Desarrollo de marcadores moleculares del tipo SCAR para la identificación de Azospirillum brasilense Az39

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Los números indican los promedios correspondientes a los tratamientos aplicados. 0: T0, terreno inicial antes de la siembra con frijol; 1: T1, terreno con siembra previa de frijol, sin mulch y con control de malezas con glifosato; 2: T2, terreno con siembra previa de frijol, cubierto por mulch y con control de malezas con glifosato; 3: T3, testigo con siembra previa de frijol, control de malezas manual; 4: T4, testigo con siembra previa de frijol, con labranza mínima y cobertura vegetal." ] ] ] "autores" => array:1 [ 0 => array:2 [ "autoresLista" => "Adriana Patricia Tofiño Rivera, Rafael Enrique Carbono Murgas, Aslenis Emidia Melo Ríos, Luciano José Merini" "autores" => array:4 [ 0 => array:2 [ "nombre" => "Adriana Patricia" "apellidos" => "Tofiño Rivera" ] 1 => array:2 [ "nombre" => "Rafael Enrique" "apellidos" => "Carbono Murgas" ] 2 => array:2 [ "nombre" => "Aslenis Emidia" "apellidos" => "Melo Ríos" ] 3 => array:2 [ "nombre" => "Luciano José" "apellidos" => "Merini" ] ] ] ] ] "idiomaDefecto" => "es" "EPUB" => "https://multimedia.elsevier.es/PublicationsMultimediaV1/item/epub/S0325754119300252?idApp=UINPBA00004N" "url" => "/03257541/0000005200000001/v1_202003120635/S0325754119300252/v1_202003120635/es/main.assets" ] "itemAnterior" => array:19 [ "pii" => "S0325754119300276" "issn" => "03257541" "doi" => "10.1016/j.ram.2019.02.003" "estado" => "S300" "fechaPublicacion" => "2020-01-01" "aid" => "331" "copyright" => "Asociación Argentina de Microbiología" "documento" => "article" "crossmark" => 1 "licencia" => "http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/" "subdocumento" => "fla" "cita" => "Rev Argent Microbiol. 2020;52:43-9" "abierto" => array:3 [ "ES" => true "ES2" => true "LATM" => true ] "gratuito" => true "lecturas" => array:2 [ "total" => 316 "formatos" => array:3 [ "EPUB" => 22 "HTML" => 210 "PDF" => 84 ] ] "en" => array:13 [ "idiomaDefecto" => true "cabecera" => "Original article" "titulo" => "Tolerance of dark septate endophytic fungi (DSE) to agrochemicals in vitro" "tienePdf" => "en" "tieneTextoCompleto" => "en" "tieneResumen" => array:2 [ 0 => "en" 1 => "es" ] "paginas" => array:1 [ 0 => array:2 [ "paginaInicial" => "43" "paginaFinal" => "49" ] ] "titulosAlternativos" => array:1 [ "es" => array:1 [ "titulo" => "Tolerancia de hongos endofíticos septados oscuros a agroquímicos in vitro" ] ] "contieneResumen" => array:2 [ "en" => true "es" => true ] "contieneTextoCompleto" => array:1 [ "en" => true ] "contienePdf" => array:1 [ "en" => true ] "resumenGrafico" => array:2 [ "original" => 0 "multimedia" => array:7 [ "identificador" => "fig0005" "etiqueta" => "Figure 1" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr1.jpeg" "Alto" => 627 "Ancho" => 1255 "Tamanyo" => 51614 ] ] "descripcion" => array:1 [ "en" => "Morphology of DSE's colony grown in MEA plate. 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C y D) Electroforesis en gel de agarosa 1% de los productos de amplificación con los cebadores 16S rRNA específicos de género (Lin et al., 2011) utilizados como control positivo para las cepas Azospirillum spp. Referencias: (MM) marcador de peso molecular 100bp Trans Plus ADN Ladder; (1) A. brasilense Az39; (2) A. brasilense Sp245; (3) A. brasilense FP2; (4) A. brasilense Abv5; (5) A. brasilense Abv6; (6) A. brasilense Az 19; (7) A. brasilense Az 36; (8) A. brasilense Az 45; (9) A. brasilense Az 48; (10) A. brasilense Az 63; (11) A. brasilense Az 65; (12) Pseudomonas protegens CHA0; (13) Bradyrhizobium japonicum E109; (14) A. formosense CC-Nfb-7; (15) A. fermentarium CC-LY743; (16) A. halopraeferens Au4; (17) A. oryzae COC8; (18) A. palatum WW10; (19) A. melinis TMYC 0552; (20) A. lipoferum Sp59b; (21) A. canadense DS2; (22) A. rugosum IMMIB AFH-6; (23) A. agrícola CC-HIH038; (24) A. soli CC-Ly788; (25) A. zeae N7; (C-) control negativo (agua)." ] ] ] "textoCompleto" => "IntroducciónLa necesidad de la aplicación de prácticas agrícolas sustentables ha llevado al desarrollo de bioinsumos en base a microorganismos capaces de promover el crecimiento de las plantas (Plant Growth Promoting Rhizobacteria) con el fin de aumentar el rendimiento en los cultivos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0300">20</a>. En los últimos años el mercado mundial de bioinsumos ha crecido con una tasa sostenida cercana al 10% y con una expectativa de alcanzar los 4.092 millones de dólares en el 2025<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0290">18</a>. Dentro de las Plant Growth Promoting Rhizobacteria uno de los géneros mejor caracterizados es Azospirillum, siendo Azospirillum brasilense una de las especies más estudiadas y ampliamente utilizada en la producción de formulados biológicos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0255">11,26</a>. A lo largo de los años, el género Azospirillum ha demostrado ser capaz de promover el crecimiento y desarrollo de numerosas especies vegetales de interés agrícola a través de numerosos mecanismos fisiológicos o bioquímicos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0220">4</a>. Entre dichos mecanismos se incluyen, la fijación biológica de nitrógeno, que tuvo menos relevancia agronómica de la inicialmente esperada, o la producción de fitohormonas y otros reguladores del crecimiento de plantas, que ha tenido mayor importancia en los últimos años<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0220">4,5</a>. En Sudamérica, existen alrededor de 106 productos comerciales formulados en base a A. brasilense y aproximadamente el 90% de estos productos son desarrollados en nuestro país, siendo la cepa Az39 de A. brasilense el principio activo más frecuentemente utilizado en América de Sur, con un 75% de prevalencia en el mercado nacional y brasilero<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0255">11</a>. La cepa Az39, fue aislada en el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria-Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola en la década del 80, mediante un programa de identificación y selección de cepas de Azospirillum spp. de la superficie de raíces esterilizadas de plantas de trigo en la localidad de Marcos Juárez en la provincia de Córdoba. Este programa, además, realizó la evaluación de la capacidad promotora del crecimiento de Az39 y otras cepas del mismo género en condiciones agronómicas, siendo la primera la más eficiente. Como consecuencia, el Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria, junto con las empresas productoras de inoculantes decidieron recomendarla inicialmente para la producción de bioinsumos destinados al tratamiento biológico de semillas de maíz, trigo, sorgo y otras especies de no leguminosas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0250">10,33</a> y a la fecha para más de 16 especies vegetales dentro de las que se incluyen las mencionadas y otras como algodón, tabaco, cebada, arroz y soja en coinoculación con Bradyrhizobium japonicum. Después de más de 30 años desde su aislamiento y de convertirse en una de las cepas más estudiadas in planta como a campo, el laboratorio de Fisiología Vegetal y de la Interacción Planta Microorganismo de la Universidad Nacional de Río Cuarto en el año 2012 inició un ambicioso proyecto para secuenciar el genoma de A. brasilense Az39, lo que culminó exitosamente con la obtención de la secuencia completa y cerrada del mismo en el año 2014<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0360">32</a>. El genoma de Az39 consiste de 6.311 secuencias codificantes distribuidas en 6 replicones (un cromosoma, 3 crómidos y 2 plásmidos). La obtención de la secuencia del genoma fue considerada como la base para el desarrollo de numerosos estudios posgenómicos dentro de los que se incluyen la generación de herramientas moleculares para estudiar con mayor precisión y profundidad la capacidad de esta bacteria para promover el crecimiento vegetal.Sin embargo, como se mencionó anteriormente, a pesar de que el uso de bioinsumos y dentro de ellos aquellos formulados con esta cepa, aumenta año a año, no hay normativas gubernamentales estrictas que regulen la calidad y trazabilidad de los productos en el sistema agroalimentario<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0310">22</a>. Más aun, en la República Argentina, no existen protocolos que permitan autenticar la identidad de la cepa Az39 de A. brasilense en formulaciones comercializadas para diferentes tipos de cultivo. Hasta el momento, la identificación de este microorganismo se realiza mediante metodologías de microbiología clásica, pero estas no son suficientes para asegurar con certeza la identidad del microorganismo a nivel de cepa<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0250">10</a>. Algunos autores han avanzado en este sentido y han desarrollado metodologías que permiten la identificación a nivel de cepas dentro de una misma especie<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0260">12,13,28</a>. De este modo, el desarrollo de herramientas moleculares basadas en la secuencia del ADN, permiten establecer la identidad de ciertos microorganismos de manera confiable y precisa. La utilización de marcadores moleculares del tipo SequenceCharacterized AmplifiedRegions (SCAR) es una de las alternativas con la que se ha conseguido la identificación molecular a nivel de cepa. Los marcadores SCAR representan loci únicos, genéticamente definidos, que se identifican mediante amplificación por PCR usando fragmentos de ADN genómico con cebadores específicos. Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores, el presente trabajo tuvo como objetivo emplear estas herramientas moleculares para desarrollar una metodología simple, rápida y certera que permita la identificación cepa-específica de A. brasilense Az39 en cultivos puros o mezclas de microorganismos.Materiales y métodosMaterial biológicoLos microorganismos utilizados en este trabajo se resumen en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a>. Los cultivos bacterianos pertenecientes al género Azospirillum se obtuvieron a partir de colonias puras cultivadas a 30°C o 37°C (según la cepa evaluada), durante 72h en el medio de cultivo Luria Bertani (LB) modificado por la adición de solución de rojo Congo (LBRC)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0320">24</a>. Las colonias se repicaron en tubos de ensayo conteniendo 5ml de caldo LB<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0240">8</a>. Las cepas Pseudomonas protegens CHA0 y Bacillus subtilis BH8, cultivadas en caldo LB y aisladas en agar LB, se utilizaron como control negativo. El medio EMA<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0400">40</a> se utilizó para el crecimiento de B. japonicum E109 y se determinó su pureza por ausencia de crecimiento en medio agar tripticasa soya<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0205">1</a>.<elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia>Análisis genotípico in silico y desarrollo de marcadores del tipo SCARPara el análisis in silico se utilizó el software http://insilico.ehu.eus/<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0245">9</a>. En primer lugar, se cargó la secuencia genómica de la cepa Az39 fraccionada en tres archivos, uno conteniendo el cromosoma, y otros dos con los plásmidos y crómidos, respectivamente. Luego, se simularon múltiples AmplifiedFragment Length Polymorphism (AFLP-PCR) utilizando diferentes combinaciones enzimáticas y nucleótidos de selección, ordenados al azar. A continuación, se seleccionaron secuencias de ADN con longitudes de entre 200-800 pares de bases (pb). Estas secuencias fueron comparadas con las secuencias de nucleótidos no redundantes disponibles en la base de datos de National Center for Biotechnology Information, mediante el uso de la plataforma BLASTn [https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi]<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0215">3</a> y se seleccionaron las secuencias únicas para la cepa Az39 de A. brasilense.Diseño de cebadores específicos para A. brasilense Az39El diseño de cebadores se llevó a cabo empleando la plataforma bioinformática Primer3<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0295">19,36</a> acoplada al sitio web <a href="http://ins%26iacute;lico.ehu.eus/primer3/">http://insílico.ehu.eus/primer3/</a> a partir de las regiones no homólogas identificadas con la plataforma BLASTn. Se tuvieron en cuenta los siguientes parámetros (i) porcentaje de guanina-citosina (% G+C) entre 40-60%; (ii) temperatura de melting (Tm) entre 55-61°C; y (iii) longitud del primer entre 18-24 pb. Asimismo, los pares de cebadores diseñados fueron analizados con el software OligoAnalyzer 3.1 ofrecido por Integrated ADN Technologies, para evaluar la formación de estructuras secundarias, como bucles en la misma hebra de ADN<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0335">27</a>, formación de homodímeros y heterodímeros. Por otro lado, se probó la complementariedad de las secuencias de los oligonucleótidos mediante el uso del National Center for Biotechnology Information-BLAST3 y Prokaryotic Genome DataBase en https://www.genoscope.cns.fr/agc/microscope/search/blast.php<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0385">37</a>. Finalmente, se simuló una PCR in silico, para evaluar el correcto funcionamiento de los cebadores diseñados. Los cebadores seleccionados fueron sintetizados y evaluados in vitro.Extracción de ADNLa extracción del ADN genómico se realizó a partir de colonias aisladas o cultivos puros de Az39 empleando alternativamente dos metodologías: (1) el kit comercial Easy Pure Bacteria Genomic ADN de la firma Transgen Inc. (China), de acuerdo a las especificaciones del fabricante y (2) la resina de intercambio iónico Chelex®100, según la metodología propuesta por Alippi et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210">2</a>. En el caso de las colonias aisladas, la extracción solo se realizó por el método de resina y para ello las colonias fueron resuspendidas en 300μl de solución fisiológica estéril (SF) (8,5mg/ml de NaCl); mientras que en el caso de los cultivos se utilizaron ambos métodos y para ello se partió de un volumen de 1ml de muestra que se centrifugó durante 10min a 10 000rpm y cuyo pellet se resuspendió en 300μl de SF estéril. En el caso de la extracción con resina, los pellets fueron resuspendidos en 150μl de una solución de Chelex®100 al 6% (p/v) y las muestras se incubaron en un baño termostático a 56°C durante 10min seguido de una incubación a 99°C durante 8min, sometiendo las muestras a agitación vigorosa entre cada período de incubación. Finalmente, se realizó un último paso de centrifugado durante 10min a 10 000rpm. El sobrenadante se utilizó inmediatamente como molde para la realización de las reacciones de PCR o fue fraccionado y conservado a -20°C hasta su utilización.Determinación de la temperatura óptima de hibridación de los cebadoresPara conocer la temperatura óptima de hibridación o annealing (Ta) para la reacción, se realizó una PCR a tiempo final con gradiente de temperatura, probando diferentes Ta en un rango de 5°C. Como molde se utilizó el ADN genómico de A. brasilense Az39. La mezcla de reacción consistió en un volumen final de 20μl conteniendo 1 unidad de EasyTaq ADN polimerasa (TransGen Biotech, China); EasyTaq buffer 1X (TransGen Biotech, China); 0,4mM de dNTPs (Promega, Madision, Wis.); 0,4μM de cada primer (IDT Technologies) y 1μl de ADN molde. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: una desnaturalización inicial de 2min a 95°C, seguida de 30 ciclos de desnaturalización por 0,5min a 95°C; hibridación de 0,5min desde 55,2°C hasta 61,4°C y extensión de 0,5min a 72°C, con una extensión final de 5min a 72°C. La amplificación se realizó en un termociclador Ivema T21 (Ivema Desarrollos). Los productos de PCR fueron revelados mediante electroforesis en gel de agarosa 1% (p/v) teñidos con Bromuro de Etidio (BrEt) y visualizados con un transiluminador UV (Maestrogen, MLB-16 124, Taiwan).Determinación de la especificidadPara evaluar la especificidad de los cebadores diseñados previamente, se utilizó como muestra el ADN genómico de diferentes cepas de A. brasilense, así como el ADN de otras especies pertenecientes al género y microorganismos distanciados filogenéticamente (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a>). Las condiciones de reacción de PCR y los ciclos de amplificación empleados se realizaron según lo descrito anteriormente, variando la Ta de acuerdo a los resultados óptimos obtenidos. Con los microorganismos pertenecientes al género Azospirillum descritos en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a>, se realizó la amplificación por PCR con cebadores específicos para el gen 16S rRNA según Lin et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0305">21</a> a modo de control para confirmar la identidad de las cepas empleadas en el análisis. En el caso de los microorganismos distanciados filogenéticamente, se utilizaron los cebadores BOX-AR1 según Versalovic et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0395">39</a>.Determinación de la sensibilidad del métodoPara evaluar la sensibilidad del método, se utilizó ADN genómico como molde para la amplificación por PCR, el cual fue obtenido alternativamente por extracción con un kit comercial o por resina de intercambio iónico, como se describió previamente. A modo de resumen, 1ml de un cultivo puro de A. brasilense Az39 fue diluido por duplicado en tubos conteniendo 9ml de solución fisiológica estéril para obtener tubos con una dilución inicial de 10-1 a partir de los que se realizaron diluciones decimales hasta alcanzar un valor de 10-7. A continuación, se tomaron 20μl de cada dilución y se realizó un recuento por la técnica de microgota<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0355">31</a> para confirmar el número de células viables. Del mismo tubo, se tomó 1ml para la extracción con resina. El segundo tubo fue utilizado para la extracción de ADN mediante kit y la cuantificación de la concentración de ADN por la utilización de un NanoDrop One de la firma Thermo Fischer Inc.