Uso de chips de ADN (microarrays) en medicina: fundamentos técnicos y procedimientos básicos para el análisis estadístico de resultados

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Es conocido que anomalías en la expresión de los genes pueden llevar a disfunciones celulares, provocando graves enfermedades como el cáncer, entre muchas otras. Los genes que tengan su expresión alterada en un tejido tumoral respecto a un tejido sano del mismo órgano, por ejemplo, serán claros candidatos a tener alguna implicación en el proceso neoplásico. Por lo tanto, la identificación de los genes desregulados es un paso importante para conocer las bases moleculares de muchas enfermedades de carácter genético.Desde mediados de los años noventa existe la técnica de los microarrays de ADN, que permite monitorizar simultáneamente el nivel de expresión de miles de genes en un conjunto de células. Sin embargo, la potencia que nos ofrece esta herramienta implica nuevos retos en lo que se refiere al análisis estadístico. Los datos que se generan con microarrays, aparte de tener un gran volumen, se caracterizan por ser altamente variables, por lo que serán básicos tanto el análisis estadístico como el diseño experimental que se plantee para solucionar las diferentes cuestiones biológicas que nos propongamos.En este trabajo explicaremos primero con más detalle qué es un microarray y cómo funciona, para después tratar sobre cuáles son sus principales usos. Seguidamente hablaremos de los diferentes diseños experimentales que se pueden utilizar, y pasaremos a tratar las diversas partes que componen el análisis de un microarray, desde el procesamiento de la imagen y control de calidad de los datos hasta el tratamiento estadístico para identificar genes de interés. Finalmente, hablaremos sobre las diferentes técnicas de análisis multivariante que se pueden utilizar para extraer el máximo conocimiento de nuestros datos. La figura 1 muestra un esquema con los aspectos más relevantes de un protocolo de experimentos con microarrays. Fig. 1. Protocolo a seguir en un experimento de microarraysy partes que componen su análisis estadístico.¿Qué es un microarray de ADN y cómo funciona?Los microarrays de ADN son una herramienta que permite realizar análisis genéticos diversos basados en la miniaturización de procesos biológicos. La primera aplicación de esta tecnología fue para medir simultáneamente el nivel de expresión de miles de genes1. Las mejoras tecnológicas han perfeccionado la calidad y han ampliado el espectro de aplicaciones, de manera que los microarrays se han consolidado como herramientas útiles en investigación genética con aplicaciones en medicina2,3. El funcionamiento de los microarrays de expresión se basa en la capacidad de las moléculas complementarias de ADN de hibridar entre sí. Pequeñas cantidades de ADN, correspondientes a diversos genes cuya expresión se desea medir, son depositadas en una base de cristal. Para ello se utilizan robots de precisión que usan unas agujas especiales para obtener las moléculas de sus recipientes y depositarlas en las coordenadas adecuadas. A estas muestras de ADN depositadas en el microarray las denominaremos dianas. En un microarray típico, una superficie de 2 * 2 cm puede contener más de 10.000 dianas en forma de pequeños puntos separados adecuadamente (fig. 2). De las células que queramos medir su expresión obtendremos una muestra de ARN que se convertirá en ADN complementario (ADNc) y se marcará con una molécula fluorescente. A esta muestra marcada la denominaremos sonda y se enfrentará a las dianas del microarray. Cada molécula de ADNc marcada de la sonda se moverá por difusión hacia la diana que contenga su molécula complementaria para hibridarse con ella y quedar fijada allí. Después de un tiempo para que la mayoría de las cadenas complementarias hibriden, el microarray se lava y se procede a hacer una medición relativa de la cantidad de ADN de la sonda que ha quedado fijada en cada diana. Fig. 2. Imagen de un microarray de ADNc. Contiene 4.608 clones depositados por duplicado en un soporte sólido, que habitualmente suele ser de vidrio.Existe otra tecnología que emplea oligonucleótidos (secuencias cortas de ADN, de unas 15-30 bases)4. Estos oligonucleótidos, en lugar de ser depositados en el soporte mediante un robot, son sintetizados directamente sobre el soporte mediante una técnica denominada fotolitografía que es similar a la empleada para confeccionar circuitos microelectrónicos sobre silicio. Esta tecnología requiere una infraestructura muy sofisticada y su empleo por el momento está limitado a unas pocas empresas especializadas entre las que destaca Affymetrix. Para detectar la expresión de un gen se emplea una serie amplia de oligonucleótidos, alrededor de 30, por lo que estos microarrays contienen muchas más dianas, lo que es factible porque la fotolitografía permite obtener mayores densidades.¿Para qué sirven los microarrays de ADN?Las aplicaciones de los microarrays se amplían cada día, aunque por el momento hay 3 grandes áreas consolidadas:El análisis del nivel de expresión génicaYa se ha mencionado y se explicará con mayor detalle más adelante. En estos experimentos se obtienen datos sobre el nivel de expresión de miles de genes. A partir de estos datos, empleando un diseño experimental correcto y técnicas estadísticas adecuadas, se pueden realizar estudios de diagnóstico y caracterización de tumores u otros tejidos5-8, identificación de los genes que modifican su expresión tras la administración de fármacos9 o identificación de genes con valor pronóstico10,11. También se han empleado para asignar función a secuencias de ARN que se expresan pero cuya función era desconocida (EST) y para identificar grupos de genes que forman redes de regulación génica12. Otras aplicaciones son el diagnóstico de enfermedades infecciosas a partir de la detección del genoma del germen en tejidos13,14. GenotipificaciónUna muestra de ADN obtenida de un tejido o fluido, adecuadamente amplificada, puede ser estudiada para detectar mutaciones en genes de interés o variantes génicas (polimorfismos en un nucleótido, SNP en la terminología de este campo). Esta metodología tiene usos potenciales para la detección de riesgo o susceptibilidad para presentar enfermedades15,16. Variantes de estos microarrays permiten secuenciar genes con mutaciones conocidas.Detección del número de copias del ADNSimilar a la técnica de hibridación genómica comparada (CGH), se han diseñado microarrays para detectar ganancias o pérdidas alélicas en miles de secuencias, lo que permite obtener mapas cromosómicos mucho más detallados que la CGH tradicional17. Estas técnicas tienen interés potencial en el estudio del pronóstico de tumores, ya que éste se halla asociado al nivel de daño genómico. También puede ser útil para detectar nuevos oncogenes y genes supresores de tumores.¿Cómo se usan los microarraysde expresión?Se describirá en este apartado la metodología empleada en microarrays de ADNc (fig. 3). El objetivo del experimento es detectar genes que se expresan en un tejido. El proceso se inicia con la extracción del ARN de la muestra. El ARN es muy inestable y se degrada en pocos minutos, por lo que los tejidos deben ser frescos o congelados inmediatamente tras su obtención. El ARN se convierte en ADNc mediante una transcriptasa reversa y en este proceso se marca con un fluorocromo, es decir, con una molécula que posteriormente emitirá luz al ser excitada mediante una luz láser adecuada. Fig. 3. Esquema del funcionamiento de un microarrayde ADNc. De 2 muestras diferenciadas, A y B, se extrae el ARN, que después será retrotranscrito a ADNc y marcado con unos fluorocromos (moléculas que emiten luz cuando son excitadas). Los 2 ADNc marcados con distintos fluorocromos, llamados sondas en la terminología de los microarrays, se hibridan conjuntamente de manera competitiva contra un conjunto de ADNc diana depositados en un soporte de vidrio (microarray), obteniéndose así una imagen como la de la figura.La sonda de ADNc marcado, que contiene una muestra de los genes que se expresan en el tejido de origen, se hibridará con las secuencias diana depositadas en el microarray, que son complementarias a las expresadas. Debido a que la eficiencia del marcado puede ser variable según los genes, y que la cantidad de ADN diana puede no ser igual de un microarray a otro, normalmente se realizan experimentos en competición. Éstos consisten en comparar sobre un mismo microarray 2 muestras de ADN de tejidos diferentes, cada una marcada con un fluorocromo distinto. Las 2 muestras se mezclan y se hibridan simultáneamente sobre el microarray. Este diseño experimental es ventajoso en cuanto que las comparaciones entre las 2 muestras de un microarray tienen menor variabilidad que las comparaciones de muestras de diferentes microarrays y también se reduce a la mitad el número de microarrays necesarios.Una vez se ha producido la hibridación, el microarray se lee con un escáner láser y se obtienen 2 imágenes, una para cada fluorocromo usado, con puntos de luz cuyas intensidades variarán según el nivel de hibridación que se haya producido en cada diana. Estas imágenes se procesan mediante un software que cuantifica la señal de cada punto (diana) para cada fluorocromo (muestra) y elabora una base de datos que será analizada con técnicas estadísticas. Con frecuencia se elabora una imagen superpuesta de las dos en forma de seudocolor. Una de las imágenes se colorea en rojo y la otra en verde. De esta manera, los puntos amarillos tienen señal alta en las 2 muestras en cantidad similar. Los puntos rojos o verdes indican que la expresión de ese gen predomina en una de las muestras (fig. 2).Diseño de experimentosComo ya se ha mencionado, en un microarray de ADNc se analizan simultáneamente 2 muestras. Esta limitación no impone restricciones en el tipo de estudios que pueden realizarse, pero hace necesario que se utilicen diseños adecuados. Como la tecnología de microarrays