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Informe breve
Efecto inhibitorio de Lactobacillus spp. sobre bacterias implicadas en enfermedades transmitidas por alimentos
Inhibitory capacity of Lactobacillus spp. against pathogens involved in foodborne diseases
María J. Ruiz, Rocío Colello, Nora L. Padola
Autor para correspondencia
nlpadola@vet.unicen.edu.ar

Autor para correspondencia.
, Analía I. Etcheverría
Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología, Centro de Investigación Veterinaria Tandil CONICET-CICPBA, Facultad de Ciencias Veterinarias, UNCPBA, Tandil, Buenos Aires, Argentina
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    "textoCompleto" => "<span class="elsevierStyleSections"><p id="par0005" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las enfermedades transmitidas por alimentos &#40;ETA&#41; constituyen un problema sanitario y econ&#243;mico de relevancia mundial&#46; Millones de personas enferman y muchas mueren por consumir alimentos insalubres&#46; Los estados miembros de la Organizaci&#243;n Mundial de la Salud &#40;OMS&#41; adoptaron en el a&#241;o 2000 una recomendaci&#243;n en la cual se reconoce el papel fundamental de la inocuidad alimentaria para la salud p&#250;blica&#44; ello implica la adopci&#243;n de acciones encaminadas a garantizar la m&#225;xima seguridad posible de los alimentos&#46; Las pol&#237;ticas y actividades que persiguen dicho fin deber&#225;n abarcar toda la cadena alimentaria&#44; desde la producci&#243;n hasta el consumo<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0150"><span class="elsevierStyleSup">15</span></a>&#46; Se consideran ETA todas aquellas enfermedades causadas por la ingesti&#243;n de agua o alimentos contaminados que provocan un efecto nocivo en la salud del consumidor&#44; o de un grupo de consumidores&#44; en forma aguda o cr&#243;nica&#46; Pueden ser causadas por pat&#243;genos&#44; sustancias qu&#237;micas o par&#225;sitos que contaminan los alimentos en distintos puntos de la cadena de producci&#243;n&#46;</p><p id="par0010" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las bacterias generalmente implicadas en ETA corresponden a las especies <span class="elsevierStyleItalic">Staphylococcus aureus&#44; Escherichia coli</span>&#44; y <span class="elsevierStyleItalic">Listeria monocytogenes</span> o a los g&#233;neros <span class="elsevierStyleItalic">Salmonella&#44; Campylobacter</span> y <span class="elsevierStyleItalic">Shigella</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0145"><span class="elsevierStyleSup">14</span></a>&#46;</p><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">E&#46; coli</span> es habitante normal de los intestinos de la mayor parte de los mam&#237;feros sanos&#44; donde se comporta como comensal e integra la flora intestinal<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0100"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a>&#46; La franja etaria m&#225;s vulnerable a enfermar por este potencial pat&#243;geno incluye a ni&#241;os entre uno y 8 a&#241;os&#46; La contaminaci&#243;n de los alimentos asociada a una deficiente cocci&#243;n es generalmente la causa de estas ETA<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0130"><span class="elsevierStyleSup">11</span></a>&#46; <span class="elsevierStyleItalic">Salmonella</span> spp&#46; es un agente productor de zoonosis cuyo h&#225;bitat natural normalmente es el tracto gastrointestinal de los mam&#237;feros y las aves<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0080"><span class="elsevierStyleSup">1</span></a>&#46; Se transmite por contacto directo o contaminaci&#243;n cruzada durante la manipulaci&#243;n y el procesado de los alimentos&#44; en el hogar o a trav&#233;s del agua<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0090"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a>&#46; <span class="elsevierStyleItalic">S&#46; aureus</span> es&#44; dentro de su familia&#44; la especie que causa mayor cantidad de infecciones en el ser humano&#46; Suele estar presente en la piel y en las membranas mucosas&#44; sin causar infecci&#243;n&#46; La intoxicaci&#243;n en el hombre se produce por la multiplicaci&#243;n y producci&#243;n de enterotoxinas termorresistentes en los alimentos consumidos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0110"><span class="elsevierStyleSup">7</span></a>&#46;</p><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En la