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INFORME BREVE
Primer aislamiento de Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo tipo Hardjo Bovis a partir de un caso clínico en Argentina
First isolation of Leptospira borgpetersenii serovar Hardjo type Hardjo Bovis from a clinical case in cattle in Argentina
Ariel Alejandro Kovala,
Autor para correspondencia
ariel.koval@biogenesisbago.com

Autor para correspondencia.
, Bibiana Felicitas Brihuegac, Sylvia Grune Lofflerc,d, S. Lópeza, Marcos Saint Martina, Gustavo Germán Lagioiaa, Juan Ramón Insaugaratb
a Biogénesis-Bagó, Garín (Bs. As.), Argentina
b Med. Vet. actividad privada, Saladillo (Bs. As.), Argentina
c Laboratorio de Referencia para Leptospirosis OIE, INTA Castelar, (Bs. As.), Argentina
d Consejo Nacional en Investigaciones en Ciencia y Tecnología (CONICET), CABA, Argentina
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a pesar de que serol&#243;gicamente eran indistinguibles<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0110"><span class="elsevierStyleSup">8</span></a>&#46; Se comenz&#243; a discriminar al serovar Hardjo en tipos o genotipos Hardjoprajitno y Hardjo Bovis&#46;</p><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En la actualidad&#44; la clasificaci&#243;n gen&#233;tica refleja estas diferencias&#44; ya que el genotipo Hardjoprajitno est&#225; incluido dentro de la genomoespecie <span class="elsevierStyleItalic">Leptospira interrogans</span> y el genotipo Hardjo Bovis dentro de la genomoespecie <span class="elsevierStyleItalic">Leptospira borgpetersenii</span>&#46;</p><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La importancia epidemiol&#243;gica de esta diferenciaci&#243;n es que el hospedero de mantenimiento de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; borgpetersenii</span> serovar Hardjo tipo Hardjo Bovis es el bovino&#44; especie animal a la cual est&#225; adaptado&#46; Dicho serovar se encuentra ampliamente distribuido en todo el mundo<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0080"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>&#46;</p><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En Argentina&#44; existen numerosos reportes de aislamientos de leptospiras de casos cl&#237;nicos en bovinos&#44; donde el serovar predominante ha sido Pomona&#44; con algunos aislamientos espor&#225;dicos de Canicola<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0075"><span class="elsevierStyleSup">1&#44;4&#44;7</span></a>&#46;</p><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Hasta la fecha no existen reportes de aislamiento de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; borgpetersenii</span> serovar Hardjo Bovis de casos cl&#237;nicos de leptospirosis bovina&#46; Sin embargo&#44; dentro de la regi&#243;n&#44; se han reportado aislamientos de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; borgpetersenii</span> serovar Hardjo Bovis en Chile<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0135"><span class="elsevierStyleSup">13</span></a>&#44; Brasil<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0085"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a> y Uruguay<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0140"><span class="elsevierStyleSup">14</span></a>&#46;</p><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El objetivo de este trabajo es describir el primer aislamiento de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; borgpetersenii</span> serovar Hardjo Bovis a partir de un caso cl&#237;nico de leptospirosis bovina en Argentina&#46;</p><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El brote se present&#243; en un establecimiento de cr&#237;a pr&#243;ximo a la localidad de Saladillo &#40;35&#176; 38&#8217; 22&#46;1&#8220;S 59&#176; 46&#8217; 57&#46;6&#8221;W&#41;&#44; provincia de Buenos Aires&#44; durante los meses de abril y mayo del 2017&#44; en un per&#237;odo de elevadas precipitaciones e inundaciones&#44; que afectaron a gran parte de la regi&#243;n pampeana&#46; En el establecimiento se vacun&#243; para la prevenci&#243;n de enfermedades reproductivas&#44; entre ellas leptospirosis&#46; La vacuna inclu&#237;a &#250;nicamente al serovar Pomona&#46; Se presentaron abortos en aproximadamente un 3&#44;5&#37; de un total de 1&#46;700 