es muy cara, algunos investigadores están tentados de realizar experimentos sin réplicas. De hecho, existe una serie amplia de técnicas que pretenden identificar qué genes se expresan de manera diferente en 2 tejidos a partir de un único microarray. Estos métodos consisten en definir un umbral en la razón de intensidades a partir del que se considera que existe un cambio significativo. El método más simple emplea un valor de umbral fijo que suele ser 2, es decir, la señal de expresión de un canal tiene una intensidad doble que la del otro. Este método no se basa en criterios estadísticos e ignora por tanto la variabilidad observada en la razón de intensidades. Otros métodos que utilizan criterios estadísticos son los de Chen, que define el umbral según la variabilidad observada18; el de Sabatti, que emplea información de un experimento de reproducibilidad19, y el de Newton, que usa una aproximación bayesiana empírica20. Hoy día, sin embargo, se reconoce que los experimentos basados en un único microarray tienen poca validez, pues los datos tienen gran variabilidad que es necesario controlar con el empleo de un número de réplicas y de tamaños de muestra adecuados21-26.Otro aspecto importante para el diseño es el tipo de control a emplear y la distribución de muestras entre microarrays. Para aprovechar la reducción de variabilidad en las comparaciones dentro de un microarray, el diseño óptimo es aquel que enfrenta en un microarray 2 muestras que interesa comparar directamente. Por ejemplo, en la búsqueda de genes que se expresen diferencialmente en tumores respecto al tejido sano se hibridarán conjuntamente las muestras del mismo individuo (fig. 4a). Fig. 4. Diferentes modelos experimentales que se pueden utilizar en los experimentos con microarrays de ADNc. La dirección de la flecha indica el fluorocromo con que se marca la muestra (base: rojo y punta verde). A: varias muestras apareadas de dos condiciones (A/B). B: cada muestra (A, B, C) se hibrida con una referencia común (R). C: diseño circular de 3 muestras. D: diseño factorial, que permite evaluar simultáneamente 2 factores como tipo de tejido (A/B) y tratamiento (1/2).Si se desea comparar más de dos condiciones entre sí, los diseños (maneras de aparear las muestras) pueden ser variados. Se han utilizado con frecuencia diseños que aparean cada muestra con un patrón común, que suele ser una combinación de varias de ellas (fig. 4b). Este diseño es fácil de entender y permite realizar comparaciones individuales entre las muestras, pero no es óptimo. Los diseños circulares (fig. 4c) o factoriales (fig. 4d) son más convenientes para obtener la mejor razón entre la varianza del error (residual) y el número de microarrays empleado21,25.Análisis de la imagenLa cuantificación de la señal a partir de las imágenes es un proceso muy importante ya que determina los valores que posteriormente se analizarán. En la actualidad existen múltiples herramientas, tanto comerciales como de libre distribución (ScanAlyze, de la Universidad de Stanford), diseñadas exclusivamente para analizar las imágenes de microarrays. Las imágenes a analizar suelen ser 2 archivos en formato TIFF en escala de grises de 16 bits, es decir, cada píxel puede tener una intensidad de señal entre 0 y 216 1 (65.535).El proceso de análisis de la imagen se puede dividir en 3 etapas. En primer lugar se localizan los puntos a partir de los datos que proporciona el fabricante del microarray (cuántos puntos hay, cómo están agrupados, separación teórica entre los centros). A continuación se realiza la segmentación, que consiste en identificar qué píxeles corresponden a un punto y qué píxeles son fondo. Por último, se procede a la cuantificación, a menudo como el promedio o la mediana de las intensidades de los píxeles que forman el punto. En este apartado es importante que el software proporcione varias medidas que puedan ser empleadas como indicadores de la calidad del punto. Medidas típicas son los índices de circularidad, diámetro máximo, perímetro, homogeneidad de la señal dentro del punto, etc. También es necesario obtener una medida del fondo, es decir, el nivel de señal en los píxeles reconocidos como fuera de los puntos. Este valor normalmente se sustrae de la intensidad en el punto para obtener la intensidad neta. La razón entre la señal en el punto y en el fondo también es un índice de calidad importante.Análisis estadísticoUna vez se han analizado las imágenes y almacenado los datos, la última parte del proceso consiste en realizar su análisis estadístico. Estos análisis pueden tener diferentes objetivos y emplean técnicas específicas:Control de calidad de los datosConsiste en detectar valores incorrectos para su posterior exclusión de los análisis. Estos valores incorrectos pueden surgir por problemas en la calidad de los experimentos o por accidentes durante su manipulación, como rascadas en la superficie del microarray. Su detección puede realizarse empleando límites de tolerancia en los indicadores de calidad del punto. Es muy útil que el diseño del microarray incluya réplicas de una misma diana. La comparación de las réplicas permite identificar casos discordantes (fig. 5). Fig. 5. Control de calidad de la hibridación. A: diferencias de intensidad considerables entre las dos réplicas de un clon. B: problemas en la segmentación debidas a una mota de polvo en el chip.Normalización de los datosEl objetivo de la normalización es eliminar la variabilidad sistemática introducida por el proceso técnico que no está relacionada con el nivel de expresión27. Las 2 imágenes de un microarray se obtienen por separado, cada una con una longitud de onda diferente (normalmente rojo y verde) y una potencia que debe ajustarse de manera independiente para evitar saturación. El ajuste independiente hace que las 2 imágenes no sean comparables en cuanto a intensidad si no se normalizan previamente.Existen múltiples métodos para normalizar. La mayoría supone que son pocos los genes que cambiarán su expresión, por lo que el promedio estimado por un método robusto debe centrarse. El método más recomendado emplea modelos de regresión de datos suavizados mediante técnicas no paramétricas que capturen la no linealidad como el lowess28, dado que las diferencias entre imágenes suelen tener una distribución variable con la intensidad27. En la figura 6a se muestran los datos de un experimento en el que el ADNc de un mismo tejido se marcó con los 2 fluorocromos (R y G). Esperaríamos que la nube de puntos se situara alrededor de la recta con pendiente 1 que pasa por el origen. Puede apreciarse que la nube de puntos está desplazada por debajo de la línea teórica y muestra una desviación no lineal. La magnitud de la dispersión corresponde a la variabilidad de la técnica, pues recordamos que las 2 muestras corresponden al mismo tejido. Para obtener una mejor visualización, normalmente se transforman los valores según las fórmulas: A = log(R*G)/2 y M = log(R/G). El valor A corresponde al logaritmo de la intensidad media (geométrica) de los 2 colores y el M al logaritmo de la razón de las intensidades. La figura 6b muestra los mismos datos transformados. La curva central a la nube de puntos muestra la estimación no paramétrica de la relación entre M y A, obtenida por el método lowess L = lowess(A,M). La normalización consiste simplemente en restar a cada punto la diferencia entre M y L. El resultado puede apreciarse en la figura 6c. Fig. 6. Normalización de las intensidades del canal rojo (R) y verde (G) obtenidos en un experimento de reproducibilidad (la misma muestra marcada con diferente fluorocromo). A: gráfica log(R) frente a log(G), donde se aprecia menor señal en la muestra marcada con el fluorocromo rojo. B: gráfica M = log(R/G) frente a A = log(R*G)/2 sin normalizar. Es simplemente una transformación de la anterior donde se aprecia mejor que las diferencias siguen una curva no lineal en función de la intensidad. C: gráfica M frente a A después de normalizar mediante regresión local robusta (lowess).El modelo de normalización puede incluir covariables, además de la intensidad media, de las que dependa el valor de la señal. Se recomienda, por ejemplo, estratificar el modelo según la aguja del robot que produjo el microarray, o emplear información espacial para eliminar posibles heterogeneidades en la intensidad de la hibridación en diferentes zonas del microarray (normalización en 2 dimensiones). Otros métodos, útiles para normalizar múltiples microarrays, se basan en igualar no sólo el promedio de razón de intensidades de cada fluorocromo, sino la forma de la distribución (normalización por cuantiles). Este método se usa de forma rutinaria con microarrays de oligonucleótidos y puede emplearse también para los microarrays de ADNc.Tratamiento de valores perdidosCuando se analizan datos de múltiples microarrays puede ser importante dar un tratamiento adecuado a los valores perdidos. Trabajar con los puntos con información completa en todos los microarrays puede suponer una pérdida importante de genes valorables. A menudo se emplean técnicas de imputación basadas en medias condicionales del gen respecto al conjunto de los microarrays o respecto a los valores de los puntos vecinos29.Análisis de la diferencias de expresión a nivel de ARNEste apartado del análisis pretende determinar qué genes varían su nivel de expresión en función del tejido analizado (por ejemplo, normal y tumor). Dado que en un experimento típico se emplean relativamente pocos casos y se quiere investigar si existen diferencias en miles de variables (genes), las técnicas estadísticas clásicas no son adecuadas sin las correspondientes modificaciones. Por un lado, no puede asegurarse la normalidad de los datos que requieren las pruebas estadísticas clásicas. Por otro lado, la tasa de resultados falsamente positivos puede ser muy elevada si no se emplean correcciones que tengan en cuenta la multiplicidad de hipótesis que se prueban. Las soluciones propuestas para estos problemas son