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Hipermetilación del promotor del gen reparador hMLH1 en la patogenia del carcinoma de células renales esporádico
Promoter hypermethylation status of the mismatch repair gene hMLH1 in patients with sporadic renal cell carcinoma
Antonio S Salinas-Sáncheza, Antonio Rubio-del-Campob, Francisco Sánchez-Sáncheza, José M Giménez-Bachsa, María J Donate-Morenoa, Dolores C García-Olmob, Julio Escribano-Martíneza
a Área de Genética. Facultad de Medicina/CRIB. Universidad de Castilla-La Mancha. Albacete. España.
b Unidad de Investigación. Complejo Hospitalario y Universitario de Albacete. Albacete.
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Un ejemplo conocido de esta situaci&#243;n son las alteraciones de los genes reparadores MMR <span class="elsevierStyleItalic">&#40;mismatch repair genes&#41;</span>&#44; en concreto&#44; del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span>&#46; Este gen se ha estudiado ampliamente en los casos de c&#225;ncer de colon hereditario no polipoideo<span class="elsevierStyleSup">4</span>&#44; en el que la hipermetilaci&#243;n representa la causa m&#225;s frecuente de inactivaci&#243;n epigen&#233;tica y guarda&#44; adem&#225;s&#44; una estrecha relaci&#243;n con la presencia de inestabilidad de microsat&#233;lites<span class="elsevierStyleSup">5</span>&#46; Este fen&#243;meno tambi&#233;n se ha comprobado en otros tipos de tumores<span class="elsevierStyleSup">6-8</span> y&#44; aunque se ha descrito&#44; est&#225; por determinar su importancia en los casos de c&#225;ncer de colon espor&#225;dico<span class="elsevierStyleSup">9</span>&#46; La inactivaci&#243;n por hipermetilaci&#243;n del promotor del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> tambi&#233;n se ha implicado en la progresi&#243;n tumoral y en la respuesta a quimioter&#225;picos<span class="elsevierStyleSup">7</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">El carcinoma de c&#233;lulas renales &#40;CCR&#41; es un tumor heterog&#233;neo desde el punto de vista histol&#243;gico&#44; gen&#233;tico y de comportamiento cl&#237;nico&#46; Sus alteraciones gen&#233;ticas m&#225;s frecuentes son las deleciones del brazo corto del cromosoma 3 &#40;3p11-3p25&#41;&#44; tanto en casos espor&#225;dicos como familiares<span class="elsevierStyleSup">10</span>&#46; En cuanto a los genes analizados en el CCR&#44; el m&#225;s estudiado ha sido el gen supresor <span class="elsevierStyleItalic">VHL</span>&#44; en el que se detectan alteraciones en un 30-57&#37; de los casos<span class="elsevierStyleSup">11&#44;12</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">La relaci&#243;n entre los genes MMR y el CCR apenas se ha estudiado&#44; a pesar de que existen indicios de que las alteraciones en estos genes podr&#237;an desempe&#241;ar un papel importante en la carcinog&#233;nesis del CCR&#46; En estos estudios se ha comprobado en l&#237;neas celulares de CCR una disminuci&#243;n de la expresi&#243;n de ARNm tanto de <span class="elsevierStyleItalic"> hMLH1</span> como <span class="elsevierStyleItalic">hMSH3</span><span class="elsevierStyleSup">13</span>&#44; adem&#225;s de encontrarse fen&#243;menos de hipermetilaci&#243;n en algunas de ellas<span class="elsevierStyleSup">14</span>&#46; Bas&#225;ndonos en estos datos nos planteamos determinar la existencia de alteraciones epigen&#233;ticas por hipermetilaci&#243;n en la regi&#243;n promotora del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> en pacientes con CCR espor&#225;dico&#44; as&#237; como sus posibles implicaciones pron&#243;sticas&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Material y m&#233;todo</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Muestras</span></p><p