cadena de producci&#243;n de alimentos existen riesgos de infecci&#243;n por pat&#243;genos&#44; por lo que se necesita un control microbiol&#243;gico estricto para impedir que estos lleguen al consumidor&#46; Para inactivar estas bacterias se han estudiado diversas estrategias&#44; como por ejemplo&#44; sistemas de biopreservaci&#243;n&#44; tecnolog&#237;as no t&#233;rmicas o combinaciones de aquellas&#46; El empleo de bacterias &#225;cido l&#225;cticas &#40;BAL&#41; o de sus metabolitos son ejemplos de tratamientos de biopreservaci&#243;n&#46;</p><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las BAL son consideradas seguras y se utilizan en muchos pa&#237;ses en la producci&#243;n de alimentos fermentados&#46; Por esta raz&#243;n son sumamente atractivas como herramientas para controlar el crecimiento de pat&#243;genos en una gran variedad de alimentos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0120"><span class="elsevierStyleSup">9</span></a>&#46; Por lo general&#44; las cepas empleadas para el desarrollo de alimentos probi&#243;ticos son aisladas de humanos&#44; ya que poseen mayor posibilidad de adherirse y colonizar el epitelio intestinal&#46; Sin embargo&#44; se ha demostrado que cepas de origen animal tambi&#233;n poseen efectos favorables en el organismo humano<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0105"><span class="elsevierStyleSup">6</span></a>&#46;</p><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Desde la antig&#252;edad y hasta hoy&#44; este grupo de bacterias ha sido de gran utilidad biotecnol&#243;gica en el &#225;rea de los alimentos&#46; La biopreservaci&#243;n de alimentos por medio de bacteriocinas producidas por bacterias del g&#233;nero <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span> ha resultado exitosa en alimentos como la carne&#44; para el control de ciertos microorganismos pat&#243;genos&#44; entre ellos <span class="elsevierStyleItalic">Salmonella</span> spp&#46; y <span class="elsevierStyleItalic">E&#46; coli</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0115"><span class="elsevierStyleSup">8</span></a>&#46;</p><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En los &#250;ltimos a&#241;os&#44; las BAL se han aplicado como probi&#243;ticos debido a su capacidad de controlar la microbiota intestinal y a su acci&#243;n para evitar la colonizaci&#243;n y el crecimiento de bacterias pat&#243;genas en el tracto gastrointestinal<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0115"><span class="elsevierStyleSup">8</span></a>&#46; Las BAL se caracterizan por la producci&#243;n de sustancias antimicrobianas &#40;&#225;cidos l&#225;ctico y ac&#233;tico&#44; metabolitos&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0110"><span class="elsevierStyleSup">7</span></a> y de numerosas bacteriocinas&#44; en las cuales se fundamenta su potente acci&#243;n probi&#243;tica&#44; antimicrobiana y bioconservadora<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0090"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a>&#46; De esta manera&#44; cumplen un importante papel en los procesos de bioconservaci&#243;n de la industria alimentaria<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0145"><span class="elsevierStyleSup">14</span></a>&#46;</p><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Teniendo en cuenta la importancia de la capacidad inhibitoria de <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span> spp&#46; sobre bacterias productoras de ETA y el impacto de estas enfermedades en la salud p&#250;blica&#44; el objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad inhibitoria de cepas de origen porcino de este g&#233;nero sobre bacterias pat&#243;genas asociadas a ETA como <span class="elsevierStyleItalic">E&#46; coli</span>&#44; <span class="elsevierStyleItalic">Salmonella</span> spp&#46; y <span class="elsevierStyleItalic">S&#46; aureus</span>&#46;</p><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se realizaron muestreos en distintos establecimientos abarcando diferentes etapas de la cadena productiva de carne porcina&#44; seg&#250;n el Reglamento &#40;UE&#41; N&#46;<span class="elsevierStyleSup">o</span> 209&#47;2013 de la Comisi&#243;n del 11 de marzo de 2013&#44; que modifica el Reglamento &#40;CE&#41; N&#46;<span class="elsevierStyleSup">o</span> 2073&#47;2005 y la Circular 3579 de SENASA N&#46;<span class="elsevierStyleSup">o</span> 3496&#47;02 y Anexo II&#46; Se