emplear tests de permutaciones para evaluar empíricamente el nivel de significación para cada gen y, posteriormente, controlar la tasa global de resultados falsos positivos mediante un ajuste de los valores p que tengan en cuenta las múltiples comparaciones realizadas.Los tests de permutaciones construyen la distribución de probabilidad empírica a partir de los propios datos mediante muestreo múltiple30,31. Se emplea un test estadístico clásico como la t de Student u otra prueba adecuada según el tipo de variable o diseño de estudio. Se calcula, para un gen, el valor del test que compara los grupos (valor observado). Se repite el mismo test múltiples veces de manera que cada vez la asignación del grupo (normal o tumor) se cambia al azar. De esta manera se simula la situación en la que no hay diferencias, pues la asignación de cada muestra a uno u otro grupo es aleatoria. Finalmente, el valor p se calcula a partir del percentil que ocupa el valor observado en la distribución de valores obtenidos por permutación. Con unos cientos de permutaciones suele ser suficiente para obtener el valor p, pero pueden precisarse varios miles si se desea diferenciar entre valores pequeños (muy significativos). Este proceso se repite por separado para cada gen.Los métodos para evitar resultados falsos positivos corrigen los valores p para controlar el nivel global de significación. Existen varios métodos, desde el más sencillo de Bonferroni, que consiste en considerar significativos sólo aquellos valores p inferiores al cociente entre alfa y el número de tests. Este método es muy conservador pues asume que cada test es independiente, lo cual probablemente es falso en el contexto del análisis de múltiples genes en microarrays de ADN, ya que la expresión de algunos genes puede estar correlacionada. Otros métodos de control del nivel global de significación emplean procedimientos adaptados y tienen en cuenta la correlación entre tests. Los más empleados en el contexto de microarrays utilizan también métodos de remuestreo como el min-P y max-T32.También se ha propuesto una serie de procedimientos de análisis que se basan en métodos bayesianos puros o bayesianos empíricos. Algunos de estos procedimientos son interesantes ya que proponen que los resultados observados provienen de una mezcla de dos tipos de genes, los que no cambian su expresión (la mayoría) y los que cambian. Para estimar qué genes pertenecen a cada grupo se emplean mixturas de distribuciones que se rigen por una serie de parámetros. Con frecuencia los valores de estos parámetros se estiman a partir de la información que aporta el propio experimento (métodos bayesianos empíricos), pero otras veces los propone el investigador, que puede haberlos obtenido de otros estudios (métodos bayesianos puros). En cualquier caso, estos métodos son interesantes pues tienden a suavizar los valores extremos, que suelen ser la causa de resultados falsamente positivos33.Clasificación de muestras o genesA partir de los genes que muestren expresión diferencial se puede intentar buscar patrones con el objetivo de clasificar las muestras34-38. Posteriormente, tras evaluar las características de las muestras agrupadas, se pueden identificar «genes prototipo» que definan los grupos. También se pueden buscar grupos de genes que muestren un patrón de expresión diferencial similar. Esto puede ser útil para asignar función a genes o secuencias que se expresan que hasta ahora la tienen desconocida. Estos análisis también se han empleado para identificar redes de regulación génica39,40.Existen múltiples métodos de clasificación automática. Los más utilizados se basan en técnicas de análisis de conglomerados o clusters jerárquicos, que pueden emplear diferentes distancias y algoritmos35. Estas técnicas generan un gráfico en forma de árbol (dendograma) con la jerarquía obtenida. El problema suele ser decidir por dónde cortar el árbol para definir el número de grupos identificados. Como alternativa, se puede definir a priori el número de grupos que se desea identificar y usar métodos que reparten las observaciones de manera óptima entre los grupos. Entre estas técnicas se encuentran el «k-means» y los «Self Organizing Maps»36,41. Otros métodos se basan en mixturas paramétricas («model based clustering»)42. Los análisis de clusters se pueden aplicar para agrupar muestras o agrupar genes. También pueden realizarse las 2 agrupaciones simultáneamente, lo que permite interpretar más fácilmente los resultados. La figura 7 muestra una doble clasificación (muestras en columnas y genes en filas) donde se aprecian 2 grupos de muestras y 2 de genes. La imagen en seudocolor muestra en rojo genes con expresión aumentada y en verde genes con expresión disminuida. A menudo las técnicas de clusters se combinan con técnicas de reducción de la dimensionalidad como el análisis de componentes principales43 y la regresión de mínimos cuadrados parciales («partial least squares»)44. Fig. 7. Análisis de conglomerados (clusters) de dos dimensiones para una selección de 449 genes de un microarray.Los genes están dispuestos en columnas. En filas se han seleccionado las razones de intensidades de 10 experimentos comparando tejido tumoral con el tejido normal del mismo individuo. Los genes con color rojo presentan una sobreexpresión en el tumor, mientras que los de tonalidad verde están más expresados en el tejido sano.Cuando las muestras están caracterizadas por variables que interesa diferenciar, los métodos de clasificación supervisada son más eficaces. Ejemplos de aplicación son la discriminación en función del tipo de tejido (normal o tumoral) o en función del tipo celular o pronóstico. Entre los métodos de clasificación supervisada destacan los de regresión discriminante, con múltiples versiones (lineal, cuadrática, logística, etc.), las redes neurales, los árboles, etc. Una excelente revisión de estos métodos aplicados al análisis de microarrays puede encontrarse en el libro de Hastie et al45.Hay una amplia disponibilidad de software de uso libre para analizar datos de microarrays. Merece una mención especial el proyecto Bioconductor (www.bioconductor.org), que contiene numerosas herramientas para análisis gráfico y estadístico basadas en el software R (www.r-project.org).DiscusiónLos microarrays para análisis genéticos se están consolidando como una tecnología útil, a pesar de que es relativamente reciente y todavía adolece de limitaciones técnicas como una gran variabilidad. La tecnología mejora día a día, por lo que los problemas de escasa reproducibilidad se solventarán a corto plazo.El campo que ha recibido con mayor entusiasmo esta tecnología es la oncología, donde ya se han publicado interesantes resultados en cuanto a clasificación molecular y predicción de pronóstico en varios tumores5-7,37,46,47. Las aplicaciones a otros campos de la medicina como cardiología48, neumología49 o reumatología50, entre otras, también son prometedoras.Uno de los principales retos que afronta esta tecnología es evitar un excesivo entusiasmo en el momento de reportar resultados para evitar frustraciones por falsos positivos. Cada experimento con microarrays evalúa miles de hipótesis simultáneamente, por lo que un análisis ligero, sin las debidas correcciones estadísticas, puede generar resultados falsamente significativos. La identificación de señales interesantes en un microarray debe ser verificada con otras técnicas y, como en otros campos del conocimiento, es necesario que experimentos en muestras independientes repliquen los resultados antes de adoptarlos como válidos. Por el momento los microarrays se utilizan fundamentalmente en investigación, pero dentro de poco aparecerán aplicaciones clínicas para diagnóstico o evaluación de riesgo. AgradecimientosEsta revisión recoge la experiencia de la Unidad de Bioestadística y Bioinformática del Instituto Catalán de Oncología en colaboración con el Grupo de Microarrays de ADN del Instituto, que investiga en aplicaciones de los microarrays al estudio del diagnóstico y pronóstico del cáncer colorrectal. Los investigadores del grupo son G. Capellà, M.A. Peinado, M. Grau, E. Vendrell, A. Obrador, G. Tarafa, E. Guinó, J. Valls, X. Solé y V. Moreno. El grupo cuenta con financiación del Fondo de Investigaciones Sanitarias (FIS 96/0797, FIS 00/0027, FIS 01/1264) y de la CICYT (SAF 99/0103, SAF 00/81-C2). Este grupo es miembro de las Redes de Temáticas de Investigación Cooperativa en Cáncer (C03/10) y en Epidemiología y Salud Pública (C03/09), financiadas por el Instituto Carlos III, Ministerio de Sanidad y Consumo. 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Además, la gran variabilidad observada en los experimentos y su elevado coste exigen un diseño cuidadoso. En esta revisión se explicará con detalle qué es un microarray de ADNc, cómo funciona y cuáles son sus principales usos. Seguidamente, se abordarán aspectos estadísticos del diseño experimental y de los diferentes apartados del análisis de un microarray, desde el procesamiento de la imagen y control de calidad de los datos hasta los tests para identificar genes de interés. Por último se comentarán diferentes técnicas de análisis multivariante que se pueden utilizar para analizar patrones en la expresión de los genes." ] "en" => array:1 [ "resumen" => "DNA microarray technology allows the assessment of genetic analyses on thousands of genes simultaneously. The statistical analyses of these experiments are challenging since a high number of multiple hypotheses are tested and classical statistical methods need to adapt to this situation. 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Estadísticas

Use of DNA chips (microarrays) in medicine: technical foundations and basic procedures for statistical analysis of results

Víctor Morenoa, Xavier Soléa

a Unidad de Bioestadística y Bioinformática. Servicio de Epidemiología y Registro del Cáncer. Instituto Catalán de Oncología. Hospital Duran i Reynals. L'Hospitalet de Llobregat. Barcelona. España.