(EE. UU.). La determinación se realizó sobre el total de células (UFC/ml) obtenidas por centrifugación de cada dilución. Adicionalmente, se midió la concentración de ADN de diluciones en base decimal y centesimal del ADN obtenido a partir de una dilución 10-7 equivalente a un valor teórico de 1x102 UFC/ml. En todos los casos se utilizó como control negativo agua MilliQ esterilizada.Determinación de la especificidad en cultivos mixtos con B. japonicum E109Cultivos mixtos de A. brasilense Az39 y B. japonicum E109, se obtuvieron independientemente en medios LB y EMA, hasta alcanzar una DO595 aprox. 1,9. Ambos cultivos se mezclaron en tubos plásticos de 1,5ml de capacidad en diferentes proporciones de cada microorganismo (p. ej. 100% de E109; 70% E109 + 30% Az39; 50% E109 + 50% Az39; 30% E109 + 70% Az39 y 100% Az39). De cada una de las mezclas, se extrajo el ADN genómico mediante la metodología detallada anteriormente para cultivos en medio líquido. El ADN obtenido se utilizó como molde para reacciones de PCR específicas con los cebadores diseñados en este trabajo (denominados TP5).Determinación de la especificidad en cultivos mixtos con más de una cepa de AzospirillumSe realizaron tres mezclas diferentes de cultivos bacterianos pertenecientes al género Azospirillum, combinados en igual proporción. En el caso de la mezcla 1, se emplearon las cepas de la misma especie A. brasilense Az39, Sp7 y Sp245. Por otro lado, en la mezcla 2 se utilizaron las cepas A. brasilense Az39, Sp7 y Sp245, A. zeae N7, A. melinis TMYC 0552, A. halopraeferens Au4, A. canadense DS2 y A. rugosum IMMIB AFH-6 pertenecientes a distintas especies del género. Finalmente, en la mezcla 3 se utilizaron A. brasilense Az39, A. formosense CC-Nfb-7, A. fermentarium CC-LY743, A. oryzae COC8, A. palatum WW10, A. lipoferum Sp59b, A. agricola CC-HIH038 y A. soli CC-Ly788. Todas las cepas empleadas en estos experimentos se cultivaron en medio MMAB<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0390">38</a> durante 24 h. Se tomó 1ml de cada cultivo, se centrifugó a 10 000rpm durante 10 min y se ajustaron a igual DO595, con el objetivo de que todas las cepas tuvieran igual concentración (aprox. 1 x109 UFC/ml). Las mezclas se realizaron en microtubos de 1,5ml a volumen final 1ml, colocando iguales proporciones de los diferentes cultivos. Luego, a partir de cada mezcla bacteriana se extrajo el ADN con Chelex®100 según la metodología descrita anteriormente. Finalmente, el ADN genómico de las mezclas fue utilizado como molde para PCR con los cebadores específicos de Az39. Como control negativo se utilizaron mezclas sin Az39.Control de calidad de formulaciones comercialesSe emplearon tres productos comerciales recomendados para el tratamiento de semillas de trigo y maíz, que en su membrete indicaban contener como principio activo A. brasilense Az39, a los que denominamos aleatoriamente I1, I2 e I3. En el caso del producto I1 declaraba una fecha de vencimiento tres meses posteriores a la fecha del análisis, en el caso de I2 se encontraba al límite de la fecha de vencimiento y en el caso de I3 había vencido 6 meses antes de realizar este análisis. A modo de aclaración, es necesario mencionar que, en Argentina, el valor de recuento límite a la fecha de vencimiento para productos comerciales conteniendo Azospirillum es de 1x107 UFC.ml-1. Para la toma de muestras, se homogenizaron las vejigas con el inoculante durante 10min, se esterilizaron las superficies y se tomaron 2ml de cada muestra para la posterior extracción de ADN por el método de Chelex®100. Adicionalmente, se tomó 1ml para el recuento. Previo a la extracción de ADN, se realizó un lavado con solución fisiológica y las células se concentraron en un volumen final de 300μl. Luego se prosiguió con la metodología descrita previamente con la resina Chelex®100. El recuento se realizó por la técnica de microgota<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0355">31</a> y para ello las muestras fueron colocadas en 9ml de SF estéril para obtener la dilución 10-1 de la que se realizaron diluciones decimales para alcanzar una dilución de 10-7. A continuación, se tomaron 20μl de cada dilución, se sembraron en placas de LBRC y se incubaron a 37°C durante 72 h. Se realizó el recuento de colonias y se calculó el número de UFC/ml. Adicionalmente, las muestras se sembraron en placas de LBRC en estrías por agotamiento y a partir de las colonias crecidas en este medio, se extrajo ADN con la resina Chelex®100 y se utilizó como molde para la amplificación por PCR con los cebadores TP5 a modo de confirmar la identidad de las colonias obtenidas.ResultadosAnálisis genotípico in silico y desarrollo de marcadores moleculares del tipo SCARMediante la simulación de 400 AFLP-PCR in silico, se seleccionaron 700 secuencias candidatas con un tamaño entre 200 y 800 pb. Cuando estas secuencias fueron comparadas mediante BLASTn, solo 12 de ellas no presentaron homología con secuencias depositadas en la base de datos o exhibieron fragmentos de al menos 200 pb únicos en el genoma de A. brasilense Az39 (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">fig. S1</a>). Las secuencias únicas en el genoma de Az39 se localizaron en el cromosoma de dicha bacteria, algunas de ellas ubicadas en regiones no codificantes como en el caso de las secuencias 6, 7, 9 y 10 de la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">figura S2</a>; mientras que otras se encontraron en regiones de secuencias que codifican para proteínas hipotéticas. Específicamente, en el caso de los productos de los cebadores evaluados in vitro en este trabajo TP5, TP6, TM 1 y EM1, todos se encontraron dentro de regiones que codifican para proteínas hipotéticas (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">fig. S2</a>). Un total de 18 pares de cebadores fueron diseñados para la amplificación de las regiones no homólogas. Se observó que todos los cebadores fueron capaces de formar estructuras como homodímeros, heterodímeros y bucles dentro de la misma molécula de ADN, sin embargo, se escogieron 4 pares de cebadores cuyas características termodinámicas demostraron que las posibles estructuras secundarias eran inestables. Adicionalmente, cuando se simularon reacciones de PCR en los genomas de A. brasilense Sp45, A. lipoferum 4B, Azospirillum sp. B510 y Azospirillum spp. el resultado fue negativo. Más aún, no se observó amplificación en otras especies de Azospirillum, ni en otros géneros bacterianos presentes comúnmente en el suelo, entre ellos Bradyrhizobium, Pseudomonas, Bacillus, Rhodospirillum, Rhizobium, Sinorhizobium o Nitrosomonas. Las secuencias de los oligonucleótidos sintetizadas y probadas in vitro se muestran en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0010">tabla 2</a> y estas amplifican las regiones número 4, 5 y 8 de la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">figura S1</a> y de la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">figura S3</a>.<elsevierMultimedia ident="tbl0010"></elsevierMultimedia>Análisis in vitro de los cebadores específicos para Az39Los 4 pares de cebadores diseñados fueron capaces de amplificar en todas las temperaturas evaluadas (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">fig. S4</a>). En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">figura S4A</a> se observa que el par TP5 amplificó un fragmento de 307 pb; mientras que los pares de cebadores denominados TP6 y TM1 originaron amplicones de 401 pb y 306 pb respectivamente (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">fig. S4B</a>). La amplificación con el par de cebadores denominado EM1 dio como resultado un amplicón esperado de 611 pb y una banda adicional que corresponde a un fragmento entre 100 pb y 200 pb (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">fig. S4C</a>). Ambas bandas se observaron solo en la cepa Az39, inclusive cuando la Ta fue de 65°C (datos no mostrados). En función de los resultados obtenidos en esta sección, se seleccionaron las siguientes Ta: 59,1°C; 55,2°C y 56,4°C para cada par de cebadores TP5, TP6 y TM1 respectivamente. Debido a que el par de cebadores EM1 era capaz de amplificar en regiones inespecíficas no fue utilizado para los ensayos posteriores de este trabajo.Determinación de la especificidad y sensibilidad del métodoEn la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">figura 1</a> se muestran los resultados obtenidos en la evaluación de la especificidad del par de cebadores denominados TP5 en cultivos puros. El ciclo de reacción se llevó a cabo con una temperatura de alineamiento de 59,1°C. Cuando se utilizó como molde el ADN genómico de cepas de A. brasilense filogenéticamente relacionadas con Az39, los resultados fueron negativos (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig. 1</a>A), lo que demuestra el alto grado de especificidad de los cebadores diseñados. Las cepas evaluadas fueron A. brasilense Sp245, FP2, Abv5 y Abv6 (utilizadas en la producción de inoculantes en Brasil); Az 19, Az 36, Az 45, Az 48, Az 63 y Az 65 (pertenecientes a la colección del Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria-Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola). Tampoco se observaron productos de PCR en otras cepas pertenecientes a diferentes especies del género como A. formosense CC-Nfb-7, A. fermentarium CC-LY743, A. halopraeferens Au4, A. oryzae COC8, A. palatum WW10, A. melinis TMYC 0552, A. lipoferum Sp59b, A. canadense DS2, A. rugosum IMMIB AFH-6, A. agrícola CC-HIH038, A. soli CC-Ly788 y A. zeae N7 (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig. 1</a>B). Otras cepas no relacionadas filogenéticamente con este género, pero frecuentemente utilizadas para la formulación comercial de inoculantes combinados con A. brasilense Az39 fueron evaluadas. Estas cepas fueron P. protegens (ex-P. fluorescens) CHA0, B. japonicum E109 y B. subtilis BH8 y ninguna presentó resultados positivos para la amplificación con los cebadores TP5. En las <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">figura 1</a>C y D se observa la amplificación del gen 16S rRNA con los cebadores específicos para el género Azospirillum utilizados como control<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0305">21</a>. Por otro lado, se comprobó la amplificación por PCR con cebadores del tipo BOX-AR1 en las cepas pertenecientes a otros géneros microbianos (datos no mostrados). La evaluación con los cebadores TP6 y TM1 presentó resultados inesperados ya que hubo amplificación inespecífica en algunas cepas del género, por lo que los mismos fueron descartados para ensayos posteriores de este trabajo. Si bien, se analizó el total de las cepas presentadas en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a> con los cebadores TP6 y TM1 (datos no mostrados), en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">figura S5</a> se presentan a modo de ejemplo algunos de los productos inespecíficos amplificados por dichos cebadores. Algunas cepas amplificaron bandas únicas, definidas y de peso molecular diferente al esperado para el caso de Az39; mientras que en otras se observó más de un producto de PCR. A pesar de que los cebadores TP6 y TM1 amplificaron de manera inespecífica para otros microorganismos, fueron eficientes para diferenciar la cepa Az39 del resto de las cepas evaluadas ya que, aun existiendo amplificación inespecífica, fue posible distinguir A. brasilense Az39 de otras cepas.<elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia>En cuanto a la sensibilidad, la metodología fue probada con el par de cebadores denominado TP5 ya que resultó ser el más específico para la reacción de PCR. En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">figura 2</a>A se observan los productos de amplificación de PCR empleando el par de cebadores TP5 para los que se utilizó como molde ADN extraído por la resina Chelex® 100, a partir de diluciones decimales de un cultivo puro de Az39. Nuestros resultados demuestran que el punto de corte con esta metodología se obtiene en la dilución 10-4 equivalente a un título bacteriano de 2,5x105 UFC/ml o una concentración de ADN equivalente a 4,5 ng/μl ADN. En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">figura 2</a>B se observan los productos de amplificación de PCR, utilizando como molde ADN extraído por un kit comercial. Nuestros resultados muestran que el punto de corte de esta metodología, teniendo en cuenta el número de células, se obtiene en dilución 10-7, equivalente a un título de 4,5 x 102 UFC/ml y con un contenido equivalente de ADN de 0,88 ng/μl; sin embargo, el límite de detección en base a la concentración de ADN fue establecido donde la amplificación se alcanzó con 0,098 ng/μl de ADN, a pesar de que la amplificación fue tenuemente observada en una concentración inferior de ADN (0,0092 ng/μl). El recuento inicial del cultivo del cual se realizaron las diluciones fue 2,5x109 UFC/ml. Es importante aclarar que cuando el ADN fue extraído con la metodología de Alippi et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210">2</a> se obtuvieron resultados similares para las amplificaciones realizadas con los cebadores TP6 (datos no mostrados). En función de los resultados obtenidos a nivel de la especificidad y sensibilidad del método en cultivos puros, se pudo determinar la especificidad en cultivos mixtos. En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">figura 3</a>A se observa la amplificación por PCR empleando los cebadores TP5, a partir de mezclas de cultivos puros de A. brasilense Az39 y B. japonicum E109 en distintas proporciones. Los resultados demostraron que cuando la cepa Az39 está presente, la amplificación por PCR es positiva independientemente de las proporciones de los microorganismos presentes en la mezcla. La especificidad en mezclas de Azospirillum se evaluó mezclando por un lado cepas de la misma especie (mezcla 1) y cepas pertenecientes a distintas especies (mezcla 2 y 3). En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">figura 3</a>B se observa el resultado para las tres mezclas de cultivos evaluadas, donde el producto de 307 pb se obtuvo en todos los casos en los que estuvo presente Az39; mientras que los resultados negativos fueron pertenecientes a las mezclas control sin el agregado de esta cepa.<elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="fig0015"></elsevierMultimedia>Control de calidad de formulados comercialesDesde el punto de vista del análisis microbiológico de los productos comerciales empleados en este trabajo, podemos mencionar que los resultados obtenidos a partir del empleo de la técnica de recuento por microgota arrojaron los siguientes títulos de recuento: 5,8 x 108 UFC/ml para el formulado I1; 3,38 x 107 UFC/ml y para el formulado I2 y < 1 x 105 UFC/ml para el formulado I3. En el caso de I1 e I2 se observaron colonias color rojo escarlata, con una superficie plana-craquelada, con bordes redondeados y textura seca; morfología típica para este grupo bacteriano. En el caso de I3 solo se observaron estas colonias después de sembrar de manera directa una alícuota del producto en una placa conteniendo medio LBRC agarizado. Cuando el ADN molde utilizado fue obtenido a partir de colonias puras cultivadas de los recuentos (I1 e I2) o de la siembra en directo del producto I3, la electroforesis en gel de agarosa, presentó resultados positivos para los tres productos comerciales (datos no mostrados). Mientras que cuando se utilizó como molde el ADN obtenido directamente de los formulados, resultados positivos se observaron para los inoculantes I1 e I2; sin embargo, en el caso del inoculante I3, no se observó amplificación (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig. 4</a>).<elsevierMultimedia ident="fig0020"></elsevierMultimedia>DiscusiónNuestro trabajo consistió en realizar una identificación certera de A. brasilense Az39, a través de una metodología rápida y accesible, que pueda ser utilizada como una estrategia de control de calidad de inoculantes comerciales. Esto se logró mediante el desarrollo de marcadores moleculares del tipo SCAR. Hasta el momento, la identificación cepa-específica se podía realizar mediante el marcado de la misma con genes reporteros, pero esto involucra modificaciones a nivel genético, y solo puede aplicarse con fines de investigación<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0270">14</a>. La amplificación por PCR de secuencias específicas de cada cepa es una metodología simple y permite detectar particularidades de la cepa sin necesidad de su modificación genética. El uso de herramientas bioinformáticas y el acceso a la secuencia completa del genoma de Az39 nos permitió hallar fragmentos únicos en la secuencia de ADN de esta cepa. La búsqueda se realizó mediante la simulación de AFLP-PCR in silico. La mayoría de los trabajos donde se aborda la problemática de la identificación específica de cepas, se realizan de manera experimental a través de la búsqueda de secuencias únicas utilizando metodologías del tipo fingerprinting<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0275">15,16</a>. Esta alternativa resulta más costosa, laboriosa e implica una mayor inversión de tiempo, pero es de gran utilidad cuando se desconoce la secuencia genómica de la bacteria de interés. Entre los trabajos publicados donde obtienen marcadores SCAR específicos para otros microorganismos del género Azospirillum de manera experimental, se encuentran los realizados por Couillerot et al.