class="elsevierStylePara">Se han analizado muestras de tejido tumoral procedentes de 65 pacientes diagnosticados de forma consecutiva de CCR espor&#225;dico y tratados quir&#250;rgicamente en el Complejo Hospitalario Universitario de Albacete&#46; El diagn&#243;stico y la estadificaci&#243;n de los pacientes se realizaron seg&#250;n el protocolo establecido por la comunidad urol&#243;gica&#44; utiliz&#225;ndose la clasificaci&#243;n TNM para el estadio tumoral y la de Furhman para el grado de diferenciaci&#243;n celular&#46; Tras solicitar su consentimiento por escrito para participar en el estudio&#44; se obtuvieron de las historias cl&#237;nicas los datos correspondientes a edad&#44; sexo&#44; cl&#237;nica de inicio y caracter&#237;sticas patol&#243;gicas&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Una vez recogidas&#44; las muestras se congelaron a &#173;80 &#176;C hasta su procesamiento&#46; Para la obtenci&#243;n y purificaci&#243;n del ADN gen&#243;mico tumoral se utiliz&#243; el equipo comercial KIAamp DNA mini kit &#40;Qiagen<span class="elsevierStyleSup">&#174;</span>&#41;&#44; siguiendo las instrucciones del fabricante&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Digestiones de ADN con enzimas de restricci&#243;n</span></p><p class="elsevierStylePara">Se realizaron 2 digestiones independientes de cada una de las muestras de ADN empleando las enzimas de restricci&#243;n <span class="elsevierStyleItalic">Hpa</span>II y <span class="elsevierStyleItalic">Msp</span>I&#46; Ambas enzimas reconocen la secuencia CCGG&#44; aunque <span class="elsevierStyleItalic">Hpa</span>II no digiere la diana de restricci&#243;n cuando la citosina presente en el dinucle&#243;tido CG est&#225; metilada&#46; Las reacciones se realizaron durante 16 h a 37 &#176;C en un volumen de 20 &#181;l&#44; y se emplearon en cada una de ellas 400 ng de ADN y 20 U de enzima&#46; El producto de digesti&#243;n se emple&#243; como molde para llevar a cabo diferentes reacciones de amplificaci&#243;n &#173;reacci&#243;n en cadena de la polimerasa &#40;PCR&#41;&#173;&#46; Como control negativo del estado de metilaci&#243;n del promotor del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> se utiliz&#243; ADN procedente de sangre venosa perif&#233;rica de 2 individuos sanos&#44; y como control positivo&#44; el mismo ADN tratado con la metilasa <span class="elsevierStyleItalic">Hpa</span>II&#46; Como control positivo adicional se utiliz&#243; ADN de la l&#237;nea celular 293T procedente de tejido renal humano&#44; caracterizada por tener inactivado por metilaci&#243;n el promotor del gen <span class="elsevierStyleItalic"> hMLH1</span><span class="elsevierStyleSup">15</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Reacci&#243;n en cadena de la polimerasa</span></p><p class="elsevierStylePara">En la regi&#243;n promotora del gen <span class="elsevierStyleItalic"> hMLH1</span> existen 4 sitios CCGG&#44; en las posiciones S1 &#40;&#173;567&#41;&#44; S2 &#40;&#173;527&#41;&#44; S3 &#40;&#173;347&#41; y S4 &#40;&#173;341&#41; &#40;fig&#46; 1&#41;&#46; Los sitios S1 y S2 se amplificaron en reacciones independientes&#44; mientras que los sitios S3 y S4 se amplificaron conjuntamente&#46; Se realizaron 3 reacciones de amplificaci&#243;n de cada uno de estos sitios empleando ADN molde digerido independientemente con las enzimas de restricci&#243;n <span class="elsevierStyleItalic">Hpa</span>II y <span class="elsevierStyleItalic">Msp</span>I y el mismo ADN molde sin digerir&#46; El volumen total de cada reacci&#243;n fue de 25 &#181;l y conten&#237;a 100 ng de ADN&#44; dNTPs &#40;200 &#181;mol&#41;&#44; ADN <span class="elsevierStyleItalic">Taq</span> polimerasa &#40;0&#44;5 U&#41; &#40;Biotools<span