tomaron 39 muestras&#58; 11 de materia fecal porcina en criadero&#44; 5 hisopados de reses en su sala de recepci&#243;n&#44; 5 hisopados en cortes de c&#225;mara de desposte&#44; 11 de sala de elaboraci&#243;n de embutidos y 7 de boca de expendio&#46;</p><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las muestras de carne y los hisopos fueron cultivados en caldo MRS durante 24<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h en anaerobiosis&#46; Estas suspensiones se sembraron en placas con MRS agar y se incubaron a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 48<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h en anaerobiosis&#46; Se seleccionaron 2 colonias caracter&#237;sticas por placa&#44; las que se sometieron a un primer <span class="elsevierStyleItalic">screening</span> mediante tinci&#243;n de Gram&#44; observaci&#243;n de movilidad y reacci&#243;n de catalasa&#59; estas se conservaron a &#8211;70<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C con glicerol para su posterior identificaci&#243;n y caracterizaci&#243;n&#46;</p><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para la identificaci&#243;n de las colonias seleccionadas se puso a punto la t&#233;cnica de PCR utilizando los <span class="elsevierStyleItalic">primers</span> que amplifican regiones espec&#237;ficas del g&#233;nero <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus&#46;</span> Los <span class="elsevierStyleItalic">primers</span> utilizados fueron LbLMA1-rev &#40;5&#8242;-CTC AAA ACT AAA CAA AGT TTC-3&#8242;&#41; y R16-1 &#40;5&#8242;-CTT GTA CAC ACC GCC CGT CAA-3&#8242;&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0095"><span class="elsevierStyleSup">4</span></a>&#46; Se prepar&#243; la mezcla de reacci&#243;n de PCR de 25<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l con buffer de reacci&#243;n &#40;1&#215;&#41;&#44; cloruro de magnesio &#40;1&#44;5-3<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM&#41;&#44; desoxirribonucle&#243;tidos trifosfato &#40;200<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M&#41;&#44; <span class="elsevierStyleItalic">primer reverse</span> y <span class="elsevierStyleItalic">primer forward</span> &#40;0&#44;4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M&#41;&#44; <span class="elsevierStyleItalic">Taq</span> ADN polimerasa &#40;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>U&#41;&#44; agua bidestilada y ADN bacteriano &#40;2&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l&#41;&#46; Para la extracci&#243;n de ADN se incubaron las cepas en caldo MRS a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 24<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h hasta llegar a la fase estacionaria&#46; Luego&#44; se obtuvo el ADN con el kit de extracci&#243;n Wizard &#40;Promega&#41;&#44; que fue conservado a 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C hasta ser utilizado&#46; La amplificaci&#243;n se realiz&#243; en un termociclador marca Ivema T-17&#44; con un programa espec&#237;fico que incluye desnaturalizaci&#243;n inicial a 95<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#59; 20 a 30 ciclos que incluyen&#58; desnaturalizaci&#243;n a 95<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C por 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#44; <span class="elsevierStyleItalic">annealing</span> o uni&#243;n a 55<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C por 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>s y extensi&#243;n a 72<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C por 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>s&#59; 7<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min finales de extensi&#243;n a 72<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#59; y almacenamiento hasta realizar la corrida electrofor&#233;tica a 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#46; Las muestras fueron sembradas en un gel de agarosa al 2&#37; te&#241;ido con bromuro de etidio&#46; La corrida se realiz&#243; en una cuba de electroforesis a 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>V durante 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#46; Los productos de amplificaci&#243;n se visualizaron mediante un transiluminador con luz UV&#46;</p><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para evaluar la actividad inhibitoria de los lactobacilos aislados y seleccionados&#44; se