<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0260">12,13</a> y de Priya et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0340">28</a>. Estos autores lograron desarrollar protocolos de identificación y cuantificación por qPCR con cebadores diseñados para amplificar secuencias específicas de las cepas A. lipoferum CRT1<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0265">13</a>, A. brasilense UAP-154 y CFN-535<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0260">12</a> y Azospirillum sp. Az204 y A. brasilense Sp7<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0340">28</a>, respectivamente. Cabe destacar que no se han encontrado trabajos donde se lleve a cabo de manera in vitro la búsqueda de secuencias SCAR a partir de AFLP-PCR; sin embargo, la disponibilidad de secuencias genómicas en diferentes bases de datos, permite el desarrollo de estas novedosas herramientas como alternativa. Tal es así que se ha logrado encontrar secuencias específicas de manera in silico, mediante el corte en pequeños fragmentos de 500 pb (simulación de digestión enzimática) del ADN genómico de una cepa de interés. Con el posterior análisis mediante BLAST sobre el genoma de una cepa cercanamente relacionada<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0375">35</a> (hibridación y eliminación de los fragmentos compartidos). De este modo, se detectaron fragmentos únicos para la identificación de A. brasilense FP2 mediante la amplificación por PCR de secuencias específicas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0375">35</a>. Este abordaje permitió la identificación certera de la cepa de una manera diferente a la planteada en este trabajo, pero igualmente efectiva. La herramienta molecular utilizada en nuestro trabajo ha permitido desarrollar una metodología simple, rápida y económica, comparada con los reportes previos; que permite de igual modo conseguir una gran cantidad de secuencias específicas para la identificación de la cepa.Los fragmentos de ADN encontrados, distinguidos por estar presentes únicamente en el genoma de Az39, fueron utilizados como molde para el diseño de los cebadores. Cuatro de estos pares de cebadores fueron evaluados in vitro. Solo el par denominado TP5 demostró ser específico desde una primera instancia, el mismo fue seleccionado para las evaluaciones posteriores. En el caso de los otros cebadores, el grado de especificidad fue bajo, sin embargo, es posible aumentar la misma variando condiciones como lo son la Ta, el tiempo de elongación o la concentración de cebadores. A pesar de esta diferencia observada entre los ensayos in vitro e in silico, para los cebadores TP6 y TM1, con respecto a otros microorganismos, siempre se observó el producto esperado en AZ39. Adicionalmente, ensayos preliminares realizados en nuestro laboratorio, demostraron que el aumento de la Ta mejora la especificidad con respecto a la amplificación sobre otras cepas (datos no mostrados); sin embargo, en el caso de los cebadores EM1, no se observó el producto esperado y este tipo de diferencias entre los resultados obtenidos in vitro e in silico también han sido observados en otros trabajos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0285">17,25</a>. De manera general, los pares de cebadores TP6, TM1 y EM1 fueron descartados a lo largo de los experimentos debido a que el par TP5 presentó el mejor comportamiento.En cuanto a la prueba de especificidad en una mezcla bacteriana, en el trabajo de Shime-Hattori et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0370">34</a> utilizaron una cepa de Bacillus en diferentes proporciones. Ensayos similares fueron realizados en nuestro laboratorio, empleando una mezcla de A. brasilense Az39 con B. japonicum E109. Existen reportes que demuestran que la coinoculación con ambas cepas en plantas de soja, genera un efecto positivo en la estimulación del crecimiento de este cultivo<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0235">7,29,30</a>. En base a esta evidencia, y teniendo en cuenta que en la actualidad se comercializan inoculantes formulados con ambas bacterias, probamos que los cebadores diseñados para A. brasilense Az39 fueron eficientes. Así como también fueron capaces de distinguir la cepa de interés en mezclas con microorganismos del mismo género y especie.En los ensayos con mezclas bacterianas, el par TP5 demostró su aptitud de diferenciar Az39 de otras cepas, pero siempre respetando una concentración final de células de Az39 por encima del valor de 10<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0225">5</a> UFC/ml cuando se emplea el método de extracción con Chelex® 100. A pesar de las desventajas observadas en la extracción de ADN con esta resina fue propuesta como un método alternativo debido a que a los fines de control de calidad de inoculantes es más accesible y económico que la utilización de kit comerciales. Otra metodología alternativa para la detección directa desde formulados comerciales consistiría en la utilización de Sephadex G100 al 10%<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0340">28</a>.Hasta el momento, el control de calidad de inoculantes a base de Azospirillum se realiza según lo expresa el manual de Procedimientos de la REDCAI<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0250">10</a>. El mismo consiste en el recuento de células viables mediante la metodología de siembra en placas por extensión en superficie en medio rojo Congo. Para la evaluación de microorganismos contaminantes, el manual de procedimientos sugiere la siembra directa en medio agar tripticasa soya para los microorganismos en general y en agar Sabouraud para hongos saprofíticos. Adicionalmente se sugiere una coloración mediante la técnica de Gram y la observación al microscopio de un preparado fresco de la muestra. Por otra parte, debido al dimorfismo de colonias de Azospirillum sp., en placas de medio rojo Congo, se realiza una prueba de la capacidad diazotrófica en condiciones de microaerofilia en medio NFb, de las colonias consideradas presuntivas. En nuestro trabajo proponemos complementar la metodología propuesta por la REDCAI con la confirmación molecular de la identidad de la cepa. Los pares de cebadores diseñados en nuestro trabajo cumplieron con los requisitos esperados respecto a la especificidad de la cepa Az39 en muestras comerciales. Nuestros resultados demostraron que la combinación de las metodologías de microbiología clásica y molecular permiten la evaluación eficiente de la calidad de inoculantes con diferente aptitud comercial, ya que se pudo distinguir entre productos dentro y fuera de la fecha de vencimiento y con recuentos por encima y debajo de la garantía de tales productos. En cuanto al límite de detección de la reacción de PCR, el mismo fue dependiente de la metodología de extracción de ADN empleada, siendo en este caso para la resina Chelex® 100 del orden de 105 UFC/ml y equivalente a 4,5 ng/μl ADN. Si bien, la sensibilidad del método es baja empleando la resina iónica, es necesario destacar que los productos comerciales formulados con Azospirillum deben contener no menos de 1x109 UFC/ml a la fecha de elaboración y no menos de 1x107 UFC/ml a la fecha de vencimiento, por lo que el método de extracción con resina, a pesar de su baja eficiencia, todavía sería útil si consideramos la definición de producto apto para uso agrícola con más de 1x107 UFC/ml. Por otro lado, un aumento significativo de la sensibilidad del método fue obtenido cuando el ADN bacteriano se extrajo con un kit comercial, para el que un título bacteriano de 102 UFC/ml o una concentración equivalente de ADN de 0,88 ng/μl fue suficiente para su amplificación por PCR. De la misma manera, concentraciones de ADN diez y cien veces inferior a la equivalente en 102 UFC/ml (0,098 o 0,0092 ng/μl) resultaron positivas para la amplificación, aunque en el último caso, tenuemente. Esto indica claramente que el límite de la metodología de amplificación por PCR está por debajo del límite de detección del método de recuento de bacterias viables disponible en este momento. Finalmente y de manera complementaria, podemos decir que otros investigadores han desarrollado metodologías similares para la identificación de microorganismos a nivel de género, que pueden ser utilizadas de manera complementaria para la evaluación del control de calidad de inoculantes<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230">6,21,23,34</a>.ConclusiónLa caracterización fenotípica no es suficiente para la identificación inequívoca de un microorganismo, pero puede bridar conocimientos sobre la pureza de un cultivo y el número de microorganismos presentes en el mismo. Esto reafirma que, en muchos casos, la combinación de técnicas microbiológicas y moleculares es una estrategia clave para establecer un procedimiento efectivo de control de calidad. Muchas técnicas moleculares han sido descritas para la identificación de Azospirillum pero ninguna destinada al reconocimiento específico de A. brasilense Az39, la cepa más utilizada para la formulación de inoculantes en la República Argentina. Hasta el momento, la identificación de esta cepa empleando herramientas moleculares se puede realizar por genotipado (16S rRNA y rpoD) de una manera relativamente rápida; sin embargo, estas metodologías requieren de amplificación y secuenciación, por lo que las hace imprácticas para el análisis cotidiano. En este trabajo, la disponibilidad de herramientas bioinformáticas accesibles de manera gratuita y la ventaja de contar con la secuencia del genoma de A. brasilense Az39, nos permitió realizar el análisis del polimorfismo de ADN en nuestra cepa de interés. Esta estrategia condujo al hallazgo de secuencias únicas en el genoma de Az39. El diseño de cebadores, dirigidos a dichas secuencias, demostró no solo ser específico a nivel in silico, sino que también permite determinar la presencia de A. brasilense Az39 en un cultivo puro tan solo con amplificación y electroforesis en gel de agarosa. Estas metodologías resultan ser prácticas y accesibles, además hacen posible una identificación de rutina certera. A pesar de la desventaja que presenta la técnica desarrollada en cuanto al bajo poder de detección obtenido, donde la extracción del ADN genómico de las muestras se obtiene por técnicas robustas, sencillas, rápidas y de bajo costo, es exitosa tanto en cultivos puros como en mezclas bacterianas. Así como también, los resultados obtenidos para formulados comerciales permitieron demostrar que los productos evaluados estaban formulados con la cepa Az39 de A. brasilense recomendada por el Servicio Nacional de Sanidad Animal (Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria) en la República Argentina para la producción de inoculantes para numerosas especies vegetales de interés agrícola.FinanciaciónEste trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Investigación Científica Tecnológica de Argentina (CONICET) y el Fondo Nacional de Ciencia y Tecnología (FONCyT), a través de sus proyectos PICT-2012-1051 y PICT 2015-1599.Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses." "textoCompletoSecciones" => array:1 [ "secciones" => array:14 [ 0 => array:3 [ "identificador" => "xres1316956" "titulo" => "Highlights" "secciones" => array:1 [ 0 => array:1 [ "identificador" => "abst0005" ] ] ] 1 => array:3 [ "identificador" => "xres1316954" "titulo" => "Resumen" "secciones" => array:1 [ 0 => array:1 [ "identificador" => "abst0010" ] ] ] 2 => array:2 [ "identificador" => "xpalclavsec1215373" "titulo" => "Palabras clave" ] 3 => array:3 [ "identificador" => "xres1316955" "titulo" => "Abstract" "secciones" => array:1 [ 0 => array:1 [ "identificador" => "abst0015" ] ] ] 4 => array:2 [ "identificador" => "xpalclavsec1215374" "titulo" => "Keywords" ] 5 => array:2 [ "identificador" => "sec0005" "titulo" => "Introducción" ] 6 => array:3 [ "identificador" => "sec0010" "titulo" => "Materiales y métodos" "secciones" => array:10 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "sec0015" "titulo" => "Material biológico" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "sec0020" "titulo" => "Análisis genotípico in silico y desarrollo de marcadores del tipo SCAR" ] 2 => array:2 [ "identificador" => "sec0025" "titulo" => "Diseño de cebadores específicos para A. brasilense Az39" ] 3 => array:2 [ "identificador" => "sec0030" "titulo" => "Extracción de ADN" ] 4 => array:2 [ "identificador" => "sec0035" "titulo" => "Determinación de la temperatura óptima de hibridación de los cebadores" ] 5 => array:2 [ "identificador" => "sec0040" "titulo" => "Determinación de la especificidad" ] 6 => array:2 [ "identificador" => "sec0045" "titulo" => "Determinación de la sensibilidad del método" ] 7 => array:2 [ "identificador" => "sec0050" "titulo" => "Determinación de la especificidad en cultivos mixtos con B. japonicum E109" ] 8 => array:2 [ "identificador" => "sec0055" "titulo" => "Determinación de la especificidad en cultivos mixtos con más de una cepa de Azospirillum" ] 9 => array:2 [ "identificador" => "sec0060" "titulo" => "Control de calidad de formulaciones comerciales" ] ] ] 7 => array:3 [ "identificador" => "sec0065" "titulo" => "Resultados" "secciones" => array:4 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "sec0070" "titulo" => "Análisis genotípico in silico y desarrollo de marcadores moleculares del tipo SCAR" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "sec0075" "titulo" => "Análisis in vitro de los cebadores específicos para Az39" ] 2 => array:2 [ "identificador" => "sec0080" "titulo" => "Determinación de la especificidad y sensibilidad del método" ] 3 => array:2 [ "identificador" => "sec0085" "titulo" => "Control de calidad de formulados comerciales" ] ] ] 8 => array:2 [ "identificador" => "sec0090" "titulo" => "Discusión" ] 9 => array:2 [ "identificador" => "sec0095" "titulo" => "Conclusión" ] 10 => array:2 [ "identificador" => "sec0100" "titulo" => "Financiación" ] 11 => array:2 [ "identificador" => "sec0105" "titulo" => "Conflicto de intereses" ] 12 => array:2 [ "identificador" => "xack453986" "titulo" => "Agradecimientos" ] 13 => array:1 [ "titulo" => "Bibliografía" ] ] ] "pdfFichero" => "main.pdf" "tienePdf" => true "fechaRecibido" => "2018-10-01" "fechaAceptado" => "2019-02-28" "PalabrasClave" => array:2 [ "es" => array:1 [ 0 => array:4 [ "clase" => "keyword" "titulo" => "Palabras clave" "identificador" => "xpalclavsec1215373" "palabras" => array:6 [ 0 => "Azospirillum brasilense" 1 => "Marcadores moleculares" 2 => "SCAR" 3 => "Bioinsumos" 4 => "Inoculantes" 5 => "Control de calidad" ] ] ] "en" => array:1 [ 0 => array:4 [ "clase" => "keyword" "titulo" => "Keywords" "identificador" => "xpalclavsec1215374" "palabras" => array:6 [ 0 => "Azospirillum brasilense" 1 => "Molecular markers" 2 => "SCAR" 3 => "Biofertilizers" 4 => "Inoculants" 5 => "Quality control" ] ] ] ] "tieneResumen" => true "highlights" => array:2 [ "titulo" => "Highlights" "resumen" => "<ul class="elsevierStyleList" id="lis0005"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0005">•Se realizó un abordaje bioinformático destinado a la búsqueda de secuencias únicas en el genoma de Azospirillum brasilense Az39.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0010">•Se logró la identificación de secuencias únicas en el genoma de A. brasilense Az39 y su amplificación específica mediante PCR.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0015">•Se logró la detección de A. brasilense Az39 a partir de colonias, cultivos puros o en mezclas líquidas de más de un microorganismo.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0020">•La metodología permitió la detección de A. brasilense Az39 en cultivos hasta una concentración de 105 UFC/ml (4,5 ng/μl ADN) o 102 UFC/ml (0,88 ng/μl ADN) o 0,098 ng/μl ADN, dependiendo del método de extracción utilizado.</li></ul>" ] "resumen" => array:2 [ "es" => array:2 [ "titulo" => "Resumen" "resumen" => "Azospirillum brasilense Az39 es utilizada por empresas productoras de inoculantes para la formulación de bioinsumos en América del Sur desde hace más de 30 años. Esta cepa puede promover el crecimiento, desarrollo, así como la capacidad de tolerar diferentes tipos de estrés en las plantas inoculadas, lo que determina un aumento de la productividad de cultivos de interés agronómico. En la actualidad, no existen protocolos en Argentina que permitan confirmar la identidad de Az39 en productos comerciales a nivel de laboratorios de control de calidad de inoculantes. Por ello, el objetivo de este trabajo fue desarrollar una metodología en base molecular que permita la identificación certera de A. brasilense Az39. Con la secuencia completa del genoma y mediante herramientas bioinformáticas, se pudieron reconocer fragmentos de ADN presentes únicamente en el genoma de Az39. Se diseñaron cebadores dirigidos a amplificar por PCR dichas secuencias. Como resultado se observaron los productos específicos únicamente en la presencia de la cepa de interés. La reacción pudo detectar un título mínimo de 105 UFC/ml (4,5 ng/μl ADN) o de 102 UFC/ml (0,88 ng/μl ADN) o una concentración mínima de 0,098 ng/μl ADN, dependiendo del método de extracción utilizado. Los cebadores fueron evaluados en el análisis de productos comerciales obtenidos del mercado nacional, arrojando resultados positivos, tanto en muestras directas como así también en pruebas confirmatorias a partir de colonias aisladas de tales productos. La metodología desarrollada en este trabajo, permite la detección certera de A. brasilense Az39 en cultivos puros o mezclas complejas de microorganismos." ] "en" => array:2 [ "titulo" => "Abstract" "resumen" => "Azospirillum brasilense Az39 has been used since more than 30 years by several companies in South America for biofertilizers production. This strain may promote plants growth and development, as well as the ability of inoculated plants to tolerate environmental stresses, which determines an increase in the productivity under field conditions. At present, there are no protocols in Argentina to confirm the identity of Az39 in commercial products; however, such biofertilizers are formulated almost exclusively with this strain. Therefore, the objective of this paper was to develop a molecular methodology that allows the accurate identification of A. brasilense Az39. Using the complete genome sequence and several bioinformatics tools, fragments of DNA present only in the Az39 genome were recognized. A set of PCR primers to amplify these sequences were designed, and the specific products were observed only in the strain of our interest. The sensitivity of the methodology was evaluated, where the strain could be detected up to a titer of 105 CFU/ml (4.5 ng/μl ADN) or 102 CFU/ml (0.88 ng/μl DNA) or in a minimal concentration of 0.098 ng/μl DNA, depending on the DNA extraction methodology used. Primers were tested against direct samples of commercial inoculants and cultures, in both cases there were specifics products, both in direct samples and in confirmatory tests from isolated colonies from those products. The procedure presented in this paper allows the accurate identification of A. brasilense Az39 in pure cultures, mixtures of microorganisms, and commercial biofertilizers." ] ] "NotaPie" => array:1 [ 0 => array:3 [ "etiqueta" => "1" "nota" => "A.C. y G.L. tienen igual contribución en el trabajo." 