class="elsevierStyleSup">&#174;</span>&#41; y cebadores &#40;400 nmol&#41;&#46; La temperatura de hibridaci&#243;n fue de 58 &#176;C en todos los casos y se emplearon 25 ciclos de amplificaci&#243;n<span class="elsevierStyleSup">16</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><img src="2v126n12-13086325tab01.gif"></img></p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Fig&#46; 1&#46; Localizaci&#243;n de los 4 sitios de metilaci&#243;n estudiados en el promotor del gen</span> hMLH1<span class="elsevierStyleItalic">&#46; Las flechas del mismo color indican la localizaci&#243;n de los cebadores empleados para amplificar cada uno de los fragmentos que contienen en su interior un sitio metilable&#44; nombrados como S1&#44; S2&#44; S3 y S4&#46; El n&#250;mero entre par&#233;ntesis indica la posici&#243;n de cada sitio en el promotor&#46;</span></p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Electroforesis en gel de agarosa</span></p><p class="elsevierStylePara">Los productos de amplificaci&#243;n se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2&#37; y se detectaron mediante bromuro de etidio&#46; Las bandas obtenidas se fotografiaron con un sistema de fotodocumentaci&#243;n &#40;GelDoc-it Imaging System UVP&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">An&#225;lisis densitom&#233;trico</span></p><p class="elsevierStylePara">Se us&#243; el programa Quantity One 4&#44;1 &#40;Bio-rad&#41; para cuantificar cada uno de los fragmentos amplificados por PCR&#46; Se determin&#243; el porcentaje del amplic&#243;n obtenido despu&#233;s de digerir el ADN tumoral con la enzima <span class="elsevierStyleItalic"> Hpa</span>II&#44; respecto al mismo amplic&#243;n obtenido sin digesti&#243;n previa del ADN &#40;control positivo de la PCR&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Resultados</span></p><p class="elsevierStylePara">La edad media de los pacientes analizados en el presente estudio fue de 63&#44;7 a&#241;os &#40;intervalo de confianza del 95&#37;&#44; 61&#44;2-66&#44;3&#41; y 43 &#40;66&#44;3&#37;&#41; eran varones&#46; El hallazgo incidental al realizar estudios radiol&#243;gicos abdominales fue la causa de diagn&#243;stico m&#225;s frecuente &#40;56&#44;9&#37;&#41;&#46; En los casos en que hubo cl&#237;nica indicativa de tumor renal&#44; la cl&#237;nica m&#225;s frecuente fue la hematuria &#40;16&#44;9&#37;&#41;&#46; En un solo caso el tumor fue bilateral y en 2 fue m&#250;ltiple&#46; Se realizaron nefrectom&#237;as radicales en 45 casos &#40;69&#44;2&#37;&#41; y en los 20 restantes se efectu&#243; cirug&#237;a conservadora electiva de par&#233;nquima renal&#46; En la tabla 1 se describen las caracter&#237;sticas anatomopatol&#243;gicas de los pacientes&#46; El tipo celular m&#225;s frecuente fue el carcinoma de c&#233;lulas claras&#44; con 44 casos &#40;67&#44;7&#37;&#41;&#46; Un 73&#44;9&#37; de los casos se diagnosticaron en estadios inferiores a pT2&#59; presentaban afectaci&#243;n ganglionar en el momento del diagn&#243;stico 6 pacientes &#40;9&#44;3&#37;&#41;&#44; y met&#225;stasis a distancia&#44; 13 &#40;20&#37;&#41;&#46; El 61&#37; tuvo un grado celular de Furhman inferior a 2&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><img src="2v126n12-13086325tab02.gif"></img></p><p class="elsevierStylePara">El an&#225;lisis de metilaci&#243;n del promotor del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> &#40;fig&#46; 2A&#41; mostr&#243; en todos los pacientes analizados un patr&#243;n de amplificaci&#243;n similar al obtenido con ADN de sangre de individuos sanos&#44; empleado como control negativo de metilaci&#243;n &#40;fig&#46; 2B&#41;&#46; Adem&#225;s&#44; el patr&#243;n observado en las muestras de los pacientes