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Por lo tanto&#44; la identificaci&#243;n de los genes desregulados es un paso importante para conocer las bases moleculares de muchas enfermedades de car&#225;cter gen&#233;tico&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Desde mediados de los a&#241;os noventa existe la t&#233;cnica de los <span class="elsevierStyleItalic"> microarrays</span> de ADN&#44; que permite monitorizar simult&#225;neamente el nivel de expresi&#243;n de miles de genes en un conjunto de c&#233;lulas&#46; Sin embargo&#44; la potencia que nos ofrece esta herramienta implica nuevos retos en lo que se refiere al an&#225;lisis estad&#237;stico&#46; Los datos que se generan con <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span>&#44; aparte de tener un gran volumen&#44; se caracterizan por ser altamente variables&#44; por lo que ser&#225;n b&#225;sicos tanto el an&#225;lisis estad&#237;stico como el dise&#241;o experimental que se plantee para solucionar las diferentes cuestiones biol&#243;gicas que nos propongamos&#46;</p><p class="elsevierStylePara">En este trabajo explicaremos primero con m&#225;s detalle qu&#233; es un <span class="elsevierStyleItalic"> microarray</span> y c&#243;mo funciona&#44; para despu&#233;s tratar sobre cu&#225;les son sus principales usos&#46; Seguidamente hablaremos de los diferentes dise&#241;os experimentales que se pueden utilizar&#44; y pasaremos a tratar las diversas partes que componen el an&#225;lisis de un <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span>&#44; desde el procesamiento de la imagen y control de calidad de los datos hasta el tratamiento estad&#237;stico para identificar genes de inter&#233;s&#46; Finalmente&#44; hablaremos sobre las diferentes t&#233;cnicas de an&#225;lisis multivariante que se pueden utilizar para extraer el m&#225;ximo conocimiento de nuestros datos&#46; La figura 1 muestra un esquema con los aspectos m&#225;s relevantes de un protocolo de experimentos con <span class="elsevierStyleItalic"> microarrays</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara"> </p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Fig&#46; 1&#46; Protocolo a seguir en un experimento de</span>  microarrays<span class="elsevierStyleItalic">y partes que componen su an&#225;lisis estad&#237;stico&#46;</span></p><p class="elsevierStylePara">&#191;Qu&#233; es un <span class="elsevierStyleItalic"> microarray</span> de ADN y c&#243;mo funciona&#63;</p><p class="elsevierStylePara">Los <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> de ADN son una herramienta que permite realizar an&#225;lisis gen&#233;ticos diversos basados en la miniaturizaci&#243;n de procesos biol&#243;gicos&#46; La primera aplicaci&#243;n de esta tecnolog&#237;a fue para medir simult&#225;neamente el nivel de expresi&#243;n de miles de genes<span class="elsevierStyleSup">1</span>&#46; Las mejoras tecnol&#243;gicas han perfeccionado la calidad y han ampliado el espectro de aplicaciones&#44; de manera que los <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> se han consolidado como herramientas &#250;tiles en investigaci&#243;n gen&#233;tica con aplicaciones en medicina<span class="elsevierStyleSup">2&#44;3</span>&#46; El funcionamiento de los <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> de expresi&#243;n se basa en la capacidad de las mol&#233;culas complementarias de ADN de hibridar entre s&#237;&#46; Peque&#241;as cantidades de ADN&#44; correspondientes a diversos genes cuya expresi&#243;n se desea medir&#44; son depositadas en una base de cristal&#46; Para ello se utilizan robots de precisi&#243;n que usan unas agujas especiales para obtener las mol&#233;culas de sus recipientes y depositarlas en las coordenadas adecuadas&#46; A estas muestras de ADN depositadas en el <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span> las denominaremos dianas&#46; En un <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span> t&#237;pico&#44; una superficie de 2 &#42; 2 cm puede contener m&#225;s de 10&#46;000 dianas en forma de peque&#241;os puntos separados adecuadamente &#40;fig&#46; 2&#41;&#46; De las c&#233;lulas que queramos medir su expresi&#243;n obtendremos una muestra de ARN que se convertir&#225; en ADN complementario &#40;ADNc&#41; y se marcar&#225; con una mol&#233;cula fluorescente&#46; A esta muestra marcada la denominaremos sonda y se enfrentar&#225; a las dianas del <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span>&#46; Cada mol&#233;cula de ADNc marcada de la sonda se mover&#225; por difusi&#243;n hacia la diana que contenga su mol&#233;cula complementaria para hibridarse con ella y quedar fijada all&#237;&#46; Despu&#233;s de un tiempo para que la mayor&#237;a de las cadenas complementarias hibriden&#44; el <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span> se lava y se procede a hacer una medici&#243;n relativa de la cantidad de ADN de la sonda que ha quedado fijada en cada diana&#46;</p><p class="elsevierStylePara"> </p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Fig&#46; 2&#46; Imagen de un</span> microarray <span class="elsevierStyleItalic">de ADNc&#46; Contiene 4&#46;608 clones depositados por duplicado en un soporte s&#243;lido&#44; que habitualmente suele ser de vidrio&#46;</span></p><p class="elsevierStylePara">Existe otra tecnolog&#237;a que emplea oligonucle&#243;tidos &#40;secuencias cortas de ADN&#44; de unas 15-30 bases&#41;<span class="elsevierStyleSup">4</span>&#46; Estos oligonucle&#243;tidos&#44; en lugar de ser depositados en el soporte mediante un robot&#44; son sintetizados directamente sobre el soporte mediante una t&#233;cnica denominada fotolitograf&#237;a que es similar a la empleada para confeccionar circuitos microelectr&#243;nicos sobre silicio&#46; Esta tecnolog&#237;a requiere una infraestructura muy sofisticada y su empleo por el momento est&#225; limitado a unas pocas empresas especializadas entre las que destaca Affymetrix&#46; Para detectar la expresi&#243;n de un gen se emplea una serie amplia de oligonucle&#243;tidos&#44; alrededor de 30&#44; por lo que estos <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> contienen muchas m&#225;s dianas&#44; lo que es factible porque la fotolitograf&#237;a permite obtener mayores densidades&#46;</p><p class="elsevierStylePara">&#191;Para qu&#233; sirven los <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> de ADN&#63;</p><p class="elsevierStylePara">Las aplicaciones de los <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> se ampl&#237;an cada d&#237;a&#44; aunque por el momento hay 3 grandes &#225;reas consolidadas&#58;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">El an&#225;lisis del nivel de expresi&#243;n g&#233;nica</span></p><p class="elsevierStylePara">Ya se ha mencionado y se explicar&#225; con mayor detalle m&#225;s adelante&#46; En estos experimentos se obtienen datos sobre el nivel de expresi&#243;n de miles de genes&#46; A partir de estos datos&#44; empleando un dise&#241;o experimental correcto y t&#233;cnicas estad&#237;sticas adecuadas&#44; se pueden realizar estudios de diagn&#243;stico y caracterizaci&#243;n de tumores u otros tejidos<span class="elsevierStyleSup">5-8</span>&#44; identificaci&#243;n de los genes que modifican su expresi&#243;n tras la administraci&#243;n de f&#225;rmacos<span class="elsevierStyleSup">9</span> o identificaci&#243;n de genes con valor pron&#243;stico<span class="elsevierStyleSup">10&#44;11</span>&#46; Tambi&#233;n se han empleado para asignar funci&#243;n a secuencias de ARN que se expresan pero cuya funci&#243;n era desconocida &#40;EST&#41; y para identificar grupos de genes que forman redes de regulaci&#243;n g&#233;nica<span class="elsevierStyleSup">12</span>&#46; Otras aplicaciones son el diagn&#243;stico de enfermedades infecciosas a partir de la detecci&#243;n del genoma del germen en tejidos<span class="elsevierStyleSup">13&#44;14</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic"> Genotipificaci&#243;n</span></p><p class="elsevierStylePara">Una muestra de ADN obtenida de un tejido o fluido&#44; adecuadamente amplificada&#44; puede ser estudiada para detectar mutaciones en genes de inter&#233;s o variantes g&#233;nicas &#40;polimorfismos en un nucle&#243;tido&#44; SNP en la terminolog&#237;a de este campo&#41;&#46; Esta metodolog&#237;a tiene usos potenciales para la detecci&#243;n de riesgo o susceptibilidad para presentar enfermedades<span class="elsevierStyleSup">15&#44;16</span>&#46; Variantes de estos <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> permiten secuenciar genes con mutaciones