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C y D) Electroforesis en gel de agarosa 1% de los productos de amplificación con los cebadores 16S rRNA específicos de género (Lin et al., 2011) utilizados como control positivo para las cepas Azospirillum spp. Referencias: (MM) marcador de peso molecular 100bp Trans Plus ADN Ladder; (1) A. brasilense Az39; (2) A. brasilense Sp245; (3) A. brasilense FP2; (4) A. brasilense Abv5; (5) A. brasilense Abv6; (6) A. brasilense Az 19; (7) A. brasilense Az 36; (8) A. brasilense Az 45; (9) A. brasilense Az 48; (10) A. brasilense Az 63; (11) A. brasilense Az 65; (12) Pseudomonas protegens CHA0; (13) Bradyrhizobium japonicum E109; (14) A. formosense CC-Nfb-7; (15) A. fermentarium CC-LY743; (16) A. halopraeferens Au4; (17) A. oryzae COC8; (18) A. palatum WW10; (19) A. melinis TMYC 0552; (20) A. lipoferum Sp59b; (21) A. canadense DS2; (22) A. rugosum IMMIB AFH-6; (23) A. agrícola CC-HIH038; (24) A. soli CC-Ly788; (25) A. zeae N7; (C-) control negativo (agua)." ] ] 1 => array:7 [ "identificador" => "fig0010" "etiqueta" => "Figura 2" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr2.jpeg" "Alto" => 623 "Ancho" => 2155 "Tamanyo" => 46721 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "Electroforesis en gel de agarosa 1% de los productos de amplificación con el par de cebadores TP5 para la determinación de la sensibilidad del método a partir de ADN molde obtenido por A) resina Chelex® 100 y B) kit comercial. Referencias A): (MM) marcador molecular 100bp Trans Plus ADN Ladder; (1). A. brasilense Az39 109 UFC/ml); (2) 108 UFC/ml; (3) 107 UFC/ml; (4) 106 UFC/ml; (5) 105 UFC/ml; (6) 104 UFC/ml; (7) 103 UFC/ml; (8) 102 UFC/ml. Referencias B): (MM) marcador molecular 100bp Trans Plus ADN Ladder; (1) A. brasilense Az39 8,5x105 UFC/ml); (2) 5,3x104 UFC/ml; (3) 6,7x103 UFC/ml; (4) 2,5x102 UFC/ml (equivalente a 0,88 ng/μl ADN); (5)* 0,098 ng/μl ADN y (6)** 0,0092 ng/μl de ADN. Dilución *decimal y ** centesimal de la muestra obtenida de ADN en (4)." ] ] 2 => array:7 [ "identificador" => "fig0015" "etiqueta" => "Figura 3" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr3.jpeg" "Alto" => 800 "Ancho" => 2341 "Tamanyo" => 86797 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "Electroforesis en gel de agarosa al 1% de los productos de amplificación con los cebadores TP5 en la evaluación de la especificidad en cultivos mixtos. Referencias A): (MM) marcador de peso molecular 1kb GeneRuler™; (1) 100% B. japonicum E109; (2) 70% B. japonicum E109 + 30% A. brasilense Az39; (3) 50% B. japonicum E109 + 50% A. brasilense Az39; (4) 30% B. japonicum E109 + 70% A. brasilense Az39; (5) 100% A. brasilense Az39. Referencias B): (1) mezcla 1; (2) mezcla 2; (3) mezcla 3; (MM) marcador de peso molecular 100bp Trans Plus ADN Ladder; (4) control negativo mezcla 1; (5) control negativo mezcla 2; (6) control negativo mezcla 3." ] ] 3 => array:7 [ "identificador" => "fig0020" "etiqueta" => "Figura 4" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr4.jpeg" "Alto" => 777 "Ancho" => 1333 "Tamanyo" => 38074 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "Electroforesis en gel de agarosa 1% de los productos de amplificación con el par de cebadores TP5 en muestras directas de inoculantes. Referencias: (MM) marcador molecular 100bp Trans Plus ADN Ladder; (1) control negativo (agua); (2) A. brasilense Az39; (3) inoculante I1; (4) inoculante I2; (5) inoculante I3." ] ] 4 => array:8 [ "identificador" => "tbl0005" "etiqueta" => "Tabla 1" "tipo" => "MULTIMEDIATABLA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "detalles" => array:1 [ 0 => array:3 [ "identificador" => "at1" "detalle" => "Tabla " "rol" => "short" ] ] "tabla" => array:2 [ "tablatextoimagen" => array:1 [ 0 => array:2 [ "tabla" => array:1 [ 0 => """ <table border="0" frame="\n \t\t\t\t\tvoid\n \t\t\t\t" class=""><thead title="thead"><tr title="table-row"><th class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-head\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Especie \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-head\n \t\t\t\t " align="center" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Cepa \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; 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entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. brasilense<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0010">b</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">FP2 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. brasilense<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0010">b</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Abv5 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. brasilense<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0010">b</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Abv6 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. brasilense<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005">a</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Az 19 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. brasilense<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005">a</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Az 36 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. brasilense<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005">a</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Az 45 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. brasilense<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005">a</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Az 48 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. brasilense<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005">a</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Az 63 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. brasilense<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005">a</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Az 65 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. formosense<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0015">c</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">CC-Nfb-7 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. fermentarium<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0015">c</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">CC-Ly743 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. halopraeferens<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020">d</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Au4 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. oryzae<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020">d</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">COC8 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. palatum<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020">d</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">WW10 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. melinis<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020">d</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">TMYC 0552 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. lipoferum<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020">d</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Sp59b \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. canadense<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020">d</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">DS2 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. rugosum<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020">d</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">IMMIB AFH-6 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. agricola<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020">d</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">CC-HIH038 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. soli<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020">d</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">CC-Ly788 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">A. zeae<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020">d</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">N7 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Pseudomonas protegens (ex-fluorescens)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005">a</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">CHA0 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Bradyrhizobium japonicum<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005">a</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">E109 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">Bacillus subtilis<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005">a</a> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">BH8 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr></tbody></table> """ ] "imagenFichero" => array:1 [ 0 => "xTab2257475.png" ] ] ] "notaPie" => array:4 [ 0 => array:3 [ "identificador" => "tblfn0005" "etiqueta" => "a" "nota" => "IMyZA-INTA Castelar (Buenos Aires, Argentina)." ] 1 => array:3 [ "identificador" => "tblfn0010" "etiqueta" => "b" "nota" => "Universidad Federal de Paraná (Curitiba, Brasil)." ] 2 => array:3 [ "identificador" => "tblfn0015" "etiqueta" => "c" "nota" => "Universidad Nacional Chung Hsing (Chung Hsing, Taiwán)." ] 3 => array:3 [ "identificador" => "tblfn0020" "etiqueta" => "d" "nota" => "Universidad de Lyon (Lyon, Francia)." ] ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "Cepas bacterianas evaluadas en este trabajo" ] ] 5 => array:8 [ "identificador" => "tbl0010" "etiqueta" => "Tabla 2" "tipo" => "MULTIMEDIATABLA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "detalles" => array:1 [ 0 => array:3 [ "identificador" => "at2" "detalle" => "Tabla " "rol" => "short" ] ] "tabla" => array:2 [ "tablatextoimagen" => array:1 [ 0 => array:2 [ "tabla" => array:1 [ 0 => """ <table border="0" frame="\n \t\t\t\t\tvoid\n \t\t\t\t" class=""><thead title="thead"><tr title="table-row"><th class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-head\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Par de cebadores \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-head\n \t\t\t\t " align="center" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Orientación \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-head\n \t\t\t\t " align="center" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Secuencia(5’-3’) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-head\n \t\t\t\t " align="center" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Tamaño(nt) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-head\n \t\t\t\t " align="center" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Contenido G+C(%) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-head\n \t\t\t\t " align="center" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Temperatura de melting<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0025">a</a>(°C) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-head\n \t\t\t\t " align="center" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Secuencia blanco(Figura S1’) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-head\n \t\t\t\t " align="center" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Tamaño del amplicón(pb) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">TP5 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">F \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">GGCCGTTGTTCTCGGTCTCTAT \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">22 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">54,5 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">60,6 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">4 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">307 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t"> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">R \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">GCGATCTCCATTTATTTCGCCCT \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">23 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">47,8 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">59,2 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t"> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t"> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">TP6 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">F \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">ATCAAGACGCTCGCCACC \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">18 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">61,1 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">59,7 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">4 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">401 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t"> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">R \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">CGATCTCCATTTATTTCGCCCTTC \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">24 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">45,8 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">57,7 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t"> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t"> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">EM1 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">F \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">GCATGTACAGTGTGATCAGGGAG \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">23 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">52,2 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">58,7 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">5 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">611 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t"> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">R \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">GCCGCGATTACTTCAACCTCT \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">21 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">52,1 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">59,1 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t"> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t"> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">TM1 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">F \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">GGAGGAATCCACGGAATCCC \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">20 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">60 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">60,0 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">8 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">306 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t"> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">R \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">TTTCCAAGGTCCGAGCCTTC \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">20 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">55 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="left" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t">59,3 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t"> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n \t\t\t\t\ttable-entry\n \t\t\t\t " align="" valign="\n \t\t\t\t\ttop\n \t\t\t\t"> \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr></tbody></table> """ ] "imagenFichero" => array:1 [ 0 => "xTab2257474.png" ] ] ] "notaPie" => array:1 [ 0 => array:3 [ "identificador" => "tblfn0025" "etiqueta" => "a" "nota" => "Valores de Tm calculados con el software ofrecido por Thermo Fisher Scientific®." ] ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "Cebadores diseñados y probados experimentalmente en este trabajo" ] ] 6 => array:5 [ "identificador" => "upi0005" "tipo" => "MULTIMEDIAECOMPONENTE" "mostrarFloat" => false "mostrarDisplay" => true "Ecomponente" => array:2 [ "fichero" => "mmc1.pdf" "ficheroTamanyo" => 741210 ] ] ] "bibliografia" => array:2 [ "titulo" => "Bibliografía" "seccion" => array:1 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "bibs0015" "bibliografiaReferencia" => array:40 [ 0 => array:3 [ "identificador" => "bib0205" "etiqueta" => "1" "referencia" => array:1 [ 0 => array:1 [ "referenciaCompleta" => "Albanesi A, Benitende S, Bonfiglio C, Cassán F, Gonzalez F, Lett L, Penna C, Perticari A, Rossi A, Torresani S. 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ORIGINAL

Development of sequence characterized amplified region markers for identification of Azospirillum brasilense Az39

Anahí Coniglioa,1, Gastón Lópeza,1, José Gualpaa, Romina Molinaa, Susana Rosasa, Mariana Puenteb, Verónica Moraa, Fabricio Cassána,

Autor para correspondencia

fcassan@exa.unrc.edu.ar

Autor para correspondencia.