vacas entre abril y mayo&#46; El veterinario asesor remiti&#243; muestras pareadas de suero a un laboratorio privado para estudios serol&#243;gicos&#46; Se encontraron t&#237;tulos positivos &#40;entre 1&#58;800 a 1&#58;1&#46;600&#41; por microaglutinaci&#243;n y seroconversi&#243;n frente a los serovares Wolffi y Hardjo&#46;</p><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para intentar el aislamiento de leptospiras&#44; se extrajo orina de animales abortados&#46; Se aplic&#243; furosemida &#40;Salix&#44; 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml por animal&#44; por v&#237;a intravenosa&#41; &#40;MSD&#44; N&#46;J&#46; USA&#46;&#41; a 20 vacas&#46; La orina &#40;50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml&#41; se colect&#243; en un frasco pl&#225;stico est&#233;ril de boca ancha a partir del chorro medio&#46;</p><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">De cada muestra de orina se sembraron 0&#44;2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml en un tubo que conten&#237;a 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de medio EMJH semis&#243;lido con 5-fluorouracilo&#46; La siembra se hizo <span class="elsevierStyleItalic">in situ&#44;</span> pocos minutos despu&#233;s de obtenida la muestra&#44; al abrigo de la llama de un mechero&#46;</p><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">De cada tubo sembrado se efectuaron inmediatamente 2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>diluciones seriadas &#40;1&#58;10 y 1&#58;100&#41; en el mismo medio de cultivo&#46;</p><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los tubos sembrados se llevaron al laboratorio a temperatura ambiente y se incubaron a 28-30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#46; La presencia de leptospiras se observ&#243; al microscopio de campo oscuro entre los 10 y 15 d&#237;as de incubaci&#243;n&#46; Las cepas aisladas se repicaron a medio EMJH l&#237;quido para poder efectuar una tipificaci&#243;n por microaglutinaci&#243;n hasta nivel de serogrupo&#46; Las 7 cepas aisladas se identificaron como pertenecientes al serogrupo Sejroe utilizando sueros hiperinmunes de referencia &#40;Royal Tropical Institute &#91;KIT&#93;&#41;&#46; Los t&#237;tulos aglutinantes fueron de 1&#58;12&#46;800 con suero anti-Hardjo&#46;</p><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los aislamientos se trasladaron desde Biog&#233;nesis Bag&#243; al Laboratorio de Leptospirosis de INTA Castelar para su tipificaci&#243;n molecular&#46;</p><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para la extracci&#243;n de ADN gen&#243;mico se tomaron 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l del cultivo en medio EMJH semis&#243;lido utilizando una resina quelante Chelex-100 &#40;BIO-RAD&#44; CA&#44; USA&#41;&#46; Una vez obtenido el ADN purificado&#44; se congel&#243; a<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#8722;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0095"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a>&#46;</p><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se puso a punto una PCR en tiempo final para la detecci&#243;n espec&#237;fica del serovar Hardjo Bovis utilizando un par de <span class="elsevierStyleItalic">primers</span> que amplifican el gen IS1533&#44; el cual corresponde a 85 copias del genoma de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; borgpetersenii</span> serovar Hardjo Bovis<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0120"><span class="elsevierStyleSup">10</span></a>&#46; Los <span class="elsevierStyleItalic">primers</span> utilizados fueron los siguientes&#58; P1805 5&#769;- GCGGAAAGTGAACCGTATCGAG-3&#769; y P1809 &#769;5-CTGATATTCGCGGGTTGGAAGG-3&#769;&#46; Los amplicones tienen 630 pares de bases&#46; El volumen final de reacci&#243;n fue de 25<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l y cada reacci&#243;n de PCR conten&#237;a buffer &#40;20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM Tris-HCl&#44; pH 8&#44;4&#59; 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM KCl&#41;&#44; 200<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M dNTPs&#44; 2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;M de cada <span class="elsevierStyleItalic">primer</span>&#44; 