conocidas&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Detecci&#243;n del n&#250;mero de copias del ADN</span></p><p class="elsevierStylePara">Similar a la t&#233;cnica de hibridaci&#243;n gen&#243;mica comparada &#40;CGH&#41;&#44; se han dise&#241;ado <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> para detectar ganancias o p&#233;rdidas al&#233;licas en miles de secuencias&#44; lo que permite obtener mapas cromos&#243;micos mucho m&#225;s detallados que la CGH tradicional<span class="elsevierStyleSup">17</span>&#46; Estas t&#233;cnicas tienen inter&#233;s potencial en el estudio del pron&#243;stico de tumores&#44; ya que &#233;ste se halla asociado al nivel de da&#241;o gen&#243;mico&#46; Tambi&#233;n puede ser &#250;til para detectar nuevos oncogenes y genes supresores de tumores&#46;</p><p class="elsevierStylePara">&#191;C&#243;mo se usan los <span class="elsevierStyleItalic"> microarrays</span>de expresi&#243;n&#63;</p><p class="elsevierStylePara">Se describir&#225; en este apartado la metodolog&#237;a empleada en <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> de ADNc &#40;fig&#46; 3&#41;&#46; El objetivo del experimento es detectar genes que se expresan en un tejido&#46; El proceso se inicia con la extracci&#243;n del ARN de la muestra&#46; El ARN es muy inestable y se degrada en pocos minutos&#44; por lo que los tejidos deben ser frescos o congelados inmediatamente tras su obtenci&#243;n&#46; El ARN se convierte en ADNc mediante una transcriptasa reversa y en este proceso se marca con un fluorocromo&#44; es decir&#44; con una mol&#233;cula que posteriormente emitir&#225; luz al ser excitada mediante una luz l&#225;ser adecuada&#46;</p><p class="elsevierStylePara"> </p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Fig&#46; 3&#46; Esquema del funcionamiento de un</span> microarray<span class="elsevierStyleItalic">de ADNc&#46; De 2 muestras diferenciadas&#44; A y B&#44; se extrae el ARN&#44; que despu&#233;s ser&#225; retrotranscrito a ADNc y marcado con unos fluorocromos &#40;mol&#233;culas que emiten luz cuando son excitadas&#41;&#46; Los 2 ADNc marcados con distintos fluorocromos&#44; llamados sondas en la terminolog&#237;a de los</span> microarrays<span class="elsevierStyleItalic">&#44; se hibridan conjuntamente de manera competitiva contra un conjunto de ADNc diana depositados en un soporte de vidrio</span> &#40;microarray&#41;<span class="elsevierStyleItalic">&#44; obteni&#233;ndose as&#237; una imagen como la de la figura&#46;</span></p><p class="elsevierStylePara">La sonda de ADNc marcado&#44; que contiene una muestra de los genes que se expresan en el tejido de origen&#44; se hibridar&#225; con las secuencias diana depositadas en el <span class="elsevierStyleItalic">microarray&#44;</span> que son complementarias a las expresadas&#46; Debido a que la eficiencia del marcado puede ser variable seg&#250;n los genes&#44; y que la cantidad de ADN diana puede no ser igual de un <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span> a otro&#44; normalmente se realizan experimentos en competici&#243;n&#46; &#201;stos consisten en comparar sobre un mismo <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span> 2 muestras de ADN de tejidos diferentes&#44; cada una marcada con un fluorocromo distinto&#46; Las 2 muestras se mezclan y se hibridan simult&#225;neamente sobre el <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span>&#46; Este dise&#241;o experimental es ventajoso en cuanto que las comparaciones entre las 2 muestras de un <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span> tienen menor variabilidad que las comparaciones de muestras de diferentes <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> y tambi&#233;n se reduce a la mitad el n&#250;mero de <span class="elsevierStyleItalic"> microarrays</span> necesarios&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Una vez se ha producido la hibridaci&#243;n&#44; el <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span> se lee con un esc&#225;ner l&#225;ser y se obtienen 2 im&#225;genes&#44; una para cada fluorocromo usado&#44; con puntos de luz cuyas intensidades variar&#225;n seg&#250;n el nivel de hibridaci&#243;n que se haya producido en cada diana&#46; Estas im&#225;genes se procesan mediante un software que cuantifica la se&#241;al de cada punto &#40;diana&#41; para cada fluorocromo &#40;muestra&#41; y elabora una base de datos que ser&#225; analizada con t&#233;cnicas estad&#237;sticas&#46; Con frecuencia se elabora una imagen superpuesta de las dos en forma de seudocolor&#46; Una de las im&#225;genes se colorea en rojo y la otra en verde&#46; De esta manera&#44; los puntos amarillos tienen se&#241;al alta en las 2 muestras en cantidad similar&#46; Los puntos rojos o verdes indican que la expresi&#243;n de ese gen predomina en una de las muestras &#40;fig&#46; 2&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Dise&#241;o de experimentos</p><p class="elsevierStylePara">Como ya se ha mencionado&#44; en un <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span> de ADNc se analizan simult&#225;neamente 2 muestras&#46; Esta limitaci&#243;n no impone restricciones en el tipo de estudios que pueden realizarse&#44; pero hace necesario que se utilicen dise&#241;os adecuados&#46; Como la tecnolog&#237;a de <span class="elsevierStyleItalic"> microarrays</span> es muy cara&#44; algunos investigadores est&#225;n tentados de realizar experimentos sin r&#233;plicas&#46; De hecho&#44; existe una serie amplia de t&#233;cnicas que pretenden identificar qu&#233; genes se expresan de manera diferente en 2 tejidos a partir de un &#250;nico <span class="elsevierStyleItalic">microarray&#46;</span> Estos m&#233;todos consisten en definir un umbral en la raz&#243;n de intensidades a partir del que se considera que existe un cambio significativo&#46; El m&#233;todo m&#225;s simple emplea un valor de umbral fijo que suele ser 2&#44; es decir&#44; la se&#241;al de expresi&#243;n de un canal tiene una intensidad doble que la del otro&#46; Este m&#233;todo no se basa en criterios estad&#237;sticos e ignora por tanto la variabilidad observada en la raz&#243;n de intensidades&#46; Otros m&#233;todos que utilizan criterios estad&#237;sticos son los de Chen&#44; que define el umbral seg&#250;n la variabilidad observada<span class="elsevierStyleSup">18</span>&#59; el de Sabatti&#44; que emplea informaci&#243;n de un experimento de reproducibilidad<span class="elsevierStyleSup">19</span>&#44; y el de Newton&#44; que usa una aproximaci&#243;n bayesiana emp&#237;rica<span class="elsevierStyleSup">20</span>&#46; Hoy d&#237;a&#44; sin embargo&#44; se reconoce que los experimentos basados en un &#250;nico <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span> tienen poca validez&#44; pues los datos tienen gran variabilidad que es necesario controlar con el empleo de un n&#250;mero de r&#233;plicas y de tama&#241;os de muestra adecuados<span class="elsevierStyleSup">21-26</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Otro aspecto importante para el dise&#241;o es el tipo de control a emplear y la distribuci&#243;n de muestras entre <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span>&#46; Para aprovechar la reducci&#243;n de variabilidad en las comparaciones dentro de un <span class="elsevierStyleItalic">microarray&#44;</span> el dise&#241;o &#243;ptimo es aquel que enfrenta en un <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span> 2 muestras que interesa comparar directamente&#46; Por ejemplo&#44; en la b&#250;squeda de genes que se expresen diferencialmente en tumores respecto al tejido sano se hibridar&#225;n conjuntamente las muestras del mismo individuo &#40;fig&#46; 4a&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara"> </p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Fig&#46; 4&#46; Diferentes modelos experimentales que se pueden utilizar en los experimentos con</span> microarrays <span class="elsevierStyleItalic">de ADNc&#46; La direcci&#243;n de la flecha indica el fluorocromo con que se marca la muestra &#40;base&#58; rojo y punta verde&#41;&#46; A&#58; varias muestras apareadas de dos condiciones &#40;A&#47;B&#41;&#46; B&#58; cada muestra &#40;A&#44; B&#44; C&#41; se hibrida con una referencia com&#250;n &#40;R&#41;&#46; C&#58; dise&#241;o circular de 3 muestras&#46; D&#58; dise&#241;o factorial&#44; que permite evaluar simult&#225;neamente 2 factores como tipo de tejido &#40;A&#47;B&#41; y tratamiento &#40;1&#47;2&#41;&#46;</span></p><p class="elsevierStylePara">Si se desea comparar m&#225;s de dos condiciones entre s&#237;&#44; los dise&#241;os &#40;maneras de aparear las