a Laboratorio de Fisiología Vegetal y de la Interacción Planta-Microorganismo, Departamento de Ciencias Naturales, FCEFQyN, Universidad Nacional de Río Cuarto

b Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Instituto de Microbiología y Zoología Agrícola (IMYZA), Castelar, Buenos Aires, Argentina

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          "es" => "<p id="spar0020" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">A y B&#41; Electroforesis en gel de agarosa 1&#37; de los productos de amplificaci&#243;n con los cebadores TP5&#44; espec&#237;ficos para la cepa Az39&#46; C y D&#41; Electroforesis en gel de agarosa 1&#37; de los productos de amplificaci&#243;n con los cebadores 16S rRNA espec&#237;ficos de g&#233;nero &#40;Lin et al&#46;&#44; 2011&#41; utilizados como control positivo para las cepas <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span> spp&#46; <span class="elsevierStyleItalic">Referencias</span>&#58; &#40;MM&#41; marcador de peso molecular 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>bp Trans Plus ADN Ladder&#59; &#40;1&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39&#59; &#40;2&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Sp245&#59; &#40;3&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> FP2&#59; &#40;4&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Abv5&#59; &#40;5&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Abv6&#59; &#40;6&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az 19&#59; &#40;7&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az 36&#59; &#40;8&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az 45&#59; &#40;9&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az 48&#59; &#40;10&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az 63&#59; &#40;11&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az 65&#59; &#40;12&#41; <span class="elsevierStyleItalic">Pseudomonas protegens</span> CHA0&#59; &#40;13&#41; <span class="elsevierStyleItalic">Bradyrhizobium japonicum</span> E109&#59; &#40;14&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; formosense</span> CC-Nfb-7&#59; &#40;15&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; fermentarium</span> CC-LY743&#59; &#40;16&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; halopraeferens</span> Au4&#59; &#40;17&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; oryzae</span> COC8&#59; &#40;18&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; palatum</span> WW10&#59; &#40;19&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; melinis</span> TMYC 0552&#59; &#40;20&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; lipoferum</span> Sp59b&#59; &#40;21&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; canadense</span> DS2&#59; &#40;22&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; rugosum</span> IMMIB AFH-6&#59; &#40;23&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; agr&#237;cola</span> CC-HIH038&#59; &#40;24&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; soli</span> CC-Ly788&#59; &#40;25&#41; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; zeae</span> N7&#59; &#40;C-&#41; control negativo &#40;agua&#41;&#46;</p>"
        ]
      ]
    ]
    "textoCompleto" => "<span class="elsevierStyleSections"><span id="sec0005" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0030">Introducci&#243;n</span><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La necesidad de la aplicaci&#243;n de pr&#225;cticas agr&#237;colas sustentables ha llevado al desarrollo de bioinsumos en base a microorganismos capaces de promover el crecimiento de las plantas &#40;<span class="elsevierStyleItalic">Plant Growth Promoting Rhizobacteria</span>&#41; con el fin de aumentar el rendimiento en los cultivos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0300"><span class="elsevierStyleSup">20</span></a>&#46; En los &#250;ltimos a&#241;os el mercado mundial de bioinsumos ha crecido con una tasa sostenida cercana al 10&#37; y con una expectativa de alcanzar los 4&#46;092 millones de d&#243;lares en el 2025<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0290"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a>&#46; Dentro de las <span class="elsevierStyleItalic">Plant Growth Promoting Rhizobacteria</span> uno de los g&#233;neros mejor caracterizados es <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span>&#44; siendo <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum brasilense</span> una de las especies m&#225;s estudiadas y ampliamente utilizada en la producci&#243;n de formulados biol&#243;gicos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0255"><span class="elsevierStyleSup">11&#44;26</span></a>&#46; A lo largo de los a&#241;os&#44; el g&#233;nero <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span> ha demostrado ser capaz de promover el crecimiento y desarrollo de numerosas especies vegetales de inter&#233;s agr&#237;cola a trav&#233;s de numerosos mecanismos fisiol&#243;gicos o bioqu&#237;micos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0220"><span class="elsevierStyleSup">4</span></a>&#46; Entre dichos mecanismos se incluyen&#44; la fijaci&#243;n biol&#243;gica de nitr&#243;geno&#44; que tuvo menos relevancia agron&#243;mica de la inicialmente esperada&#44; o la producci&#243;n de fitohormonas y otros reguladores del crecimiento de plantas&#44; que ha tenido mayor importancia en los &#250;ltimos a&#241;os<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0220"><span class="elsevierStyleSup">4&#44;5</span></a>&#46; En Sudam&#233;rica&#44; existen alrededor de 106 productos comerciales formulados en base a <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> y aproximadamente el 90&#37; de estos productos son desarrollados en nuestro pa&#237;s&#44; siendo la cepa Az39 de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> el principio activo m&#225;s frecuentemente utilizado en Am&#233;rica de Sur&#44; con un 75&#37; de prevalencia en el mercado nacional y brasilero<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0255"><span class="elsevierStyleSup">11</span></a>&#46; La cepa Az39&#44; fue aislada en el Instituto Nacional de Tecnolog&#237;a Agropecuaria-Instituto de Microbiolog&#237;a y Zoolog&#237;a Agr&#237;cola en la d&#233;cada del 80&#44; mediante un programa de identificaci&#243;n y selecci&#243;n de cepas de <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span> spp&#46; de la superficie de ra&#237;ces esterilizadas de plantas de trigo en la localidad de Marcos Ju&#225;rez en la provincia de C&#243;rdoba&#46; Este programa&#44; adem&#225;s&#44; realiz&#243; la evaluaci&#243;n de la capacidad promotora del crecimiento de Az39 y otras cepas del mismo g&#233;nero en condiciones agron&#243;micas&#44; siendo la primera la m&#225;s eficiente&#46; Como consecuencia&#44; el Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria&#44; junto con las empresas productoras de inoculantes decidieron recomendarla inicialmente para la producci&#243;n de bioinsumos destinados al tratamiento biol&#243;gico de semillas de ma&#237;z&#44; trigo&#44; sorgo y otras especies de no leguminosas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0250"><span class="elsevierStyleSup">10&#44;33</span></a> y a la fecha para m&#225;s de 16 especies vegetales dentro de las que se incluyen las mencionadas y otras como algod&#243;n&#44; tabaco&#44; cebada&#44; arroz y soja en coinoculaci&#243;n con <span class="elsevierStyleItalic">Bradyrhizobium japonicum</span>&#46; Despu&#233;s de m&#225;s de 30 a&#241;os desde su aislamiento y de convertirse en una de las cepas m&#225;s estudiadas <span class="elsevierStyleItalic">in planta</span> como a campo&#44; el laboratorio de Fisiolog&#237;a Vegetal y de la Interacci&#243;n Planta Microorganismo de la Universidad Nacional de R&#237;o Cuarto en el a&#241;o 2012 inici&#243; un ambicioso proyecto para secuenciar el genoma de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39&#44; lo que culmin&#243; exitosamente con la obtenci&#243;n de la secuencia completa y cerrada del mismo en el a&#241;o 2014<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0360"><span class="elsevierStyleSup">32</span></a>&#46; El genoma de Az39 consiste de 6&#46;311 secuencias codificantes distribuidas en 6 replicones &#40;un cromosoma&#44; 3 cr&#243;midos y 2 pl&#225;smidos&#41;&#46; La obtenci&#243;n de la secuencia del genoma fue considerada como la base para el desarrollo de numerosos estudios posgen&#243;micos dentro de los que se incluyen la generaci&#243;n de herramientas moleculares para estudiar con mayor precisi&#243;n y profundidad la capacidad de esta bacteria para promover el crecimiento vegetal&#46;</p><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Sin embargo&#44; como se mencion&#243; anteriormente&#44; a pesar de que el uso de bioinsumos y dentro de ellos aquellos formulados con esta cepa&#44; aumenta a&#241;o a a&#241;o&#44; no hay normativas gubernamentales estrictas que regulen la calidad y trazabilidad de los productos en el sistema agroalimentario<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0310"><span class="elsevierStyleSup">22</span></a>&#46; M&#225;s aun&#44; en la Rep&#250;blica Argentina&#44; no existen protocolos que permitan autenticar la identidad de la cepa Az39 de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> en formulaciones comercializadas para diferentes tipos de cultivo&#46; Hasta el momento&#44; la identificaci&#243;n de este microorganismo se realiza mediante metodolog&#237;as de microbiolog&#237;a cl&#225;sica&#44; pero estas no son suficientes para asegurar con certeza la identidad del microorganismo a nivel de cepa<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0250"><span class="elsevierStyleSup">10</span></a>&#46; Algunos autores han avanzado en este sentido y han desarrollado metodolog&#237;as que permiten la identificaci&#243;n a nivel de cepas dentro de una misma especie<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0260"><span class="elsevierStyleSup">12&#44;13&#44;28</span></a>&#46; De este modo&#44; el desarrollo de herramientas moleculares basadas en la secuencia del ADN&#44; permiten establecer la identidad de ciertos microorganismos de manera confiable y precisa&#46; La utilizaci&#243;n de marcadores moleculares del tipo <span class="elsevierStyleItalic">Sequence</span><span class="elsevierStyleItalic">Characterized Amplified</span><span class="elsevierStyleItalic">Regions</span> &#40;SCAR&#41; es una de las alternativas con la que se ha conseguido la identificaci&#243;n molecular a nivel de cepa&#46; Los marcadores SCAR representan <span class="elsevierStyleItalic">loci</span> &#250;nicos&#44; gen&#233;ticamente definidos&#44; que se identifican mediante amplificaci&#243;n por PCR usando fragmentos de ADN gen&#243;mico con cebadores espec&#237;ficos&#46; Teniendo en cuenta las consideraciones anteriores&#44; el presente trabajo tuvo como objetivo emplear estas herramientas moleculares para desarrollar una metodolog&#237;a simple&#44; r&#225;pida y certera que permita la identificaci&#243;n cepa-espec&#237;fica de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39 en cultivos puros o mezclas de microorganismos&#46;</p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0035">Materiales y m&#233;todos</span><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0040">Material biol&#243;gico</span><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los microorganismos utilizados en este trabajo se resumen en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a>&#46; Los cultivos bacterianos pertenecientes al g&#233;nero <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span> se obtuvieron a partir de colonias puras cultivadas a 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C o 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C &#40;seg&#250;n la cepa evaluada&#41;&#44; durante 72<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h en el medio de cultivo Luria Bertani &#40;LB&#41; modificado por la adici&#243;n de soluci&#243;n de rojo Congo &#40;LBRC&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0320"><span class="elsevierStyleSup">24</span></a>&#46; Las colonias se repicaron en tubos de ensayo conteniendo 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de caldo LB<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0240"><span class="elsevierStyleSup">8</span></a>&#46; Las cepas <span class="elsevierStyleItalic">Pseudomonas protegens</span> CHA0 y <span class="elsevierStyleItalic">Bacillus subtilis</span> BH8&#44; cultivadas en caldo LB y aisladas en agar LB&#44; se utilizaron como control negativo&#46; El medio EMA<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0400"><span class="elsevierStyleSup">40</span></a> se utiliz&#243; para el crecimiento de <span class="elsevierStyleItalic">B&#46; japonicum</span> E109 y se determin&#243; su pureza por ausencia de crecimiento en medio agar tripticasa soya<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0205"><span class="elsevierStyleSup">1</span></a>&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0045">An&#225;lisis genot&#237;pico <span class="elsevierStyleItalic">in silico</span> y desarrollo de marcadores del tipo SCAR</span><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para el an&#225;lisis <span class="elsevierStyleItalic">in silico</span> se utiliz&#243; el software http&#58;&#47;&#47;insilico&#46;ehu&#46;eus&#47;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0245"><span class="elsevierStyleSup">9</span></a>&#46; En primer lugar&#44; se carg&#243; la secuencia gen&#243;mica de la cepa Az39 fraccionada en tres archivos&#44; uno conteniendo el cromosoma&#44; y otros dos con los pl&#225;smidos y cr&#243;midos&#44; respectivamente&#46; Luego&#44; se simularon m&#250;ltiples <span class="elsevierStyleItalic">Amplified</span><span class="elsevierStyleItalic">Fragment Length Polymorphism</span> &#40;AFLP-PCR&#41; utilizando diferentes combinaciones enzim&#225;ticas y nucle&#243;tidos de selecci&#243;n&#44; ordenados al azar&#46; A continuaci&#243;n&#44; se seleccionaron secuencias de ADN con longitudes de entre 200-800 pares de bases &#40;pb&#41;&#46; Estas secuencias fueron comparadas con las secuencias de nucle&#243;tidos no redundantes disponibles en la base de datos de <span class="elsevierStyleItalic">National Center for Biotechnology Information</span>&#44; mediante el uso de la plataforma BLASTn &#91;https&#58;&#47;&#47;blast&#46;ncbi&#46;nlm&#46;nih&#46;gov&#47;Blast&#46;cgi&#93;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0215"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a> y se seleccionaron las secuencias &#250;nicas para la cepa Az39 de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span>&#46;</p></span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0050">Dise&#241;o de cebadores espec&#237;ficos para <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39</span><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El dise&#241;o de cebadores se llev&#243; a cabo empleando la plataforma bioinform&#225;tica Primer3<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0295"><span class="elsevierStyleSup">19&#44;36</span></a> acoplada al sitio web <a href="http://ins%26iacute;lico.ehu.eus/primer3/">http&#58;&#47;&#47;ins&#237;lico&#46;ehu&#46;eus&#47;primer3&#47;</a> a partir de las regiones no hom&#243;logas identificadas con la plataforma BLASTn&#46; Se tuvieron en cuenta los siguientes par&#225;metros <span class="elsevierStyleItalic">&#40;i&#41;</span> porcentaje de guanina-citosina &#40;&#37; G&#43;C&#41; entre 40-60&#37;&#59; <span class="elsevierStyleItalic">&#40;ii&#41;</span> temperatura de melting &#40;Tm&#41; entre 55-61<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#59; y <span class="elsevierStyleItalic">&#40;iii&#41;</span> longitud del <span class="elsevierStyleItalic">primer</span> entre 18-24 pb&#46; Asimismo&#44; los pares de cebadores dise&#241;ados fueron analizados con el software OligoAnalyzer 3&#46;1 ofrecido por <span class="elsevierStyleItalic">Integrated ADN Technologies</span>&#44; para evaluar la formaci&#243;n de estructuras secundarias&#44; como bucles en la misma hebra de ADN<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0335"><span class="elsevierStyleSup">27</span></a>&#44; formaci&#243;n de homod&#237;meros y heterod&#237;meros&#46; Por otro lado&#44; se prob&#243; la complementariedad de las secuencias de los oligonucle&#243;tidos mediante el uso del <span class="elsevierStyleItalic">National Center for Biotechnology Information</span>-BLAST<span class="elsevierStyleSup">3</span> y <span class="elsevierStyleItalic">Prokaryotic Genome DataBase</span> en https&#58;&#47;&#47;www&#46;genoscope&#46;cns&#46;fr&#47;agc&#47;microscope&#47;search&#47;blast&#46;php<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0385"><span class="elsevierStyleSup">37</span></a>&#46; Finalmente&#44; se simul&#243; una PCR <span class="elsevierStyleItalic">in silico</span>&#44; para evaluar el correcto funcionamiento de los cebadores dise&#241;ados&#46; Los cebadores seleccionados fueron sintetizados y evaluados <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span>&#46;</p></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0055">Extracci&#243;n de ADN</span><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La extracci&#243;n del ADN gen&#243;mico se realiz&#243; a partir de colonias aisladas o cultivos puros de Az39 empleando alternativamente dos metodolog&#237;as&#58; &#40;1&#41; el kit comercial Easy Pure Bacteria Genomic ADN de la firma Transgen Inc&#46; &#40;China&#41;&#44; de acuerdo a las especificaciones del fabricante y &#40;2&#41; la resina de intercambio i&#243;nico Chelex&#174;100&#44; seg&#250;n la metodolog&#237;a propuesta por Alippi et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>&#46; En el caso de las colonias aisladas&#44; la extracci&#243;n solo se realiz&#243; por el m&#233;todo de resina y para ello las colonias fueron resuspendidas en 300<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de soluci&#243;n fisiol&#243;gica est&#233;ril &#40;SF&#41; &#40;8&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg&#47;ml de NaCl&#41;&#59; mientras que en el caso de los cultivos se utilizaron ambos m&#233;todos y para ello se parti&#243; de un volumen de 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de muestra que se