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM MgCl<span class="elsevierStyleInf">2</span>&#44; 1&#44;25 U Taq DNA polimerasa &#40;Invitrogen&#41; y 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de templado de ADN&#46; El programa de ciclado fue 94<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#44; seguido de 30 ciclos de 94<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C por 1&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#44; 67<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#44; 72<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#44; con una extensi&#243;n final de 10 min a 72<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#46; Los amplicones obtenidos &#40;15<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l&#41; se corrieron en un gel de agarosa al 2&#37; en buffer TAE 2X &#40;40<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM Tris-acetato&#44; 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM EDTA&#41; y te&#241;ido con bromuro de etidio 0&#44;2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;g&#47;ml durante 60 min a 100 V&#46; El tama&#241;o de los amplicones fue visualizado en un transiluminador de luz UV de cabina cubierta &#40;Uvi Tec modelo BTS-20&#46;M&#41; &#40;Uvi Tec&#44; Cambridge&#44; UK</p><p id="par0180" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Embiotec&#44; CABA&#44; Argentina&#41;&#46; Para ver el tama&#241;o de las bandas obtenidas se corri&#243; el gel con un marcador de 100 pb &#40;Embiotec&#41;&#46;</p><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se pueden observar&#44; en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">figura 1</a>&#44; los productos obtenidos con la PCR para el serovar Hardjo Bovis&#44; lo cual confirma que las cepas aisladas pertenecen a este serovar&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para la tipificaci&#243;n molecular de la cepa aislada se realiz&#243; MLVA&#44; utilizando los <span class="elsevierStyleItalic">primers</span> propuestos por Sala&#252;n et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0120"><span class="elsevierStyleSup">10</span></a> para flanquear los <span class="elsevierStyleItalic">loci&#58;</span> VNTR4 &#40;4a&#95;bis&#58; 5&#769;- AAGTAAAAGCGCTCCCAAGA-3&#769;&#59; 4b&#95;bis 5&#769;-&#58; ATAAAGGAAGCTCGGCGTTT&#41;&#44; VNTR7 &#40;7a&#95;bis&#58; 5&#769;-GATGATCCCAGAGAGTACCG-3&#769;&#59; 7<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>b&#58; 5&#769;- TCCCTCCACAGGTTGTCTTG-3&#769;&#41;&#44; VNTR10 &#40;10a&#95;bis&#58; 5&#769;- GAGTTCAGAAGAGACAAAAGC-3&#769;&#59; 10b&#95;bis 5&#769;-&#58; ACGTATCTTCATATTCTTTGCG-3&#769;&#41;&#44; VNTRLb4 Lb4a&#58; 5&#769;-AAGAAGATGATGGTAGAGACG-3&#769;&#59; Lb4b&#58; 5&#769;- ATTGCGAAACCAGATTTCCAC-3&#769;&#41; y VNTRLb5 &#40;Lb5a&#58; AGCGAGTTCGCCTACTTGC-3&#769;&#59; Lb5b&#58; 5&#769;- ATAAGACGATCAAGGAAACG-3&#769;&#41;&#46; El volumen final de reacci&#243;n fue de 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l y cada reacci&#243;n de PCR conten&#237;a buffer &#40;20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM Tris-HCl&#44; 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Los productos obtenidos se corrieron en un gel de agarosa&#44; de acuerdo con lo descripto en el punto anterior&#46; Se utiliz&#243; el programa GelAnalyzer 2010&#170; &#40;Gel Analizer 19&#46;1&#44; Istvan Lazar Jr&#46;&#44; PHD e Itsvan Lazar Sr&#46; PHD&#41; &#40;<a href="http://www.gelanalyzer.com/">http&#58;&#47;&#47;www&#46;gelanalyzer&#46;com</a>&#41;&#44; para determinar con exactitud los tama&#241;os correspondientes a las bandas&#46; A partir de esos datos se pudo calcular la cantidad de repeticiones o n&#250;meros de copias presentes &#40;alelos&#41;&#44; con la siguiente f&#243;rmula&#58;<elsevierMultimedia ident="eq0005"></elsevierMultimedia></p><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Con el n&#250;mero de repeticiones o copias para cada VNTR flanqueado ya determinado&#44; se obtiene un c&#243;digo num&#233;rico de la cepa tipificada&#46; Este c&#243;digo representa el genotipo de la cepa y se compara con la tabla de repeticiones publicada en el trabajo de Sala&#252;n et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0120"><span class="elsevierStyleSup">10</span></a>&#46; De esta manera&#44; se