trabaj&#243; con la cepa de referencia <span class="elsevierStyleItalic">E&#46; coli</span> O157&#58;H7 EDL 933 y con aislamientos del cepario del Laboratorio de Inmunoqu&#237;mica y Biotecnolog&#237;a&#58; una cepa de <span class="elsevierStyleItalic">Salmonella</span> spp&#46; &#40;<span class="elsevierStyleItalic">invA</span>&#43;&#41;&#44; aislada de cerdo&#44; y otra de <span class="elsevierStyleItalic">S&#46; aureus</span>&#44; aislada de boca de expendio de carne de cerdo&#46; Cada uno de los aislamientos seleccionados se sembr&#243; por puntura en placas de MRS agar&#46; Luego de una incubaci&#243;n de 48<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C en anaerobiosis&#44; las placas fueron expuestas a vapores de cloroformo durante 15<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#44; para inactivar a las bacterias que hubieran crecido&#44; y se cubrieron con una capa de agar tripticasa soya &#40;TSA&#41; blando &#40;0&#44;75&#37; de agar&#41; que conten&#237;a el microorganismo pat&#243;geno que ser&#237;a evaluado en cada caso &#40;<span class="elsevierStyleItalic">E&#46; coli</span> O157&#58;H7&#44; <span class="elsevierStyleItalic">Salmonella</span> spp&#46; o <span class="elsevierStyleItalic">S&#46; aureus</span>&#41;&#46; La observaci&#243;n de zonas transl&#250;cidas se consider&#243; indicativa de inhibici&#243;n del crecimiento de las bacterias pat&#243;genas por acci&#243;n de los aislamientos de <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span> spp&#46; Se consider&#243; como prueba positiva la presencia de halos de inhibici&#243;n mayores de 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm<span class="elsevierStyleSup">3</span>&#46;</p><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Mediante an&#225;lisis fenot&#237;pico y genot&#237;pico&#44; se identificaron 27 cepas de <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span> spp&#46; &#40;34&#44;61&#37;&#41;&#44; de las cuales 23 inhibieron al menos un pat&#243;geno&#46; De ellas&#44; 5 fueron aisladas del criadero&#44; 2 de la sala de recepci&#243;n&#44; 4 de la c&#225;mara de desposte&#44; 5 de la sala de elaboraci&#243;n y 7 de la boca de expendio&#46; Diecisiete cepas de <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span> spp&#46; &#40;62&#44;96&#37;&#41; inhibieron el desarrollo de <span class="elsevierStyleItalic">E&#46; coli</span> O157&#58;H7&#44; 16 cepas &#40;59&#44;26&#37;&#41; inhibieron a <span class="elsevierStyleItalic">Salmonella</span> spp&#46; y 11 cepas &#40;40&#44;74&#37;&#41; evitaron el desarrollo de <span class="elsevierStyleItalic">S&#46; aureus</span>&#46; Teniendo en cuenta la capacidad inhibitoria de las cepas de <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span> spp&#46; frente a los tres pat&#243;genos juntos&#44; 7 de ellas &#40;25&#44;92&#37;&#41; presentaron esta propiedad &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig&#46; 1</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El g&#233;nero <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span> es uno de los predominantes en el ecosistema gastrointestinal de animales de granja<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0140"><span class="elsevierStyleSup">13</span></a>&#46; En cerdos&#44; se encontr&#243; <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus casei &#40;L&#46; casei&#41;</span> al aislar BAL del contenido cecal&#46; Esta bacteria es un microorganismo reconocido como seguro y se encuentra dentro de las especies m&#225;s comunes que se emplean en las preparaciones probi&#243;ticas&#44; con capacidad inhibitoria frente a una gran diversidad de pat&#243;genos&#46; Por ejemplo&#44; <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; casei</span> presenta un efecto inhibitorio sobre el crecimiento de cepas de <span class="elsevierStyleItalic">E&#46; coli</span> O157&#58;H7 por medio de una combinaci&#243;n de sustancias de naturaleza pept&#237;dica&#44; junto con una acci&#243;n parcial del per&#243;xido de hidr&#243;geno y de la acidez del medio<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0125"><span class="elsevierStyleSup">10</span></a>&#46; El estudio de Rold&#225;n et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0130"><span class="elsevierStyleSup">11</span></a> puso de manifiesto la inhibici&#243;n de este pat&#243;geno a partir de cepas de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; casei</span> aisladas de un