centrifug&#243; durante 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a 10 000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>rpm y cuyo <span class="elsevierStyleItalic">pellet</span> se resuspendi&#243; en 300<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de SF est&#233;ril&#46; En el caso de la extracci&#243;n con resina&#44; los <span class="elsevierStyleItalic">pellets</span> fueron resuspendidos en 150<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de una soluci&#243;n de Chelex&#174;100 al 6&#37; &#40;p&#47;v&#41; y las muestras se incubaron en un ba&#241;o termost&#225;tico a 56<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min seguido de una incubaci&#243;n a 99<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 8<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#44; sometiendo las muestras a agitaci&#243;n vigorosa entre cada per&#237;odo de incubaci&#243;n&#46; Finalmente&#44; se realiz&#243; un &#250;ltimo paso de centrifugado durante 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a 10 000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>rpm&#46; El sobrenadante se utiliz&#243; inmediatamente como molde para la realizaci&#243;n de las reacciones de PCR o fue fraccionado y conservado a -20&#176;C hasta su utilizaci&#243;n&#46;</p></span><span id="sec0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0060">Determinaci&#243;n de la temperatura &#243;ptima de hibridaci&#243;n de los cebadores</span><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para conocer la temperatura &#243;ptima de hibridaci&#243;n o <span class="elsevierStyleItalic">annealing</span> &#40;Ta&#41; para la reacci&#243;n&#44; se realiz&#243; una PCR a tiempo final con gradiente de temperatura&#44; probando diferentes Ta en un rango de 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#46; Como molde se utiliz&#243; el ADN gen&#243;mico de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39&#46; La mezcla de reacci&#243;n consisti&#243; en un volumen final de 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l conteniendo 1 unidad de EasyTaq ADN polimerasa &#40;TransGen Biotech&#44; China&#41;&#59; EasyTaq <span class="elsevierStyleItalic">buffer</span> 1X &#40;TransGen Biotech&#44; China&#41;&#59; 0&#44;4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM de dNTPs &#40;Promega&#44; Madision&#44; Wis&#46;&#41;&#59; 0&#44;4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M de cada <span class="elsevierStyleItalic">primer</span> &#40;IDT Technologies&#41; y 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de ADN molde&#46; Las condiciones de amplificaci&#243;n fueron las siguientes&#58; una desnaturalizaci&#243;n inicial de 2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a 95<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#44; seguida de 30 ciclos de desnaturalizaci&#243;n por 0&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a 95<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#59; hibridaci&#243;n de 0&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min desde 55&#44;2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C hasta 61&#44;4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C y extensi&#243;n de 0&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a 72<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#44; con una extensi&#243;n final de 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a 72<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#46; La amplificaci&#243;n se realiz&#243; en un termociclador Ivema T21 &#40;Ivema Desarrollos&#41;&#46; Los productos de PCR fueron revelados mediante electroforesis en gel de agarosa 1&#37; &#40;p&#47;v&#41; te&#241;idos con Bromuro de Etidio &#40;BrEt&#41; y visualizados con un transiluminador UV &#40;Maestrogen&#44; MLB-16 124&#44; Taiwan&#41;&#46;</p></span><span id="sec0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0065">Determinaci&#243;n de la especificidad</span><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para evaluar la especificidad de los cebadores dise&#241;ados previamente&#44; se utiliz&#243; como muestra el ADN gen&#243;mico de diferentes cepas de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span>&#44; as&#237; como el ADN de otras especies pertenecientes al g&#233;nero y microorganismos distanciados filogen&#233;ticamente &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a>&#41;&#46; Las condiciones de reacci&#243;n de PCR y los ciclos de amplificaci&#243;n empleados se realizaron seg&#250;n lo descrito anteriormente&#44; variando la Ta de acuerdo a los resultados &#243;ptimos obtenidos&#46; Con los microorganismos pertenecientes al g&#233;nero <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span> descritos en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a>&#44; se realiz&#243; la amplificaci&#243;n por PCR con cebadores espec&#237;ficos para el gen 16S rRNA seg&#250;n Lin et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0305"><span class="elsevierStyleSup">21</span></a> a modo de control para confirmar la identidad de las cepas empleadas en el an&#225;lisis&#46; En el caso de los microorganismos distanciados filogen&#233;ticamente&#44; se utilizaron los cebadores BOX-AR1 seg&#250;n Versalovic et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0395"><span class="elsevierStyleSup">39</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0045" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0070">Determinaci&#243;n de la sensibilidad del m&#233;todo</span><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para evaluar la sensibilidad del m&#233;todo&#44; se utiliz&#243; ADN gen&#243;mico como molde para la amplificaci&#243;n por PCR&#44; el cual fue obtenido alternativamente por extracci&#243;n con un kit comercial o por resina de intercambio i&#243;nico&#44; como se describi&#243; previamente&#46; A modo de resumen&#44; 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de un cultivo puro de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39 fue diluido por duplicado en tubos conteniendo 9<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de soluci&#243;n fisiol&#243;gica est&#233;ril para obtener tubos con una diluci&#243;n inicial de 10<span class="elsevierStyleSup">-1</span> a partir de los que se realizaron diluciones decimales hasta alcanzar un valor de 10<span class="elsevierStyleSup">-7</span>&#46; A continuaci&#243;n&#44; se tomaron 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de cada diluci&#243;n y se realiz&#243; un recuento por la t&#233;cnica de microgota<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0355"><span class="elsevierStyleSup">31</span></a> para confirmar el n&#250;mero de c&#233;lulas viables&#46; Del mismo tubo&#44; se tom&#243; 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml para la extracci&#243;n con resina&#46; El segundo tubo fue utilizado para la extracci&#243;n de ADN mediante kit y la cuantificaci&#243;n de la concentraci&#243;n de ADN por la utilizaci&#243;n de un NanoDrop One de la firma Thermo Fischer Inc&#46;</p><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">&#40;EE&#46; UU&#46;&#41;&#46; La determinaci&#243;n se realiz&#243; sobre el total de c&#233;lulas &#40;UFC&#47;ml&#41; obtenidas por centrifugaci&#243;n de cada diluci&#243;n&#46; Adicionalmente&#44; se midi&#243; la concentraci&#243;n de ADN de diluciones en base decimal y centesimal del ADN obtenido a partir de una diluci&#243;n 10<span class="elsevierStyleSup">-7</span> equivalente a un valor te&#243;rico de 1x10<span class="elsevierStyleSup">2</span> UFC&#47;ml&#46; En todos los casos se utiliz&#243; como control negativo agua MilliQ esterilizada&#46;</p></span><span id="sec0050" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0075">Determinaci&#243;n de la especificidad en cultivos mixtos con <span class="elsevierStyleItalic">B&#46; japonicum</span> E109</span><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Cultivos mixtos de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39 y <span class="elsevierStyleItalic">B&#46; japonicum</span> E109&#44; se obtuvieron independientemente en medios LB y EMA&#44; hasta alcanzar una DO<span class="elsevierStyleInf">595</span> aprox&#46; 1&#44;9&#46; Ambos cultivos se mezclaron en tubos pl&#225;sticos de 1&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de capacidad en diferentes proporciones de cada microorganismo &#40;p&#46; ej&#46; 100&#37; de E109&#59; 70&#37; E109 &#43; 30&#37; Az39&#59; 50&#37; E109 &#43; 50&#37; Az39&#59; 30&#37; E109 &#43; 70&#37; Az39 y 100&#37; Az39&#41;&#46; De cada una de las mezclas&#44; se extrajo el ADN gen&#243;mico mediante la metodolog&#237;a detallada anteriormente para cultivos en medio l&#237;quido&#46; El ADN obtenido se utiliz&#243; como molde para reacciones de PCR espec&#237;ficas con los cebadores dise&#241;ados en este trabajo &#40;denominados TP5&#41;&#46;</p></span><span id="sec0055" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0080">Determinaci&#243;n de la especificidad en cultivos mixtos con m&#225;s de una cepa de <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span></span><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se realizaron tres mezclas diferentes de cultivos bacterianos pertenecientes al g&#233;nero <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span>&#44; combinados en igual proporci&#243;n&#46; En el caso de la mezcla 1&#44; se emplearon las cepas de la misma especie <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39&#44; Sp7 y Sp245&#46; Por otro lado&#44; en la mezcla 2 se utilizaron las cepas <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39&#44; Sp7 y Sp245&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; zeae</span> N7<span class="elsevierStyleItalic">&#44; A&#46; melinis</span> TMYC 0552&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; halopraeferens</span> Au4<span class="elsevierStyleItalic">&#44; A&#46; canadense</span> DS2 y <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; rugosum</span> IMMIB AFH-6 pertenecientes a distintas especies del g&#233;nero&#46; Finalmente&#44; en la mezcla 3 se utilizaron <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39<span class="elsevierStyleItalic">&#44; A&#46; formosense</span> CC-Nfb-7&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; fermentarium</span> CC-LY743&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; oryzae</span> COC8&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; palatum</span> WW10&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; lipoferum</span> Sp59b&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; agricola</span> CC-HIH038 y <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; soli</span> CC-Ly788&#46; Todas las cepas empleadas en estos experimentos se cultivaron en medio MMAB<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0390"><span class="elsevierStyleSup">38</span></a> durante 24 h&#46; Se tom&#243; 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de cada cultivo&#44; se centrifug&#243; a 10 000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>rpm durante 10 min y se ajustaron a igual DO<span class="elsevierStyleInf">595</span>&#44; con el objetivo de que todas las cepas tuvieran igual concentraci&#243;n &#40;aprox&#46; 1 x10<span class="elsevierStyleSup">9</span> UFC&#47;ml&#41;&#46; Las mezclas se realizaron en microtubos de 1&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml a volumen final 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml&#44; colocando iguales proporciones de los diferentes cultivos&#46; Luego&#44; a partir de cada mezcla bacteriana se extrajo el ADN con Chelex&#174;100 seg&#250;n la metodolog&#237;a descrita anteriormente&#46; Finalmente&#44; el ADN gen&#243;mico de las mezclas fue utilizado como molde para PCR con los cebadores espec&#237;ficos de Az39&#46; Como control negativo se utilizaron mezclas sin Az39&#46;</p></span><span id="sec0060" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0085">Control de calidad de formulaciones comerciales</span><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se emplearon tres productos comerciales recomendados para el tratamiento de semillas de trigo y ma&#237;z&#44; que en su membrete indicaban contener como principio activo <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39&#44; a los que denominamos aleatoriamente I1&#44; I2 e I3&#46; En el caso del producto I1 declaraba una fecha de vencimiento tres meses posteriores a la fecha del an&#225;lisis&#44; en el caso de I2 se encontraba al l&#237;mite de la fecha de vencimiento y en el caso de I3 hab&#237;a vencido 6 meses antes de realizar este an&#225;lisis&#46; A modo de aclaraci&#243;n&#44; es necesario mencionar que&#44; en Argentina&#44; el valor de recuento l&#237;mite a la fecha de vencimiento para productos comerciales conteniendo <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span> es de 1x10<span class="elsevierStyleSup">7</span> UFC&#46;ml<span class="elsevierStyleSup">-1</span>&#46; Para la toma de muestras&#44; se homogenizaron las vejigas con el inoculante durante 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#44; se esterilizaron las superficies y se tomaron 2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de cada muestra para la posterior extracci&#243;n de ADN por el m&#233;todo de Chelex&#174;100&#46; Adicionalmente&#44; se tom&#243; 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml para el recuento&#46; Previo a la extracci&#243;n de ADN&#44; se realiz&#243; un lavado con soluci&#243;n fisiol&#243;gica y las c&#233;lulas se concentraron en un volumen final de 300<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l&#46; Luego se prosigui&#243; con la metodolog&#237;a descrita previamente con la resina Chelex&#174;100&#46; El recuento se realiz&#243; por la t&#233;cnica de microgota<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0355"><span class="elsevierStyleSup">31</span></a> y para ello las muestras fueron colocadas en 9<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de SF est&#233;ril para obtener la diluci&#243;n 10<span class="elsevierStyleSup">-1</span> de la que se realizaron diluciones decimales para alcanzar una diluci&#243;n de 10<span class="elsevierStyleSup">-7</span>&#46; A continuaci&#243;n&#44; se tomaron 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de cada diluci&#243;n&#44; se sembraron en placas de LBRC y se incubaron a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 72 h&#46; Se realiz&#243; el recuento de colonias y se calcul&#243; el n&#250;mero de UFC&#47;ml&#46; Adicionalmente&#44; las muestras se sembraron en placas de LBRC en estr&#237;as por agotamiento y a partir de las colonias crecidas en este medio&#44; se extrajo ADN con la resina Chelex&#174;100 y se utiliz&#243; como molde para la amplificaci&#243;n por PCR con los cebadores TP5 a modo de confirmar la identidad de las colonias obtenidas&#46;</p></span></span><span id="sec0065" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0090">Resultados</span><span id="sec0070" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0095">An&#225;lisis genot&#237;pico <span class="elsevierStyleItalic">in silico</span> y desarrollo de marcadores moleculares del tipo SCAR</span><p id="par0090" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Mediante la simulaci&#243;n de 400 AFLP-PCR <span class="elsevierStyleItalic">in silico</span>&#44; se seleccionaron 700 secuencias candidatas con un tama&#241;o entre 200 y 800 pb&#46; Cuando estas secuencias fueron comparadas mediante BLASTn&#44; solo 12 de ellas no presentaron homolog&#237;a con secuencias depositadas en la base de datos o exhibieron fragmentos de al menos 200 pb &#250;nicos en el genoma de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39 &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">fig&#46; S1</a>&#41;&#46; Las secuencias &#250;nicas en el genoma de Az39 se localizaron en el cromosoma de dicha bacteria&#44; algunas de ellas ubicadas en regiones no codificantes como en el caso de las secuencias 6&#44; 7&#44; 9 y 10 de la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">figura S2</a>&#59; mientras que otras se encontraron en regiones de secuencias que codifican para prote&#237;nas hipot&#233;ticas&#46; Espec&#237;ficamente&#44; en el caso de los productos de los cebadores evaluados <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> en este trabajo TP5&#44; TP6&#44; TM 1 y EM1&#44; todos se encontraron dentro de regiones que codifican para prote&#237;nas hipot&#233;ticas &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">fig&#46; S2</a>&#41;&#46; Un total de 18 pares de cebadores fueron dise&#241;ados para la amplificaci&#243;n de las regiones no hom&#243;logas&#46; Se observ&#243; que todos los cebadores fueron capaces de formar estructuras como homod&#237;meros&#44; heterod&#237;meros y bucles dentro de la misma mol&#233;cula de ADN&#44; sin embargo&#44; se escogieron 4 pares de cebadores cuyas caracter&#237;sticas termodin&#225;micas demostraron que las posibles estructuras secundarias eran inestables&#46; Adicionalmente&#44; cuando se simularon reacciones de PCR en los genomas de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Sp45&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; lipoferum</span> 4B&#44; <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span> sp&#46; B510 y <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span> spp&#46; el resultado fue negativo&#46; M&#225;s a&#250;n&#44; no se observ&#243; amplificaci&#243;n en otras especies de <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum&#44;</span> ni en otros g&#233;neros bacterianos presentes com&#250;nmente en el suelo&#44; entre ellos <span class="elsevierStyleItalic">Bradyrhizobium</span>&#44; <span class="elsevierStyleItalic">Pseudomonas</span>&#44; <span class="elsevierStyleItalic">Bacillus</span>&#44; <span class="elsevierStyleItalic">Rhodospirillum&#44; Rhizobium&#44; Sinorhizobium</span> o <span class="elsevierStyleItalic">Nitrosomonas</span>&#46; Las secuencias de los oligonucle&#243;tidos sintetizadas y probadas <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> se muestran en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0010">tabla 2</a> y estas amplifican las regiones n&#250;mero 4&#44; 5 y 8 de la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">figura S1</a> y de