muestras&#41; pueden ser variados&#46; Se han utilizado con frecuencia dise&#241;os que aparean cada muestra con un patr&#243;n com&#250;n&#44; que suele ser una combinaci&#243;n de varias de ellas &#40;fig&#46; 4b&#41;&#46; Este dise&#241;o es f&#225;cil de entender y permite realizar comparaciones individuales entre las muestras&#44; pero no es &#243;ptimo&#46; Los dise&#241;os circulares &#40;fig&#46; 4c&#41; o factoriales &#40;fig&#46; 4d&#41; son m&#225;s convenientes para obtener la mejor raz&#243;n entre la varianza del error &#40;residual&#41; y el n&#250;mero de <span class="elsevierStyleItalic"> microarrays</span> empleado<span class="elsevierStyleSup">21&#44;25</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">An&#225;lisis de la imagen</p><p class="elsevierStylePara">La cuantificaci&#243;n de la se&#241;al a partir de las im&#225;genes es un proceso muy importante ya que determina los valores que posteriormente se analizar&#225;n&#46; En la actualidad existen m&#250;ltiples herramientas&#44; tanto comerciales como de libre distribuci&#243;n &#40;ScanAlyze&#44; de la Universidad de Stanford&#41;&#44; dise&#241;adas exclusivamente para analizar las im&#225;genes de <span class="elsevierStyleItalic"> microarrays</span>&#46; Las im&#225;genes a analizar suelen ser 2 archivos en formato TIFF en escala de grises de 16 bits&#44; es decir&#44; cada p&#237;xel puede tener una intensidad de se&#241;al entre 0 y 2<span class="elsevierStyleSup">16</span> &#173;1 &#40;65&#46;535&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara">El proceso de an&#225;lisis de la imagen se puede dividir en 3 etapas&#46; En primer lugar se localizan los puntos a partir de los datos que proporciona el fabricante del <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span> &#40;cu&#225;ntos puntos hay&#44; c&#243;mo est&#225;n agrupados&#44; separaci&#243;n te&#243;rica entre los centros&#41;&#46; A continuaci&#243;n se realiza la segmentaci&#243;n&#44; que consiste en identificar qu&#233; p&#237;xeles corresponden a un punto y qu&#233; p&#237;xeles son fondo&#46; Por &#250;ltimo&#44; se procede a la cuantificaci&#243;n&#44; a menudo como el promedio o la mediana de las intensidades de los p&#237;xeles que forman el punto&#46; En este apartado es importante que el software proporcione varias medidas que puedan ser empleadas como indicadores de la calidad del punto&#46; Medidas t&#237;picas son los &#237;ndices de circularidad&#44; di&#225;metro m&#225;ximo&#44; per&#237;metro&#44; homogeneidad de la se&#241;al dentro del punto&#44; etc&#46; Tambi&#233;n es necesario obtener una medida del fondo&#44; es decir&#44; el nivel de se&#241;al en los p&#237;xeles reconocidos como fuera de los puntos&#46; Este valor normalmente se sustrae de la intensidad en el punto para obtener la intensidad neta&#46; La raz&#243;n entre la se&#241;al en el punto y en el fondo tambi&#233;n es un &#237;ndice de calidad importante&#46;</p><p class="elsevierStylePara">An&#225;lisis estad&#237;stico</p><p class="elsevierStylePara">Una vez se han analizado las im&#225;genes y almacenado los datos&#44; la &#250;ltima parte del proceso consiste en realizar su an&#225;lisis estad&#237;stico&#46; Estos an&#225;lisis pueden tener diferentes objetivos y emplean t&#233;cnicas espec&#237;ficas&#58;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Control de calidad de los datos</span></p><p class="elsevierStylePara">Consiste en detectar valores incorrectos para su posterior exclusi&#243;n de los an&#225;lisis&#46; Estos valores incorrectos pueden surgir por problemas en la calidad de los experimentos o por accidentes durante su manipulaci&#243;n&#44; como rascadas en la superficie del <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span>&#46; Su detecci&#243;n puede realizarse empleando l&#237;mites de tolerancia en los indicadores de calidad del punto&#46; Es muy &#250;til que el dise&#241;o del <span class="elsevierStyleItalic"> microarray</span> incluya r&#233;plicas de una misma diana&#46; La comparaci&#243;n de las r&#233;plicas permite identificar casos discordantes &#40;fig&#46; 5&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara"> </p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Fig&#46; 5&#46; Control de calidad de la hibridaci&#243;n&#46; A&#58; diferencias de intensidad considerables entre las dos r&#233;plicas de un clon&#46; B&#58; problemas en la segmentaci&#243;n debidas a una mota de polvo en el chip&#46;</span></p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Normalizaci&#243;n de los datos</span></p><p class="elsevierStylePara">El objetivo de la normalizaci&#243;n es eliminar la variabilidad sistem&#225;tica introducida por el proceso t&#233;cnico que no est&#225; relacionada con el nivel de expresi&#243;n<span class="elsevierStyleSup">27</span>&#46; Las 2 im&#225;genes de un <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span> se obtienen por separado&#44; cada una con una longitud de onda diferente &#40;normalmente rojo y verde&#41; y una potencia que debe ajustarse de manera independiente para evitar saturaci&#243;n&#46; El ajuste independiente hace que las 2 im&#225;genes no sean comparables en cuanto a intensidad si no se normalizan previamente&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Existen m&#250;ltiples m&#233;todos para normalizar&#46; La mayor&#237;a supone que son pocos los genes que cambiar&#225;n su expresi&#243;n&#44; por lo que el promedio estimado por un m&#233;todo robusto debe centrarse&#46; El m&#233;todo m&#225;s recomendado emplea modelos de regresi&#243;n de datos suavizados mediante t&#233;cnicas no param&#233;tricas que capturen la no linealidad como el <span class="elsevierStyleItalic"> lowess</span><span class="elsevierStyleSup">28</span>&#44; dado que las diferencias entre im&#225;genes suelen tener una distribuci&#243;n variable con la intensidad<span class="elsevierStyleSup">27</span>&#46; En la figura 6a se muestran los datos de un experimento en el que el ADNc de un mismo tejido se marc&#243; con los 2 fluorocromos &#40;R y G&#41;&#46; Esperar&#237;amos que la nube de puntos se situara alrededor de la recta con pendiente 1 que pasa por el origen&#46; Puede apreciarse que la nube de puntos est&#225; desplazada por debajo de la l&#237;nea te&#243;rica y muestra una desviaci&#243;n no lineal&#46; La magnitud de la dispersi&#243;n corresponde a la variabilidad de la t&#233;cnica&#44; pues recordamos que las 2 muestras corresponden al mismo tejido&#46; Para obtener una mejor visualizaci&#243;n&#44; normalmente se transforman los valores seg&#250;n las f&#243;rmulas&#58; A &#61; log&#40;R&#42;G&#41;&#47;2 y M &#61; log&#40;R&#47;G&#41;&#46; El valor A corresponde al logaritmo de la intensidad media &#40;geom&#233;trica&#41; de los 2 colores y el M al logaritmo de la raz&#243;n de las intensidades&#46; La figura 6b muestra los mismos datos transformados&#46; La curva central a la nube de puntos muestra la estimaci&#243;n no param&#233;trica de la relaci&#243;n entre M y A&#44; obtenida por el m&#233;todo <span class="elsevierStyleItalic">lowess</span> L &#61; <span class="elsevierStyleItalic">lowess</span>&#40;A&#44;M&#41;&#46; La normalizaci&#243;n consiste simplemente en restar a cada punto la diferencia entre M y L&#46; El resultado puede apreciarse en la figura 6c&#46;</p><p class="elsevierStylePara"> </p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Fig&#46; 6&#46; Normalizaci&#243;n de las intensidades del canal rojo &#40;R&#41; y verde &#40;G&#41; obtenidos en un experimento de reproducibilidad &#40;la misma muestra marcada con diferente fluorocromo&#41;&#46; A&#58; gr&#225;fica log&#40;R&#41; frente a log&#40;G&#41;&#44; donde se aprecia menor se&#241;al en la muestra marcada con el fluorocromo rojo&#46; B&#58; gr&#225;fica M &#61; log&#40;R&#47;G&#41; frente a A &#61; log&#40;R&#42;G&#41;&#47;2 sin normalizar&#46; Es simplemente una transformaci&#243;n de la anterior donde se aprecia mejor que las diferencias siguen una curva no lineal en funci&#243;n de la intensidad&#46; C&#58; gr&#225;fica M frente a A despu&#233;s de normalizar mediante regresi&#243;n local robusta</span> &#40;lowess&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara">El modelo de normalizaci&#243;n puede incluir covariables&#44; adem&#225;s de la intensidad media&#44; de las que dependa el valor de la se&#241;al&#46; Se recomienda&#44; por ejemplo&#44; estratificar el modelo seg&#250;n la aguja del robot que produjo el <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span>&#44; o emplear informaci&#243;n espacial para eliminar posibles heterogeneidades en la