fue distinto del obtenido con los controles positivos de metilaci&#243;n &#40;ADN tratado con metilasa y ADN procedente de la l&#237;nea celular 293T&#59; figs&#46; 2C y 2D&#44; respectivamente&#41;&#46; Estos resultados muestran que los sitios S1-S4 de la regi&#243;n promotora del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> no est&#225;n metilados en los pacientes analizados&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><img src="2v126n12-13086325tab03.gif"></img></p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Fig&#46; 2&#46; An&#225;lisis del estado de metilaci&#243;n del promotor del gen</span> hMLH1<span class="elsevierStyleItalic">&#46; Se indica en cada calle del gel la enzima con la que se digiri&#243; el ADN molde&#46; El control positivo &#40;C&#43;&#41; de la reacci&#243;n en cadena de la polimerasa se realiz&#243; con ADN sin digerir&#44; y el control negativo &#40;C&#173;&#41; no incluy&#243; ADN&#46; Ejemplo representativo &#40;A&#41; obtenido a partir de uno de los tumores analizados en este estudio y control negativo de metilaci&#243;n &#40;B&#41;&#44; realizado con ADN gen&#243;mico purificado a partir de sangre de individuos sanos&#46; Como controles positivos de metilaci&#243;n se emple&#243; ADN previamente metilado con la enzima</span> HpaII <span class="elsevierStyleItalic">metilasa &#40;C&#41; y ADN de la l&#237;nea celular 293T&#44; en la que el promotor del gen</span> hMLH1 <span class="elsevierStyleItalic">se encuentra inactivado por metilaci&#243;n &#40;D&#41;&#46; M&#58; marcador de tama&#241;o molecular&#59; pb&#58; pares de bases&#46;</span></p><p class="elsevierStylePara">En 12 muestras &#40;18&#44;5&#37;&#41; se observaron productos de amplificaci&#243;n de intensidad d&#233;bil despu&#233;s de la digesti&#243;n con <span class="elsevierStyleItalic">Hpa</span>II&#46; Estos casos no presentaron ninguna caracter&#237;stica anatomopatol&#243;gica distinta del resto&#46; Al realizar un an&#225;lisis densitom&#233;trico de los amplicones&#44; se comprob&#243; que su intensidad respecto a la de su control positivo &#40;ADN sin digerir&#41; no alcanz&#243; en ning&#250;n caso el 50&#37;&#44; porcentaje esperable en un estado de metilaci&#243;n monoal&#233;lica&#59; la media se encontraba en el 12&#44;8&#37; &#40;intervalo de confianza del 95&#37;&#44; 9&#44;8-15&#44;85&#59; extremos&#58; 5-22&#37;&#41;&#46; Hallazgos similares se registraron en los estudios que se realizaron con ADN gen&#243;mico de sangre de individuos controles sanos &#40;ADN no metilado&#41;&#44; lo que indica la existencia de digesti&#243;n incompleta con la enzima <span class="elsevierStyleItalic">Hpa</span>II&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Discusi&#243;n</span></p><p class="elsevierStylePara">Estudios previos han mostrado que el CCR puede estar relacionado con la hipermetilaci&#243;n de una amplia variedad de genes&#44; como&#44; por ejemplo&#58; <span class="elsevierStyleItalic">CDH1&#44; APC&#44; MGMT&#44; RASSF1A&#44; GSTP1&#44; p16&#44; RAR-beta2&#44; ARF</span><span class="elsevierStyleSup">17</span>&#44; <span class="elsevierStyleItalic">Timp-3&#44; VHL</span><span class="elsevierStyleSup">18</span> y el gen de la E-caderina<span class="elsevierStyleSup">15</span>&#46; Estos trabajos han evidenciado la presencia de hipermetilaci&#243;n en uno o m&#225;s de estos genes en un 93&#37; de los casos&#59; el gen hipermetilado m&#225;s frecuentemente es el <span class="elsevierStyleItalic">Timp-3</span> &#40;58&#37;&#41;&#46; Incluso se ha comprobado que el tratamiento de algunas l&#237;neas celulares con 5-aza-2&#39;-deoxicitidina &#40;agente desmetilante&#41; restaur&#243; la expresi&#243;n del ARNm del gen E-caderina<span