. Una vez confirmadas, se procede a su caracterización por complejos análisis de restricción (mapeado de restricción) y reacción encadenada de la polimerasa (PCR) larga16.
En el segundo escalón, se analizan las muestras negativas de los estudios anteriores para el cribado de pequeñas mutaciones, utilizando la técnica de amplificación por PCR y análisis de polimorfismos de conformación de cadena simple (SSCP), y posterior caracterización por secuenciación directa17,18. Se amplificaron el promotor, 18 exones y zonas intrónicas adyacentes a los exones por técnica de PCR. Los oligonucleótidos empleados y las condiciones del PCR-SSCP son similares a las utilizadas por Leren et al19.
La determinación del genotipo de Apo E se realizó utilizando el método descrito por Hixon y Vernier20.
Análisis estadístico
Los datos fueron analizados utilizando el Statistical Package for the Social Sciences (SPSS 6.1.3 para Windows), y se expresan como medias (desviación estándar). La respuesta al tratamiento de los lípidos y apo B plasmáticos se presenta como porcentaje de descenso sobre los valores considerados basales (visita 0). Las medias de las variables cuantitativas no apareadas se compararon utilizando ANOVA de un factor. Las proporciones se compararon utilizando tablas de contingencia y la prueba de la *2 o el test de Fischer (n < 5).
Las variaciones en los lípidos y la apo B plasmáticos se analizaron con la prueba de la t de Student para datos apareados. Utilizamos el análisis de regresión lineal múltiple tomando como variable dependiente el porcentaje de descenso de cLDL, y como independientes la edad, el IMC y el tipo de mutación.
El modelo lineal general para muestras repetidas se utilizó a fin de estudiar el efecto de la respuesta terapéutica con simvastatina, así como la interacción entre genotipo del rLDL y respuesta terapéutica para los lípidos y la apo B. En este análisis se utilizaron como variables la edad y el IMC.
Resultados
Respuesta general al tratamiento con 20 mg/día de simvastatina
Las características generales de los sujetos que participaron en el estudio se exponen en la tabla 1. No encontramos diferencias estadísticamente significativas con respecto a la edad, el IMC, las concentraciones de los lípidos y la apo B en situación basal y postratamiento entre varones y mujeres. Tampoco hallamos diferencias significativas en las reducciones y cambios de los lípidos y la apo B inducidos por el tratamiento con simvastatina entre varones y mujeres. El porcentaje de descenso medio del colesterol total en varones fue del 33,7%, y en mujeres, del 30,5%; para el cLDL fue del 40,9 y del 37,3%, respectivamente.
Al no encontrar diferencias estadísticamente significativas en la respuesta al tratamiento entre varones y mujeres con HF, presentamos los resultados de las concentraciones basales, postratamiento y modificaciones de los lípidos y la apo B para el grupo completo (tabla 2). En este grupo observamos descensos estadísticamente significativos en las concentraciones de colesterol total, cLDL (p < 0,001) y apo B (p = 0,001) tras tratamiento con 20 mg/día de simvastatina. No hallamos, sin embargo, diferencias significativas con este grupo en las concentraciones plasmáticas de triglicéridos, cVLDL y cHDL.
Tipos de mutaciones estudiadas del receptor de LDL
El grupo de sujetos con mutaciones nulas incluye a dos familias con grandes reordenamientos del gen del rLDL que afectan al promotor y a los primeros exones (mutaciones HF Valencia 1 y 2). Las mutaciones HF Valencia 1 (n = 4) y HF Valencia 2 (n = 7) son grandes deleciones del gen del rLDL que incluyen el promotor y el exón 1 y el promotor y el exón 2, respectivamente. En estas mutaciones no se detecta ARNm ni hay receptor alterado en la membrana procedente del alelo mutado, puesto que no es sintetizado. Los pacientes afectados sólo expresan el alelo sano16. Ambas familias proceden del área metropolitana de Valencia.
El grupo de sujetos con mutaciones no nulas incluye a 16 sujetos pertenecientes a 6 familias con HF con mutaciones concretas que afectan a diferentes exones, dando lugar a cambios en los aminoácidos de la proteína. Se excluyeron las mutaciones concretas que generan codones stop tardíos y, por tanto, proteínas truncadas, o mutaciones localizadas en el exón 4 que afectan a las repeticiones ricas en cisteínas y que tienen un comportamiento similar a las nulas en algunos estudios7. Las mutaciones incluidas fueron: R395W (n = 1), C358Y (n = 5), C68W (n = 1), G642E (n = 2) y T413R (n = 7). La mutación R395W se localiza en el exón 9, funcionalmente es de tipo IV (origen La Marina, Pego). La mutación C358Y se localiza en el exón 8 (origen Castellón ciudad) y la G642E se localiza en el exón 14 (origen área metropolitana de Valencia), siendo ambas de tipo II. La mutación T413R es de tipo V y se localiza en el exón 9 (origen La Safor, Gandía). La mutación C68W afecta al exón 3 y es de tipo II (origen Castellón, Almazora).