intensidad de la hibridaci&#243;n en diferentes zonas del <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span> &#40;normalizaci&#243;n en 2 dimensiones&#41;&#46; Otros m&#233;todos&#44; &#250;tiles para normalizar m&#250;ltiples <span class="elsevierStyleItalic"> microarrays</span>&#44; se basan en igualar no s&#243;lo el promedio de raz&#243;n de intensidades de cada fluorocromo&#44; sino la forma de la distribuci&#243;n &#40;normalizaci&#243;n por cuantiles&#41;&#46; Este m&#233;todo se usa de forma rutinaria con <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> de oligonucle&#243;tidos y puede emplearse tambi&#233;n para los <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> de ADNc&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Tratamiento de valores perdidos</span></p><p class="elsevierStylePara">Cuando se analizan datos de m&#250;ltiples <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> puede ser importante dar un tratamiento adecuado a los valores perdidos&#46; Trabajar con los puntos con informaci&#243;n completa en todos los <span class="elsevierStyleItalic"> microarrays</span> puede suponer una p&#233;rdida importante de genes valorables&#46; A menudo se emplean t&#233;cnicas de imputaci&#243;n basadas en medias condicionales del gen respecto al conjunto de los <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> o respecto a los valores de los puntos vecinos<span class="elsevierStyleSup">29</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">An&#225;lisis de la diferencias de expresi&#243;n a nivel de ARN</span></p><p class="elsevierStylePara">Este apartado del an&#225;lisis pretende determinar qu&#233; genes var&#237;an su nivel de expresi&#243;n en funci&#243;n del tejido analizado &#40;por ejemplo&#44; normal y tumor&#41;&#46; Dado que en un experimento t&#237;pico se emplean relativamente pocos casos y se quiere investigar si existen diferencias en miles de variables &#40;genes&#41;&#44; las t&#233;cnicas estad&#237;sticas cl&#225;sicas no son adecuadas sin las correspondientes modificaciones&#46; Por un lado&#44; no puede asegurarse la normalidad de los datos que requieren las pruebas estad&#237;sticas cl&#225;sicas&#46; Por otro lado&#44; la tasa de resultados falsamente positivos puede ser muy elevada si no se emplean correcciones que tengan en cuenta la multiplicidad de hip&#243;tesis que se prueban&#46; Las soluciones propuestas para estos problemas son emplear tests de permutaciones para evaluar emp&#237;ricamente el nivel de significaci&#243;n para cada gen y&#44; posteriormente&#44; controlar la tasa global de resultados falsos positivos mediante un ajuste de los valores p que tengan en cuenta las m&#250;ltiples comparaciones realizadas&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Los tests de permutaciones construyen la distribuci&#243;n de probabilidad emp&#237;rica a partir de los propios datos mediante muestreo m&#250;ltiple<span class="elsevierStyleSup">30&#44;31</span>&#46; Se emplea un test estad&#237;stico cl&#225;sico como la t de Student u otra prueba adecuada seg&#250;n el tipo de variable o dise&#241;o de estudio&#46; Se calcula&#44; para un gen&#44; el valor del test que compara los grupos &#40;valor observado&#41;&#46; Se repite el mismo test m&#250;ltiples veces de manera que cada vez la asignaci&#243;n del grupo &#40;normal o tumor&#41; se cambia al azar&#46; De esta manera se simula la situaci&#243;n en la que no hay diferencias&#44; pues la asignaci&#243;n de cada muestra a uno u otro grupo es aleatoria&#46; Finalmente&#44; el valor p se calcula a partir del percentil que ocupa el valor observado en la distribuci&#243;n de valores obtenidos por permutaci&#243;n&#46; Con unos cientos de permutaciones suele ser suficiente para obtener el valor p&#44; pero pueden precisarse varios miles si se desea diferenciar entre valores peque&#241;os &#40;muy significativos&#41;&#46; Este proceso se repite por separado para cada gen&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Los m&#233;todos para evitar resultados falsos positivos corrigen los valores p para controlar el nivel global de significaci&#243;n&#46; Existen varios m&#233;todos&#44; desde el m&#225;s sencillo de Bonferroni&#44; que consiste en considerar significativos s&#243;lo aquellos valores p inferiores al cociente entre alfa y el n&#250;mero de tests&#46; Este m&#233;todo es muy conservador pues asume que cada test es independiente&#44; lo cual probablemente es falso en el contexto del an&#225;lisis de m&#250;ltiples genes en <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> de ADN&#44; ya que la expresi&#243;n de algunos genes puede estar correlacionada&#46; Otros m&#233;todos de control del nivel global de significaci&#243;n emplean procedimientos adaptados y tienen en cuenta la correlaci&#243;n entre tests&#46; Los m&#225;s empleados en el contexto de <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> utilizan tambi&#233;n m&#233;todos de remuestreo como el min-P y max-T<span class="elsevierStyleSup">32</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Tambi&#233;n se ha propuesto una serie de procedimientos de an&#225;lisis que se basan en m&#233;todos bayesianos puros o bayesianos emp&#237;ricos&#46; Algunos de estos procedimientos son interesantes ya que proponen que los resultados observados provienen de una mezcla de dos tipos de genes&#44; los que no cambian su expresi&#243;n &#40;la mayor&#237;a&#41; y los que cambian&#46; Para estimar qu&#233; genes pertenecen a cada grupo se emplean mixturas de distribuciones que se rigen por una serie de par&#225;metros&#46; Con frecuencia los valores de estos par&#225;metros se estiman a partir de la informaci&#243;n que aporta el propio experimento &#40;m&#233;todos bayesianos emp&#237;ricos&#41;&#44; pero otras veces los propone el investigador&#44; que puede haberlos obtenido de otros estudios &#40;m&#233;todos bayesianos puros&#41;&#46; En cualquier caso&#44; estos m&#233;todos son interesantes pues tienden a suavizar los valores extremos&#44; que suelen ser la causa de resultados falsamente positivos<span class="elsevierStyleSup">33</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Clasificaci&#243;n de muestras o genes</span></p><p class="elsevierStylePara">A partir de los genes que muestren expresi&#243;n diferencial se puede intentar buscar patrones con el objetivo de clasificar las muestras<span class="elsevierStyleSup">34-38</span>&#46; Posteriormente&#44; tras evaluar las caracter&#237;sticas de las muestras agrupadas&#44; se pueden identificar &#171;genes prototipo&#187; que definan los grupos&#46; Tambi&#233;n se pueden buscar grupos de genes que muestren un patr&#243;n de expresi&#243;n diferencial similar&#46; Esto puede ser &#250;til para asignar funci&#243;n a genes o secuencias que se expresan que hasta ahora la tienen desconocida&#46; Estos an&#225;lisis tambi&#233;n se han empleado para identificar redes de regulaci&#243;n g&#233;nica<span class="elsevierStyleSup">39&#44;40</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Existen m&#250;ltiples m&#233;todos de clasificaci&#243;n autom&#225;tica&#46; Los m&#225;s utilizados se basan en t&#233;cnicas de an&#225;lisis de conglomerados o <span class="elsevierStyleItalic">clusters</span> jer&#225;rquicos&#44; que pueden emplear diferentes distancias y algoritmos<span class="elsevierStyleSup">35</span>&#46; Estas t&#233;cnicas generan un gr&#225;fico en forma de &#225;rbol &#40;dendograma&#41; con la jerarqu&#237;a obtenida&#46; El problema suele ser decidir por d&#243;nde cortar el &#225;rbol para definir el n&#250;mero de grupos identificados&#46; Como alternativa&#44; se puede definir <span class="elsevierStyleItalic">a priori</span> el n&#250;mero de grupos que se desea identificar y usar m&#233;todos que reparten las observaciones de manera &#243;ptima entre los grupos&#46; Entre estas t&#233;cnicas se encuentran el &#171;<span class="elsevierStyleItalic">k-means</span>&#187; y los &#171;<span class="elsevierStyleItalic">Self Organizing Maps</span>&#187;<span class="elsevierStyleSup">36&#44;41</span>&#46; Otros m&#233;todos se basan en mixturas param&#233;tricas <span class="elsevierStyleItalic">&#40;</span>&#171;<span class="elsevierStyleItalic">model based clustering</span>&#187;<span class="elsevierStyleItalic">&#41;</span><span class="elsevierStyleSup">42</span>&#46; Los an&#225;lisis de <span class="elsevierStyleItalic">clusters</span> se pueden aplicar para agrupar muestras o agrupar genes&#46; Tambi&#233;n pueden realizarse las 2 agrupaciones simult&#225;neamente&#44; lo que permite interpretar m&#225;s f&#225;cilmente