alimento c&#225;rnico fermentado&#46; Vinderola y Reinheimer<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0145"><span class="elsevierStyleSup">14</span></a> tambi&#233;n proponen el uso de cepas de BAL productoras de sustancias antimicrobianas para prevenir la contaminaci&#243;n de diferentes matrices&#46;</p><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En general&#44; se han estudiado cepas de <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span> aisladas del contenido gastrointestinal de animales de granja&#44; entre ellos el cerdo&#58; contenido del intestino grueso de cerdos y calostro de cerdas&#46; En este estudio&#44; sin embargo&#44; se aislaron tambi&#233;n de muestras de materia fecal en el criadero y del ambiente &#40;equipamiento&#44; utensilios&#44; mesadas&#41; en distintas etapas de la cadena de producci&#243;n porcina&#46;</p><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se sabe que la carne bovina y derivados c&#225;rnicos constituyen un sustrato excelente para el aislamiento de <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span> spp&#46; productores de bacteriocinas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0135"><span class="elsevierStyleSup">12</span></a>&#46; La carne porcina&#44; en tanto&#44; no ha sido matriz de estudio para el aislamiento de <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span> hasta el momento&#44; de all&#237; la importancia de investigar esta posible fuente de aislamientos de inter&#233;s&#46; Por otra parte&#44; la carne de cerdo y sus subproductos representan una excelente matriz para el desarrollo de pat&#243;genos como O157&#58;H7 y no O157&#58;H7&#46; Un estudio reciente ha detectado <span class="elsevierStyleItalic">Salmonella</span> spp&#46; y <span class="elsevierStyleItalic">S&#46; aureus</span> en muestras obtenidas en distintas etapas de la cadena productiva porcina<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0085"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>&#46; Por lo tanto&#44; estos pat&#243;genos pueden ser el origen de diversas ETA&#44; y la capacidad de controlarlos o disminuirlos en toda la cadena de producci&#243;n porcina por un medio biol&#243;gico&#44; a trav&#233;s de la aplicaci&#243;n de cepas de <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span> &#8212;como se plantea en este estudio&#8212;&#44; representa una alternativa beneficiosa tanto para la producci&#243;n de carne y productos porcinos como para la salud p&#250;blica&#46;</p><span id="sec0005" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0025">Responsabilidades &#233;ticas</span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0030">Protecci&#243;n de personas y animales</span><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran que para esta investigaci&#243;n no se han realizado experimentos en seres humanos ni en animales&#46;</p></span><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0035">Confidencialidad de los datos</span><p id="par0090" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicaci&#243;n de datos de pacientes&#46;</p></span><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0040">Derecho a la privacidad y consentimiento informado</span><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran que en este art&#237;culo no aparecen datos de pacientes&#46;</p></span></span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0045">Financiaci&#243;n</span><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">PICT-2013-1749 &#171;Aislamiento de <span class="elsevierStyleItalic">Lactobacillus</span> spp&#46; con actividad inhibitoria de bacterias implicadas en enfermedades transmitidas por alimentos&#187;&#46; Responsable&#58; Dra&#46; Anal&#237;a In&#233;s Etcheverr&#237;a&#46; Y SECAT-UNCPBA&#46;</p></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0050">Conflicto de intereses</span><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran no tener ning&#250;n conflicto de intereses&#46;</p></span></span>"
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Información del artículo
ISSN: 03257541
Idioma original: Español
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2024 Octubre 200 14 214
2024 Septiembre 207 14 221
2024 Agosto 139 7 146
2024 Julio 116 11 127
2024 Junio 99 19 118
2024 Mayo 94 9 103
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2024 Febrero 97 18 115
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