la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">figura S3</a>&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0010"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0075" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0100">An&#225;lisis <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> de los cebadores espec&#237;ficos para Az39</span><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los 4 pares de cebadores dise&#241;ados fueron capaces de amplificar en todas las temperaturas evaluadas &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">fig&#46; S4</a>&#41;&#46; En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">figura S4A</a> se observa que el par TP5 amplific&#243; un fragmento de 307 pb&#59; mientras que los pares de cebadores denominados TP6 y TM1 originaron amplicones de 401 pb y 306 pb respectivamente &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">fig&#46; S4B</a>&#41;&#46; La amplificaci&#243;n con el par de cebadores denominado EM1 dio como resultado un amplic&#243;n esperado de 611 pb y una banda adicional que corresponde a un fragmento entre 100 pb y 200 pb &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">fig&#46; S4C</a>&#41;&#46; Ambas bandas se observaron solo en la cepa Az39&#44; inclusive cuando la Ta fue de 65<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C &#40;datos no mostrados&#41;&#46; En funci&#243;n de los resultados obtenidos en esta secci&#243;n&#44; se seleccionaron las siguientes Ta&#58; 59&#44;1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#59; 55&#44;2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C y 56&#44;4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C para cada par de cebadores TP5&#44; TP6 y TM1 respectivamente&#46; Debido a que el par de cebadores EM1 era capaz de amplificar en regiones inespec&#237;ficas no fue utilizado para los ensayos posteriores de este trabajo&#46;</p></span><span id="sec0080" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0105">Determinaci&#243;n de la especificidad y sensibilidad del m&#233;todo</span><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">figura 1</a> se muestran los resultados obtenidos en la evaluaci&#243;n de la especificidad del par de cebadores denominados TP5 en cultivos puros&#46; El ciclo de reacci&#243;n se llev&#243; a cabo con una temperatura de alineamiento de 59&#44;1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#46; Cuando se utiliz&#243; como molde el ADN gen&#243;mico de cepas de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> filogen&#233;ticamente relacionadas con Az39&#44; los resultados fueron negativos &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig&#46; 1</a>A&#41;&#44; lo que demuestra el alto grado de especificidad de los cebadores dise&#241;ados&#46; Las cepas evaluadas fueron <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Sp245&#44; FP2&#44; Abv5 y Abv6 &#40;utilizadas en la producci&#243;n de inoculantes en Brasil&#41;&#59; Az 19&#44; Az 36&#44; Az 45&#44; Az 48&#44; Az 63 y Az 65 &#40;pertenecientes a la colecci&#243;n del Instituto Nacional de Tecnolog&#237;a Agropecuaria-Instituto de Microbiolog&#237;a y Zoolog&#237;a Agr&#237;cola&#41;&#46; Tampoco se observaron productos de PCR en otras cepas pertenecientes a diferentes especies del g&#233;nero como <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; formosense</span> CC-Nfb-7&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; fermentarium</span> CC-LY743&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; halopraeferens</span> Au4&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; oryzae</span> COC8&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; palatum</span> WW10&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; melinis</span> TMYC 0552&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; lipoferum</span> Sp59b&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; canadense</span> DS2&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; rugosum</span> IMMIB AFH-6&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; agr&#237;cola</span> CC-HIH038&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; soli</span> CC-Ly788 y <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; zeae</span> N7 &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig&#46; 1</a>B&#41;&#46; Otras cepas no relacionadas filogen&#233;ticamente con este g&#233;nero&#44; pero frecuentemente utilizadas para la formulaci&#243;n comercial de inoculantes combinados con <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39 fueron evaluadas&#46; Estas cepas fueron <span class="elsevierStyleItalic">P&#46; protegens</span> &#40;ex-<span class="elsevierStyleItalic">P&#46; fluorescens</span>&#41; CHA0&#44; <span class="elsevierStyleItalic">B&#46; japonicum</span> E109 y <span class="elsevierStyleItalic">B&#46; subtilis</span> BH8 y ninguna present&#243; resultados positivos para la amplificaci&#243;n con los cebadores TP5&#46; En las <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">figura 1</a>C y D se observa la amplificaci&#243;n del gen 16S rRNA con los cebadores espec&#237;ficos para el g&#233;nero <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span> utilizados como control<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0305"><span class="elsevierStyleSup">21</span></a>&#46; Por otro lado&#44; se comprob&#243; la amplificaci&#243;n por PCR con cebadores del tipo BOX-AR1 en las cepas pertenecientes a otros g&#233;neros microbianos &#40;datos no mostrados&#41;&#46; La evaluaci&#243;n con los cebadores TP6 y TM1 present&#243; resultados inesperados ya que hubo amplificaci&#243;n inespec&#237;fica en algunas cepas del g&#233;nero&#44; por lo que los mismos fueron descartados para ensayos posteriores de este trabajo&#46; Si bien&#44; se analiz&#243; el total de las cepas presentadas en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a> con los cebadores TP6 y TM1 &#40;datos no mostrados&#41;&#44; en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0120">figura S5</a> se presentan a modo de ejemplo algunos de los productos inespec&#237;ficos amplificados por dichos cebadores&#46; Algunas cepas amplificaron bandas &#250;nicas&#44; definidas y de peso molecular diferente al esperado para el caso de Az39&#59; mientras que en otras se observ&#243; m&#225;s de un producto de PCR&#46; A pesar de que los cebadores TP6 y TM1 amplificaron de manera inespec&#237;fica para otros microorganismos&#44; fueron eficientes para diferenciar la cepa Az39 del resto de las cepas evaluadas ya que&#44; aun existiendo amplificaci&#243;n inespec&#237;fica&#44; fue posible distinguir <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39 de otras cepas&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En cuanto a la sensibilidad&#44; la metodolog&#237;a fue probada con el par de cebadores denominado TP5 ya que result&#243; ser el m&#225;s espec&#237;fico para la reacci&#243;n de PCR&#46; En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">figura 2</a>A se observan los productos de amplificaci&#243;n de PCR empleando el par de cebadores TP5 para los que se utiliz&#243; como molde ADN extra&#237;do por la resina Chelex&#174; 100&#44; a partir de diluciones decimales de un cultivo puro de Az39&#46; Nuestros resultados demuestran que el punto de corte con esta metodolog&#237;a se obtiene en la diluci&#243;n 10<span class="elsevierStyleSup">-4</span> equivalente a un t&#237;tulo bacteriano de 2&#44;5x10<span class="elsevierStyleSup">5</span> UFC&#47;ml o una concentraci&#243;n de ADN equivalente a 4&#44;5 ng&#47;&#956;l ADN&#46; En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">figura 2</a>B se observan los productos de amplificaci&#243;n de PCR&#44; utilizando como molde ADN extra&#237;do por un kit comercial&#46; Nuestros resultados muestran que el punto de corte de esta metodolog&#237;a&#44; teniendo en cuenta el n&#250;mero de c&#233;lulas&#44; se obtiene en diluci&#243;n 10<span class="elsevierStyleSup">-7</span>&#44; equivalente a un t&#237;tulo de 4&#44;5 x 10<span class="elsevierStyleSup">2</span> UFC&#47;ml y con un contenido equivalente de ADN de 0&#44;88 ng&#47;&#956;l&#59; sin embargo&#44; el l&#237;mite de detecci&#243;n en base a la concentraci&#243;n de ADN fue establecido donde la amplificaci&#243;n se alcanz&#243; con 0&#44;098 ng&#47;&#956;l de ADN&#44; a pesar de que la amplificaci&#243;n fue tenuemente observada en una concentraci&#243;n inferior de ADN &#40;0&#44;0092 ng&#47;&#956;l&#41;&#46; El recuento inicial del cultivo del cual se realizaron las diluciones fue 2&#44;5x10<span class="elsevierStyleSup">9</span> UFC&#47;ml&#46; Es importante aclarar que cuando el ADN fue extra&#237;do con la metodolog&#237;a de Alippi et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a> se obtuvieron resultados similares para las amplificaciones realizadas con los cebadores TP6 &#40;datos no mostrados&#41;&#46; En funci&#243;n de los resultados obtenidos a nivel de la especificidad y sensibilidad del m&#233;todo en cultivos puros&#44; se pudo determinar la especificidad en cultivos mixtos&#46; En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">figura 3</a>A se observa la amplificaci&#243;n por PCR empleando los cebadores TP5&#44; a partir de mezclas de cultivos puros de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39 y <span class="elsevierStyleItalic">B&#46; japonicum</span> E109 en distintas proporciones&#46; Los resultados demostraron que cuando la cepa Az39 est&#225; presente&#44; la amplificaci&#243;n por PCR es positiva independientemente de las proporciones de los microorganismos presentes en la mezcla&#46; La especificidad en mezclas de <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span> se evalu&#243; mezclando por un lado cepas de la misma especie &#40;mezcla 1&#41; y cepas pertenecientes a distintas especies &#40;mezcla 2 y 3&#41;&#46; En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">figura 3</a>B se observa el resultado para las tres mezclas de cultivos evaluadas&#44; donde el producto de 307 pb se obtuvo en todos los casos en los que estuvo presente Az39&#59; mientras que los resultados negativos fueron pertenecientes a las mezclas control sin el agregado de esta cepa&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="fig0015"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0085" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0110">Control de calidad de formulados comerciales</span><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Desde el punto de vista del an&#225;lisis microbiol&#243;gico de los productos comerciales empleados en este trabajo&#44; podemos mencionar que los resultados obtenidos a partir del empleo de la t&#233;cnica de recuento por microgota arrojaron los siguientes t&#237;tulos de recuento&#58; 5&#44;8 x 10<span class="elsevierStyleSup">8</span> UFC&#47;ml para el formulado I1&#59; 3&#44;38 x 10<span class="elsevierStyleSup">7</span> UFC&#47;ml y para el formulado I2 y &#60; 1 x 10<span class="elsevierStyleSup">5</span> UFC&#47;ml para el formulado I3&#46; En el caso de I1 e I2 se observaron colonias color rojo escarlata&#44; con una superficie plana-craquelada&#44; con bordes redondeados y textura seca&#59; morfolog&#237;a t&#237;pica para este grupo bacteriano&#46; En el caso de I3 solo se observaron estas colonias despu&#233;s de sembrar de manera directa una al&#237;cuota del producto en una placa conteniendo medio LBRC agarizado&#46; Cuando el ADN molde utilizado fue obtenido a partir de colonias puras cultivadas de los recuentos &#40;I1 e I2&#41; o de la siembra en directo del producto I3&#44; la electroforesis en gel de agarosa&#44; present&#243; resultados positivos para los tres productos comerciales &#40;datos no mostrados&#41;&#46; Mientras que cuando se utiliz&#243; como molde el ADN obtenido directamente de los formulados&#44; resultados positivos se observaron para los inoculantes I1 e I2&#59; sin embargo&#44; en el caso del inoculante I3&#44; no se observ&#243; amplificaci&#243;n &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig&#46; 4</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0020"></elsevierMultimedia></span></span><span id="sec0090" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0115">Discusi&#243;n</span><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Nuestro trabajo consisti&#243; en realizar una identificaci&#243;n certera de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39&#44; a trav&#233;s de una metodolog&#237;a r&#225;pida y accesible&#44; que pueda ser utilizada como una estrategia de control de calidad de inoculantes comerciales&#46; Esto se logr&#243; mediante el desarrollo de marcadores moleculares del tipo SCAR&#46; Hasta el momento&#44; la identificaci&#243;n cepa-espec&#237;fica se pod&#237;a realizar mediante el marcado de la misma con genes reporteros&#44; pero esto involucra modificaciones a nivel gen&#233;tico&#44; y solo puede aplicarse con fines de investigaci&#243;n<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0270"><span class="elsevierStyleSup">14</span></a>&#46; La amplificaci&#243;n por PCR de secuencias espec&#237;ficas de cada cepa es una metodolog&#237;a simple y permite detectar particularidades de la cepa sin necesidad de su modificaci&#243;n gen&#233;tica&#46; El uso de herramientas bioinform&#225;ticas y el acceso a la secuencia completa del genoma de Az39 nos permiti&#243; hallar fragmentos &#250;nicos en la secuencia de ADN de esta cepa&#46; La b&#250;squeda se realiz&#243; mediante la simulaci&#243;n de AFLP-PCR <span class="elsevierStyleItalic">in silico</span>&#46; La mayor&#237;a de los trabajos donde se aborda la problem&#225;tica de la identificaci&#243;n espec&#237;fica de cepas&#44; se realizan de manera experimental a trav&#233;s de la b&#250;squeda de secuencias &#250;nicas utilizando metodolog&#237;as del tipo fingerprinting<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0275"><span class="elsevierStyleSup">15&#44;16</span></a>&#46; Esta alternativa resulta m&#225;s costosa&#44; laboriosa e implica una mayor inversi&#243;n de tiempo&#44; pero es de gran utilidad cuando se desconoce la secuencia gen&#243;mica de la bacteria de inter&#233;s&#46; Entre los trabajos publicados donde obtienen marcadores SCAR espec&#237;ficos para otros microorganismos del g&#233;nero <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span> de manera experimental&#44; se encuentran los realizados por Couillerot et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0260"><span class="elsevierStyleSup">12&#44;13</span></a> y de Priya et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0340"><span class="elsevierStyleSup">28</span></a>&#46; Estos autores lograron desarrollar protocolos de identificaci&#243;n y cuantificaci&#243;n por qPCR con cebadores dise&#241;ados para amplificar secuencias espec&#237;ficas de las cepas <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; lipoferum</span> CRT1<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0265"><span class="elsevierStyleSup">13</span></a>&#44; <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> UAP-154 y CFN-535<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0260"><span class="elsevierStyleSup">12</span></a> y <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span> sp&#46; Az204 y <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Sp7<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0340"><span class="elsevierStyleSup">28</span></a>&#44; respectivamente&#46; Cabe destacar que no se han encontrado trabajos donde se lleve a cabo de manera <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> la b&#250;squeda de secuencias SCAR a partir de AFLP-PCR&#59; sin embargo&#44; la disponibilidad de secuencias gen&#243;micas en diferentes bases de datos&#44; permite el desarrollo de estas novedosas herramientas como alternativa&#46; Tal es as&#237; que se ha logrado encontrar secuencias espec&#237;ficas de manera <span class="elsevierStyleItalic">in silico</span>&#44; mediante el corte en peque&#241;os fragmentos de 500 pb &#40;simulaci&#243;n de digesti&#243;n enzim&#225;tica&#41; del ADN gen&#243;mico de una cepa de inter&#233;s&#46; Con el posterior an&#225;lisis mediante BLAST sobre el genoma de una cepa cercanamente relacionada<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0375"><span class="elsevierStyleSup">35</span></a> &#40;hibridaci&#243;n y eliminaci&#243;n de los fragmentos compartidos&#41;&#46; De este modo&#44; se detectaron fragmentos &#250;nicos para la identificaci&#243;n de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> FP2 mediante la amplificaci&#243;n por PCR de secuencias espec&#237;ficas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0375"><span class="elsevierStyleSup">35</span></a>&#46; Este abordaje permiti&#243; la identificaci&#243;n certera de la cepa de una manera diferente a la planteada en este trabajo&#44; pero igualmente efectiva&#46; La herramienta molecular utilizada en nuestro trabajo ha permitido desarrollar una metodolog&#237;a simple&#44; r&#225;pida y econ&#243;mica&#44; comparada con los reportes previos&#59; que permite de igual modo conseguir una gran cantidad de secuencias espec&#237;ficas para la identificaci&#243;n de la cepa&#46;</p><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los fragmentos de ADN encontrados&#44; distinguidos por estar presentes &#250;nicamente en el genoma de Az39&#44; fueron utilizados como molde para el dise&#241;o de los cebadores&#46; Cuatro de estos pares de cebadores fueron evaluados <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span>&#46; Solo el par denominado TP5 demostr&#243; ser espec&#237;fico desde una primera instancia&#44; el mismo fue seleccionado para las evaluaciones posteriores&#46; En el caso de los otros cebadores&#44; el grado de especificidad fue bajo&#44; sin embargo&#44; es posible aumentar la misma variando condiciones como lo son la Ta&#44; el tiempo de elongaci&#243;n o la concentraci&#243;n de cebadores&#46; A pesar de esta diferencia observada entre los ensayos <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> e in <span class="elsevierStyleItalic">silico</span>&#44; para los cebadores TP6 y TM1&#44; con respecto a otros microorganismos&#44; siempre se observ&#243; el producto esperado en AZ39&#46; Adicionalmente&#44; ensayos preliminares realizados en nuestro laboratorio&#44; demostraron que el aumento de la Ta