los resultados&#46; La figura 7 muestra una doble clasificaci&#243;n &#40;muestras en columnas y genes en filas&#41; donde se aprecian 2 grupos de muestras y 2 de genes&#46; La imagen en seudocolor muestra en rojo genes con expresi&#243;n aumentada y en verde genes con expresi&#243;n disminuida&#46; A menudo las t&#233;cnicas de <span class="elsevierStyleItalic">clusters</span> se combinan con t&#233;cnicas de reducci&#243;n de la dimensionalidad como el an&#225;lisis de componentes principales<span class="elsevierStyleSup">43</span> y la regresi&#243;n de m&#237;nimos cuadrados parciales <span class="elsevierStyleItalic">&#40;&#171;partial least squares&#187;&#41;</span><span class="elsevierStyleSup">44</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara"> </p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Fig&#46; 7&#46; An&#225;lisis de conglomerados</span>  &#40;clusters&#41; <span class="elsevierStyleItalic">de dos dimensiones para una selecci&#243;n de 449 genes de un</span> microarray&#46;<span class="elsevierStyleItalic">Los genes est&#225;n dispuestos en columnas&#46; En filas se han seleccionado las razones de intensidades de 10 experimentos comparando tejido tumoral con el tejido normal del mismo individuo&#46; Los genes con color rojo presentan una sobreexpresi&#243;n en el tumor&#44; mientras que los de tonalidad verde est&#225;n m&#225;s expresados en el tejido sano&#46;</span></p><p class="elsevierStylePara">Cuando las muestras est&#225;n caracterizadas por variables que interesa diferenciar&#44; los m&#233;todos de clasificaci&#243;n supervisada son m&#225;s eficaces&#46; Ejemplos de aplicaci&#243;n son la discriminaci&#243;n en funci&#243;n del tipo de tejido &#40;normal o tumoral&#41; o en funci&#243;n del tipo celular o pron&#243;stico&#46; Entre los m&#233;todos de clasificaci&#243;n supervisada destacan los de regresi&#243;n discriminante&#44; con m&#250;ltiples versiones &#40;lineal&#44; cuadr&#225;tica&#44; log&#237;stica&#44; etc&#46;&#41;&#44; las redes neurales&#44; los &#225;rboles&#44; etc&#46; Una excelente revisi&#243;n de estos m&#233;todos aplicados al an&#225;lisis de <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> puede encontrarse en el libro de Hastie et al<span class="elsevierStyleSup">45</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Hay una amplia disponibilidad de software de uso libre para analizar datos de <span class="elsevierStyleItalic"> microarrays</span>&#46; Merece una menci&#243;n especial el proyecto Bioconductor &#40;www&#46;bioconductor&#46;org&#41;&#44; que contiene numerosas herramientas para an&#225;lisis gr&#225;fico y estad&#237;stico basadas en el software R &#40;www&#46;r-project&#46;org&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Discusi&#243;n</p><p class="elsevierStylePara">Los <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> para an&#225;lisis gen&#233;ticos se est&#225;n consolidando como una tecnolog&#237;a &#250;til&#44; a pesar de que es relativamente reciente y todav&#237;a adolece de limitaciones t&#233;cnicas como una gran variabilidad&#46; La tecnolog&#237;a mejora d&#237;a a d&#237;a&#44; por lo que los problemas de escasa reproducibilidad se solventar&#225;n a corto plazo&#46;</p><p class="elsevierStylePara">El campo que ha recibido con mayor entusiasmo esta tecnolog&#237;a es la oncolog&#237;a&#44; donde ya se han publicado interesantes resultados en cuanto a clasificaci&#243;n molecular y predicci&#243;n de pron&#243;stico en varios tumores<span class="elsevierStyleSup">5-7&#44;37&#44;46&#44;47</span>&#46; Las aplicaciones a otros campos de la medicina como cardiolog&#237;a<span class="elsevierStyleSup">48</span>&#44; neumolog&#237;a<span class="elsevierStyleSup">49</span> o reumatolog&#237;a<span class="elsevierStyleSup">50</span>&#44; entre otras&#44; tambi&#233;n son prometedoras&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Uno de los principales retos que afronta esta tecnolog&#237;a es evitar un excesivo entusiasmo en el momento de reportar resultados para evitar frustraciones por falsos positivos&#46; Cada experimento con <span class="elsevierStyleItalic"> microarrays</span> eval&#250;a miles de hip&#243;tesis simult&#225;neamente&#44; por lo que un an&#225;lisis ligero&#44; sin las debidas correcciones estad&#237;sticas&#44; puede generar resultados falsamente significativos&#46; La identificaci&#243;n de se&#241;ales interesantes en un <span class="elsevierStyleItalic">microarray</span> debe ser verificada con otras t&#233;cnicas y&#44; como en otros campos del conocimiento&#44; es necesario que experimentos en muestras independientes repliquen los resultados antes de adoptarlos como v&#225;lidos&#46; Por el momento los <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> se utilizan fundamentalmente en investigaci&#243;n&#44; pero dentro de poco aparecer&#225;n aplicaciones cl&#237;nicas para diagn&#243;stico o evaluaci&#243;n de riesgo&#46;</p><p class="elsevierStylePara"> Agradecimientos</p><p class="elsevierStylePara">Esta revisi&#243;n recoge la experiencia de la Unidad de Bioestad&#237;stica y Bioinform&#225;tica del Instituto Catal&#225;n de Oncolog&#237;a en colaboraci&#243;n con el Grupo de Microarrays de ADN del Instituto&#44; que investiga en aplicaciones de los <span class="elsevierStyleItalic">microarrays</span> al estudio del diagn&#243;stico y pron&#243;stico del c&#225;ncer colorrectal&#46; Los investigadores del grupo son G&#46; Capell&#224;&#44; M&#46;A&#46; Peinado&#44; M&#46; Grau&#44; E&#46; Vendrell&#44; A&#46; Obrador&#44; G&#46; Tarafa&#44; E&#46; Guin&#243;&#44; J&#46; Valls&#44; X&#46; Sol&#233; y V&#46; Moreno&#46; El grupo cuenta con financiaci&#243;n del Fondo de Investigaciones Sanitarias &#40;FIS 96&#47;0797&#44; FIS 00&#47;0027&#44; FIS 01&#47;1264&#41; y de la CICYT &#40;SAF 99&#47;0103&#44; SAF 00&#47;81-C2&#41;&#46; Este grupo es miembro de las Redes de Tem&#225;ticas de Investigaci&#243;n Cooperativa en C&#225;ncer &#40;C03&#47;10&#41; y en Epidemiolog&#237;a y Salud P&#250;blica &#40;C03&#47;09&#41;&#44; financiadas por el Instituto Carlos III&#44; Ministerio de Sanidad y Consumo&#46; </p>"
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Información del artículo

ISSN: 00257753
Idioma original: Español

Datos actualizados diariamente

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2024 Noviembre	114	11	125
2024 Octubre	3481	298	3779
2024 Septiembre	2346	156	2502
2024 Agosto	1567	147	1714
2024 Julio	1565	97	1662
2024 Junio	1563	209	1772
2024 Mayo	1951	210	2161
2024 Abril	2039	260	2299
2024 Marzo	1511	122	1633
2024 Febrero	1692	162	1854
2024 Enero	1755	99	1854
2023 Diciembre	1101	110	1211
2023 Noviembre	2057	222	2279
2023 Octubre	1904	270	2174
2023 Septiembre	1200	141	1341
2023 Agosto	994	69	1063
2023 Julio	1196	103	1299
2023 Junio	1009	124	1133
2023 Mayo	2313	295	2608
2023 Abril	1392	297	1689
2023 Marzo	1743	264	2007
2023 Febrero	1088	176	1264
2023 Enero	815	360	1175
2022 Diciembre	785	226	1011
2022 Noviembre	1567	315	1882
2022 Octubre	1321	309	1630
2022 Septiembre	981	216	1197
2022 Agosto	1027	350	1377
2022 Julio	801	246	1047
2022 Junio	743	136	879
2022 Mayo	1386	214	1600
2022 Abril	960	207	1167
2022 Marzo	1031	166	1197
2022 Febrero	786	123	909
2022 Enero	496	118	614
2021 Diciembre	430	109	539
2021 Noviembre	772	192	964
2021 Octubre	725	111	836
2021 Septiembre	484	120	604
2021 Agosto	1009	75	1084
2021 Julio	558	68	626
2021 Junio	436	64	500
2021 Mayo	388	66	454
2021 Abril	596	158	754
2021 Marzo	347	102	449
2021 Febrero	336	37	373
2021 Enero	215	28	243
2020 Diciembre	217	65	282
2020 Noviembre	247	62	309
2020 Octubre	55	18	73
2018 Marzo	1	0	1
2017 Octubre	34	3	37
2017 Septiembre	30	4	34
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2017 Julio	38	1	39
2017 Junio	37	13	50
2017 Mayo	37	13	50
2017 Abril	57	18	75
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2017 Febrero	179	14	193
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2016 Noviembre	85	11	96
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2016 Agosto	49	5	54
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2016 Junio	86	14	100
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2015 Julio	31	7	38
2015 Junio	46	5	51
2015 Mayo	45	20	65
2015 Abril	58	9	67
2015 Marzo	48	16	64
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2014 Noviembre	74	3	77
2014 Octubre	41	4	45
2014 Septiembre	36	2	38
2014 Agosto	102	6	108
2014 Julio	84	5	89
2014 Junio	102	3	105
2014 Mayo	88	2	90
2014 Abril	57	10	67
2014 Marzo	61	5	66
2014 Febrero	59	2	61
2014 Enero	75	2	77
2013 Diciembre	71	5	76
2013 Noviembre	116	8	124
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