Respuesta de los lípidos y la apo B con respecto al genotipo de Apo E y a la mutación del gen rLDL
Los sujetos fueron divididos en dos grupos (mutaciones nulas y no nulas), según el tipo de mutación encontrada en el gen del rLDL. Las características generales y los valores de lípidos y apo B plasmáticos en situación basal y postratamiento de ambos grupos (mutaciones nulas y no nulas) se presentan en las tablas 3 y 4. No encontramos diferencias estadísticamente significativas en cuanto a la edad, distribución por sexos e IMC entre ambos grupos de sujetos con HF divididos según el tipo de mutación (tabla 3).
En el grupo de los 27 sujetos con HF, la distribución de los genotipos de Apo E fue similar entre los 11 sujetos con mutaciones nulas (2/3 n = 1, 3/3 n = 8 y 3/4 n = 2) y los 16 con mutaciones no nulas (2/3 n = 1, 3/3 n = 10 y 3/4 n = 5). Debido al bajo número de sujetos comparamos los valores basales de los lípidos, apo B y la respuesta a simvastatina entre sujetos con genotipo de Apo E 3/3 frente a 4/3. No encontramos diferencias estadísticamente significativas en la respuesta terapéutica entre ambos grupos (colesterol total del 32,3 frente al 25,8%; cLDL del 38,8 frente al 32,8%, respectivamente), aunque las concentraciones plasmáticas postratamiento de cLDL fueron significativamente superiores en los portadores del alelo E4 (164,5 [29,9] frente a 194,7 [25,8]; p = 0,03) y las concentraciones de cHDL inferiores [60,3 (13,2) frente a 35,6 [5,8]; p = 0,004).
En cuanto a las concentraciones basales de lípidos y apo B, no encontramos diferencias estadísticamente significativas entre ambos grupos (tabla 4), salvo en las concentraciones de cHDL, que fueron superiores en el grupo de sujetos con mutaciones no nulas. Esta diferencia se mantuvo tras el período de tratamiento (basal 36,8 [5,9] frente a 46,1 [18,3]; p = 0,001, y postratamiento 48,8 [11,0] frente a 57,6 [17,3]; p = 0,032). Las diferencias intergrupo se mantuvieron también al introducir como covariables en el modelo lineal general para muestras repetidas la edad y el IMC.
Encontramos diferencias estadísticamente significativas en las medias de los porcentajes de descenso del colesterol total y cLDL, siendo superiores en el grupo de HF con mutaciones no nulas (34,8 [10,8] frente a 27,14 [6,3]; p = 0,045, y 42,7 [12,2] frente a 32,6 [9,5]; p = 0,03, respectivamente), lo que indica una peor respuesta terapéutica en el grupo HF con mutaciones nulas. En el análisis de regresión lineal múltiple tomando como variable dependiente el porcentaje de descenso de cLDL y como independientes la edad, el IMC y el tipo de mutación, sólo este último presentó significación estadística en el modelo.
En cuanto a la respuesta de las concentraciones de triglicéridos, fue estadísti camente significativa y diferente entre ambos grupos. En los sujetos con mutaciones nulas, paradójicamente se observó un ascenso de las concentraciones (20,5%), mientras que hubo un descenso del 12% (p = 0,034) en los individuos con mutaciones no nulas. No obstante, existe una gran dispersión en la respuesta de las concentraciones de triglicéridos. Respecto a las concentraciones de cHDL, observamos ascensos del 30 y el 11%, respectivamente.
Utilizando el modelo lineal general para muestra repetidas, hallamos un efecto intragrupo estadísticamente significativo con respecto a la interacción entre genotipo HF y tratamiento farmacológico en las concentraciones de colesterol total (p = 0,023), pero no en el resto de parámetros lipídicos y de apo B (tabla 4). Este efecto significativo se mantuvo cuando introdujimos como covariables la edad y el IMC. Hallamos un efecto intragrupo estadísticamente significativo en cuanto al tratamiento farmacológico y las concentraciones de colesterol total, cLDL y Apo B (p < 0,001).
No se constataron diferencias en el cumplimiento terapéutico entre ambos grupos de sujetos. El peso de los pacientes durante el estudio permaneció estable, sin que existieran diferencias significativas entre las visitas 0 y 2.
Discusión
El presente estudio de intervención no controlado indica que la respuesta terapéutica de los lípidos plasmáticos a 20 mg/día de simvastatina depende, en parte, del tipo de mutación del gen del rLDL. Así, los sujetos con grandes deleciones (HF Valencia 1 y 2) que afectan al promotor del gen, que no expresan ARN mensajero ni proteína en superficie celular, y que corresponden a mutaciones nulas, presentaron una menor respuesta terapéutica. No obstante, estas diferencias podrían desaparecer de haber utilizado dosis máximas de simvastatina, otras estatinas o asociando simvastatina con resinas. Estas hipótesis no han sido por el momento verificadas.