mejora la especificidad con respecto a la amplificaci&#243;n sobre otras cepas &#40;datos no mostrados&#41;&#59; sin embargo&#44; en el caso de los cebadores EM1&#44; no se observ&#243; el producto esperado y este tipo de diferencias entre los resultados obtenidos <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> e <span class="elsevierStyleItalic">in silico</span> tambi&#233;n han sido observados en otros trabajos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0285"><span class="elsevierStyleSup">17&#44;25</span></a>&#46; De manera general&#44; los pares de cebadores TP6&#44; TM1 y EM1 fueron descartados a lo largo de los experimentos debido a que el par TP5 present&#243; el mejor comportamiento&#46;</p><p id="par0125" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En cuanto a la prueba de especificidad en una mezcla bacteriana&#44; en el trabajo de Shime-Hattori et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0370"><span class="elsevierStyleSup">34</span></a> utilizaron una cepa de <span class="elsevierStyleItalic">Bacillus</span> en diferentes proporciones&#46; Ensayos similares fueron realizados en nuestro laboratorio&#44; empleando una mezcla de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39 con <span class="elsevierStyleItalic">B&#46; japonicum</span> E109&#46; Existen reportes que demuestran que la coinoculaci&#243;n con ambas cepas en plantas de soja&#44; genera un efecto positivo en la estimulaci&#243;n del crecimiento de este cultivo<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0235"><span class="elsevierStyleSup">7&#44;29&#44;30</span></a>&#46; En base a esta evidencia&#44; y teniendo en cuenta que en la actualidad se comercializan inoculantes formulados con ambas bacterias&#44; probamos que los cebadores dise&#241;ados para <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39 fueron eficientes&#46; As&#237; como tambi&#233;n fueron capaces de distinguir la cepa de inter&#233;s en mezclas con microorganismos del mismo g&#233;nero y especie&#46;</p><p id="par0130" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En los ensayos con mezclas bacterianas&#44; el par TP5 demostr&#243; su aptitud de diferenciar Az39 de otras cepas&#44; pero siempre respetando una concentraci&#243;n final de c&#233;lulas de Az39 por encima del valor de 10<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0225"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a> UFC&#47;ml cuando se emplea el m&#233;todo de extracci&#243;n con Chelex&#174; 100&#46; A pesar de las desventajas observadas en la extracci&#243;n de ADN con esta resina fue propuesta como un m&#233;todo alternativo debido a que a los fines de control de calidad de inoculantes es m&#225;s accesible y econ&#243;mico que la utilizaci&#243;n de kit comerciales&#46; Otra metodolog&#237;a alternativa para la detecci&#243;n directa desde formulados comerciales consistir&#237;a en la utilizaci&#243;n de Sephadex G100 al 10&#37;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0340"><span class="elsevierStyleSup">28</span></a>&#46;</p><p id="par0135" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Hasta el momento&#44; el control de calidad de inoculantes a base de <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span> se realiza seg&#250;n lo expresa el manual de Procedimientos de la REDCAI<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0250"><span class="elsevierStyleSup">10</span></a>&#46; El mismo consiste en el recuento de c&#233;lulas viables mediante la metodolog&#237;a de siembra en placas por extensi&#243;n en superficie en medio rojo Congo&#46; Para la evaluaci&#243;n de microorganismos contaminantes&#44; el manual de procedimientos sugiere la siembra directa en medio agar tripticasa soya para los microorganismos en general y en agar Sabouraud para hongos saprof&#237;ticos&#46; Adicionalmente se sugiere una coloraci&#243;n mediante la t&#233;cnica de Gram y la observaci&#243;n al microscopio de un preparado fresco de la muestra&#46; Por otra parte&#44; debido al dimorfismo de colonias de <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span> sp&#46;&#44; en placas de medio rojo Congo&#44; se realiza una prueba de la capacidad diazotr&#243;fica en condiciones de microaerofilia en medio NFb&#44; de las colonias consideradas presuntivas&#46; En nuestro trabajo proponemos complementar la metodolog&#237;a propuesta por la REDCAI con la confirmaci&#243;n molecular de la identidad de la cepa&#46; Los pares de cebadores dise&#241;ados en nuestro trabajo cumplieron con los requisitos esperados respecto a la especificidad de la cepa Az39 en muestras comerciales&#46; Nuestros resultados demostraron que la combinaci&#243;n de las metodolog&#237;as de microbiolog&#237;a cl&#225;sica y molecular permiten la evaluaci&#243;n eficiente de la calidad de inoculantes con diferente aptitud comercial&#44; ya que se pudo distinguir entre productos dentro y fuera de la fecha de vencimiento y con recuentos por encima y debajo de la garant&#237;a de tales productos&#46; En cuanto al l&#237;mite de detecci&#243;n de la reacci&#243;n de PCR&#44; el mismo fue dependiente de la metodolog&#237;a de extracci&#243;n de ADN empleada&#44; siendo en este caso para la resina Chelex&#174; 100 del orden de 10<span class="elsevierStyleSup">5</span> UFC&#47;ml y equivalente a 4&#44;5 ng&#47;&#956;l ADN&#46; Si bien&#44; la sensibilidad del m&#233;todo es baja empleando la resina i&#243;nica&#44; es necesario destacar que los productos comerciales formulados con <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span> deben contener no menos de 1x10<span class="elsevierStyleSup">9</span> UFC&#47;ml a la fecha de elaboraci&#243;n y no menos de 1x10<span class="elsevierStyleSup">7</span> UFC&#47;ml a la fecha de vencimiento&#44; por lo que el m&#233;todo de extracci&#243;n con resina&#44; a pesar de su baja eficiencia&#44; todav&#237;a ser&#237;a &#250;til si consideramos la definici&#243;n de producto apto para uso agr&#237;cola con m&#225;s de 1x10<span class="elsevierStyleSup">7</span> UFC&#47;ml&#46; Por otro lado&#44; un aumento significativo de la sensibilidad del m&#233;todo fue obtenido cuando el ADN bacteriano se extrajo con un kit comercial&#44; para el que un t&#237;tulo bacteriano de 10<span class="elsevierStyleSup">2</span> UFC&#47;ml o una concentraci&#243;n equivalente de ADN de 0&#44;88 ng&#47;&#956;l fue suficiente para su amplificaci&#243;n por PCR&#46; De la misma manera&#44; concentraciones de ADN diez y cien veces inferior a la equivalente en 10<span class="elsevierStyleSup">2</span> UFC&#47;ml &#40;0&#44;098 o 0&#44;0092 ng&#47;&#956;l&#41; resultaron positivas para la amplificaci&#243;n&#44; aunque en el &#250;ltimo caso&#44; tenuemente&#46; Esto indica claramente que el l&#237;mite de la metodolog&#237;a de amplificaci&#243;n por PCR est&#225; por debajo del l&#237;mite de detecci&#243;n del m&#233;todo de recuento de bacterias viables disponible en este momento&#46; Finalmente y de manera complementaria&#44; podemos decir que otros investigadores han desarrollado metodolog&#237;as similares para la identificaci&#243;n de microorganismos a nivel de g&#233;nero&#44; que pueden ser utilizadas de manera complementaria para la evaluaci&#243;n del control de calidad de inoculantes<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">6&#44;21&#44;23&#44;34</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0095" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0120">Conclusi&#243;n</span><p id="par0140" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La caracterizaci&#243;n fenot&#237;pica no es suficiente para la identificaci&#243;n inequ&#237;voca de un microorganismo&#44; pero puede bridar conocimientos sobre la pureza de un cultivo y el n&#250;mero de microorganismos presentes en el mismo&#46; Esto reafirma que&#44; en muchos casos&#44; la combinaci&#243;n de t&#233;cnicas microbiol&#243;gicas y moleculares es una estrategia clave para establecer un procedimiento efectivo de control de calidad&#46; Muchas t&#233;cnicas moleculares han sido descritas para la identificaci&#243;n de <span class="elsevierStyleItalic">Azospirillum</span> pero ninguna destinada al reconocimiento espec&#237;fico de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39&#44; la cepa m&#225;s utilizada para la formulaci&#243;n de inoculantes en la Rep&#250;blica Argentina&#46; Hasta el momento&#44; la identificaci&#243;n de esta cepa empleando herramientas moleculares se puede realizar por genotipado &#40;16S rRNA y <span class="elsevierStyleItalic">rpoD</span>&#41; de una manera relativamente r&#225;pida&#59; sin embargo&#44; estas metodolog&#237;as requieren de amplificaci&#243;n y secuenciaci&#243;n&#44; por lo que las hace impr&#225;cticas para el an&#225;lisis cotidiano&#46; En este trabajo&#44; la disponibilidad de herramientas bioinform&#225;ticas accesibles de manera gratuita y la ventaja de contar con la secuencia del genoma de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39&#44; nos permiti&#243; realizar el an&#225;lisis del polimorfismo de ADN en nuestra cepa de inter&#233;s&#46; Esta estrategia condujo al hallazgo de secuencias &#250;nicas en el genoma de Az39&#46; El dise&#241;o de cebadores&#44; dirigidos a dichas secuencias&#44; demostr&#243; no solo ser espec&#237;fico a nivel <span class="elsevierStyleItalic">in silico&#44;</span> sino que tambi&#233;n permite determinar la presencia de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> Az39 en un cultivo puro tan solo con amplificaci&#243;n y electroforesis en gel de agarosa&#46; Estas metodolog&#237;as resultan ser pr&#225;cticas y accesibles&#44; adem&#225;s hacen posible una identificaci&#243;n de rutina certera&#46; A pesar de la desventaja que presenta la t&#233;cnica desarrollada en cuanto al bajo poder de detecci&#243;n obtenido&#44; donde la extracci&#243;n del ADN gen&#243;mico de las muestras se obtiene por t&#233;cnicas robustas&#44; sencillas&#44; r&#225;pidas y de bajo costo&#44; es exitosa tanto en cultivos puros como en mezclas bacterianas&#46; As&#237; como tambi&#233;n&#44; los resultados obtenidos para formulados comerciales permitieron demostrar que los productos evaluados estaban formulados con la cepa Az39 de <span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span> recomendada por el Servicio Nacional de Sanidad Animal &#40;Servicio Nacional de Sanidad y Calidad Agroalimentaria&#41; en la Rep&#250;blica Argentina para la producci&#243;n de inoculantes para numerosas especies vegetales de inter&#233;s agr&#237;cola&#46;</p></span><span id="sec0100" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0125">Financiaci&#243;n</span><p id="par0145" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Este trabajo fue financiado por el Consejo Nacional de Investigaci&#243;n Cient&#237;fica Tecnol&#243;gica de Argentina &#40;CONICET&#41; y el Fondo Nacional de Ciencia y Tecnolog&#237;a &#40;FONCyT&#41;&#44; a trav&#233;s de sus proyectos PICT-2012-1051 y PICT 2015-1599&#46;</p></span><span id="sec0105" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0130">Conflicto de intereses</span><p id="par0150" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran no tener ning&#250;n conflicto de intereses&#46;</p></span></span>"
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                  \t\t\t\t">Abv6&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t">Az 19&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t">Az 36&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005"><span class="elsevierStyleSup">a</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Az 45&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005"><span class="elsevierStyleSup">a</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Az 48&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005"><span class="elsevierStyleSup">a</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Az 63&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
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                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">A&#46; brasilense</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005"><span class="elsevierStyleSup">a</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Az 65&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">A&#46; formosense</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0015"><span class="elsevierStyleSup">c</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">CC-Nfb-7&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">A&#46; fermentarium</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0015"><span class="elsevierStyleSup">c</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">CC-Ly743&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">A&#46; halopraeferens</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020"><span class="elsevierStyleSup">d</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Au4&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">A&#46; oryzae</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020"><span class="elsevierStyleSup">d</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">COC8&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">A&#46; palatum</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020"><span class="elsevierStyleSup">d</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">WW10&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">A&#46; melinis</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020"><span class="elsevierStyleSup">d</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">TMYC 0552&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">A&#46; lipoferum</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020"><span class="elsevierStyleSup">d</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">Sp59b&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">A&#46; canadense</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020"><span class="elsevierStyleSup">d</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">DS2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">A&#46; rugosum</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020"><span class="elsevierStyleSup">d</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">IMMIB AFH-6&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">A&#46; agricola</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020"><span class="elsevierStyleSup">d</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">CC-HIH038&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">A&#46; soli</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020"><span class="elsevierStyleSup">d</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">CC-Ly788&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">A&#46; zeae</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0020"><span class="elsevierStyleSup">d</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">N7&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">Pseudomonas protegens &#40;ex-fluorescens&#41;</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005"><span class="elsevierStyleSup">a</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">CHA0&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
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                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">Bradyrhizobium japonicum</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005"><span class="elsevierStyleSup">a</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
                  \t\t\t\t  " align="left" valign="\n
                  \t\t\t\t\ttop\n
                  \t\t\t\t">E109&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="\n
                  \t\t\t\t\ttable-entry\n
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                  \t\t\t\t"><span class="elsevierStyleItalic">Bacillus subtilis</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0005"><span class="elsevierStyleSup">a</span></a>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Par de cebadores&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Orientaci&#243;n&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Secuencia&#40;5&#8217;-3&#8217;&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Tama&#241;o&#40;nt&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Contenido G&#43;C&#40;&#37;&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Temperatura de <span class="elsevierStyleItalic">melting</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tblfn0025"><span class="elsevierStyleSup">a</span></a>&#40;&#176;C&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Secuencia blanco&#40;Figura S1&#8217;&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t\t\t</th><th class="td" title="\n
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                  \t\t\t\t" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Tama&#241;o del amplic&#243;n&#40;pb&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t">ATCAAGACGCTCGCCACC&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t">61&#44;1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t">59&#44;7&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t">4&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t">R&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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Información del artículo

ISSN: 03257541
Idioma original: Español

DOI:10.1016/j.ram.2019.02.004

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2024 Octubre	70	6	76
2024 Septiembre	83	6	89
2024 Agosto	61	3	64
2024 Julio	89	5	94
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2024 Mayo	84	17	101
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2024 Marzo	108	22	130
2024 Febrero	104	33	137
2024 Enero	109	32	141
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2023 Febrero	64	20	84
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2021 Noviembre	135	30	165
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2021 Mayo	112	42	154
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2021 Marzo	93	19	112
2021 Febrero	58	12	70
2021 Enero	67	16	83
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2020 Noviembre	65	22	87
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2020 Septiembre	61	16	77
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2020 Mayo	50	39	89
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