class="elsevierStyleSup">19</span> y del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span><span class="elsevierStyleSup">20</span>&#46; Por el contrario&#44; otros estudios no han evidenciado diferencias en la expresi&#243;n de <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> y <span class="elsevierStyleItalic">hMSH3</span> en l&#237;neas celulares de CCR tratadas con este agente<span class="elsevierStyleSup">13</span>&#46; En cuanto al gen <span class="elsevierStyleItalic">VHL</span>&#44; la hipermetilaci&#243;n de su promotor &#250;nicamente aparece en el CCR de tipo c&#233;lulas claras<span class="elsevierStyleSup">18</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Hasta donde sabemos&#44; el presente estudio analiza por primera vez la relaci&#243;n entre la hipermetilaci&#243;n del promotor del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> y el CCR espor&#225;dico empleando muestras de tejido tumoral humano&#46; Concretamente&#44; centramos nuestro estudio en el gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span>&#44; ya que no se ha demostrado hipermetilaci&#243;n en el promotor de otros genes MMR como <span class="elsevierStyleItalic"> hMSH2</span><span class="elsevierStyleSup">20</span>&#46; Con una t&#233;cnica basada en el uso de enzimas de restricci&#243;n no hemos detectado metilaci&#243;n bial&#233;lica en el gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> en ninguna de las 65 muestras analizadas&#44; lo que coincide con datos publicados en estudios previos con l&#237;neas celulares de CCR<span class="elsevierStyleSup">14</span>&#46; Aunque existen diferentes t&#233;cnicas de an&#225;lisis del estado de metilaci&#243;n &#40;basadas&#44; por ejemplo&#44; en la modificaci&#243;n del ADN mediante tratamiento con bisulfito&#41;&#44; requieren mayor cantidad de ADN y presentan mayor complejidad metodol&#243;gica que la empleada en el presente estudio&#46; Adem&#225;s&#44; la t&#233;cnica basada en digestiones enzim&#225;ticas es r&#225;pida&#44; sencilla y fiable<span class="elsevierStyleSup">21</span>&#46; La presencia de un producto de amplificaci&#243;n minoritario en algunos de los ADN digeridos con <span class="elsevierStyleItalic">Hpa</span>II puede deberse tanto a digesti&#243;n parcial como a metilaci&#243;n monoal&#233;lica&#46; El an&#225;lisis llevado a cabo sobre ADN gen&#243;mico purificado a partir de muestras de sangre de individuos sanos&#44; en los que el promotor del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> no est&#225; metilado&#44; mostr&#243; tambi&#233;n la existencia de una banda que representa aproximadamente el 10&#37; de la obtenida cuando no se digiere el ADN previamente a la amplificaci&#243;n&#46; Este resultado indica que la banda minoritaria es el resultado de una digesti&#243;n incompleta del ADN por la enzima <span class="elsevierStyleItalic">Hpa</span>II&#44; ya que&#44; si se tratara de metilaci&#243;n monoal&#233;lica&#44; deber&#237;a representar aproximadamente el 50&#37; de la banda control&#46;</p><p class="elsevierStylePara">En conclusi&#243;n&#44; nuestros resultados indican que la metilaci&#243;n del promotor del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> no est&#225; implicada en la patogenia del CCR espor&#225;dico&#46; Por tanto&#44; es necesario analizar la existencia de mutaciones en otros genes&#44; la presencia de inestabilidad de microsat&#233;lites o de p&#233;rdida de heterocigosis para determinar si la alteraci&#243;n de los genes MMR desempe&#241;a alg&#250;n papel en la patogenia del CCR&#46;</p>"
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Información del artículo
ISSN: 00257753
Idioma original: Español
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