En estudios previos, valorando el efecto de las mutaciones del receptor de LDL sobre la expresión fenotípica de la enfermedad y la respuesta a estatinas, las diferencias encontradas dependían de la edad, el IMC y el tipo de mutación del rLDL7,8,21,22. Así, las mutaciones de tipo nulo se asociaban a mayores concentraciones de colesterol total y cLDL, menor respuesta al tratamiento con estatinas21,24-26 y mayor prevalencia de cardiopatía isquémica3,7. En el estudio de Sun et al21, las mutaciones clasificadas como «graves», que incluían los alelos nulos, y las de la zona de repeticiones de cisteínas en el exón 4 presentaban mayores concentraciones de colesterol total y cLDL en situación basal y tras tratamiento. En cambio, los sujetos con otras mutaciones menos graves a priori presentaban concentraciones menores. Nuestro estudio viene a confirmar estos resultados en una población con HF del sur de Europa, donde no existían datos hasta la fecha.
Por otra parte, no todos los estudios confirman estos hallazgos. Leitersdorf et al22 observaron una mejor respuesta a fluvastatina en sujetos con la mutación liba-nesa, que funcionalmente se comporta como una mutación nula, comparándola con las mutaciones lituana y sefardita en población judía con HF. Además, Sijbrands et al23, en población holandesa con HF, demostraron una respuesta a simvastatina similar estudiando a 11 sujetos con HF y con ausencia de ARNm del rLDL (alelos nulos) y a 13 sujetos con HF y con ARNm (alelos no nulos). La discrepancia en los resultados de diferentes estudios que tratan de evaluar la influencia de las distintas mutaciones del rLDL sobre la respuesta terapéutica a estatinas puede deberse al pequeño tamaño muestral, que no descarta errores de tipo II. Es necesario realizar estudios mul ticéntricos que incluyan mayor número de pacientes con HF caracterizados molecularmente para evaluar esta influencia. Por tanto, nuestro estudio y los realizados hasta la fecha presentan esta limitación22-26.
En la actualidad, desconocemos el porqué de las diferencias encontradas en cuanto a la respuesta terapéutica con estatinas en los sujetos con HF. Una posible explicación es que la sobrexpresión del alelo sano mediada por estatinas dependa de la mutación presentada en el rLDL, o que algunos alelos mutados expresen cierta actividad funcional residual cuando son sobrexpresados24,26,27. También es posible que el receptor mutado interactúe con el receptor sano en el ciclo intracelular que éste sigue, modificando su función22. Sin embargo, estas hipótesis no han sido contrastadas todavía.
La interacción con otros genes también puede influir en la respuesta terapéutica a estatinas en sujetos con HF. Así, Carmena et al28 y Ordovás et al29 demostraron una menor respuesta terapéutica a estatinas entre los portadores del alelo E4 del gen de Apo E. Sin embargo, estos hallazgos no han sido confirmados por otros autores30,31. En nuestro estudio, no hemos encontrado diferencias en la respuesta terapéutica entre sujetos con genotipo E3/3 y E4/3, aunque los portadores del alelo E4 presentaron mayores concentraciones de cLDL y menores de cHDL tras el ensayo con simvastatina.
En nuestro estudio, también hemos encontrado diferencias en cuanto al efecto de la mutación del rLDL y el tratamiento con simvastina en las concentraciones de triglicéridos y cHDL. En el estudio de Sijbrands et al23, se observó que los sujetos con mutaciones nulas (ausencia de ARNm) presentaron mayor prevalencia de xantomas y menores concentraciones de cHDL en situación basal y tras tratamiento con simvastatina. Nuestros datos son similares a los de estos autores e indican la importancia que puede tener el receptor de LDL sobre el metabolismo de las partículas HDL en los pacientes con HF. Las diferencias en las concentraciones de cHDL y la distinta respuesta terapéutica de los triglicéridos podrían deberse al efecto que el receptor de LDL tiene sobre el aclaramiento de los quilomicrones y remanentes de VLDL. Creemos que en los sujetos con mutaciones graves del rLDL (p. ej., las nulas) el aclaramiento de los quilomicrones y partículas remanentes se encuentra enlentecido, lo que ocasiona mayor lipemia posprandial, concentraciones mayores de triglicéridos y menores de cHDL y mayor riesgo cardiovascular. Esta hipótesis se basa en los resultados de diferentes estudios. Bowler et al32 demostraron una reducción del 50% en el aclaramiento de quilomicrones y remanentes de VLDL en un modelo animal de HF, el conejo Watanabe. En sujetos homocigotos con HF se ha encontrado un retraso significativo en el aclaramiento de partículas ricas en triglicéridos tras sobrecarga grasa33. Además, Castro-Cabezas et al34 observaron, en heterocigotos con HF, un retraso en el aclaramiento de partículas remanentes estudiando el área bajo la curva de dicho aclaramiento. Finalmente, en el estudio de Vohl et al3, los pacientes con HF con mayor riesgo cardiovascular fueron los que presentaron mutaciones nulas, concentraciones mayores de triglicéridos y menores de cHDL.
En conclusión, el diagnóstico genético de la HF y la caracterización de las mutaciones del rLDL pueden ser importantes para ayudar a predecir la respuesta al tratamiento con simvastatina. Las diferencias observadas entre los sujetos portadores de una misma mutación indican la existencia de interacciones con otros factores genéticos y exógenos, que deberán ser estudiados.