determin&#243; que la cepa aislada presentaba un perfil gen&#233;tico id&#233;ntico a <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; borgpetersenii</span> serovar Hardjo Bovis cepa Sponselee &#40;2&#44; 0&#44; 1&#44; 5&#44; 4&#41; &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig&#46; 2</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Una vez finalizada la tipificaci&#243;n en Argentina&#44; se remitieron las cepas aisladas al KIT con sede en Holanda&#44; para obtener la confirmaci&#243;n en un laboratorio de referencia a nivel mundial&#46; La tipificaci&#243;n serol&#243;gica confirm&#243; que los aislamientos remitidos pertenec&#237;an al serogrupo Sejroe&#44; serovar Hardjo&#46; La identificaci&#243;n a nivel de serovar se realiz&#243; por microaglutinaci&#243;n con un panel de anticuerpos monoclonales&#44; seg&#250;n Terpstra et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0130"><span class="elsevierStyleSup">12</span></a>&#46;</p><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Esta tipificaci&#243;n se complement&#243; con PCR para discriminar entre <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; interrogans</span> serovar Hardjoprajitno y <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; borgpetersenii</span> serovar Hardjo Bovis&#44; dado que no pueden ser diferenciadas serol&#243;gicamente&#46; El resultado confirm&#243; que los aislamientos remitidos pertenecen a <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; borgpetersenii</span> serovar Hardjo Bovis&#46;</p><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En este trabajo se describe por primera vez la caracterizaci&#243;n molecular de cepas aisladas de un caso cl&#237;nico bovino como <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; borgpetersenii</span> serovar Hardjo Bovis en el pa&#237;s&#44; confirmando su implicancia como agente causal de abortos en bovinos&#46;</p><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La presentaci&#243;n cl&#237;nica difiere bastante respecto de los casos en los que est&#225; involucrado el serovar Pomona&#44; considerando que en esas ocasiones los abortos suelen presentarse en forma de tormenta&#44; en el &#250;ltimo tercio de la gestaci&#243;n y en porcentajes muy elevados&#44; que pueden alcanzar hasta el 50&#37;&#46; Los abortos&#44; en el caso descripto en este trabajo&#44; se produjeron en el tercio medio de la gestaci&#243;n y en un porcentaje de animales mucho m&#225;s bajo &#40;3&#44;5&#37; sobre un rodeo de 1&#46;700 animales&#41;&#44; en un per&#237;odo de aproximadamente 2 meses&#46;</p><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Estos &#250;ltimos 2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>factores dificultan la visualizaci&#243;n del problema por parte del personal responsable de la hacienda&#58; un porcentaje relativamente bajo de p&#233;rdidas y con abortos m&#225;s tempranos y&#44; por ende&#44; de menor tama&#241;o&#44; que no se encuentran en el campo y no disparan una alerta para consultar al veterinario&#46; El resultado final suele ser un porcentaje de vacas sin ternero al pie al final de la parici&#243;n&#44; cuando la confirmaci&#243;n del diagn&#243;stico resulta muy dificultosa&#44; si no imposible&#46;</p><p id="par0125" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La identificaci&#243;n precoz de este rodeo en el momento en que se estaban produciendo los abortos&#44; la toma de muestras&#44; la siembra inmediata de la orina &#40;en el campo&#41; y la selecci&#243;n de los medios de cultivo resultaron claves para poder aislar este microorganismo en 7 de 20 animales muestreados&#46;</p><p id="par0130" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Desde hace muchos a&#241;os existe evidencia serol&#243;gica que indica la presencia del serovar Hardjo en nuestro pa&#237;s&#44; sumado a escasos aislamientos a partir de material obtenido en frigor&#237;ficos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0115"><span class="elsevierStyleSup">9</span></a>&#46;</p><p id="par0135" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Este primer aislamiento de un caso cl&#237;nico constituye solamente un primer paso&#44; considerando que se deben seguir obteniendo aislamientos y efectuar estudios que permitan caracterizar la enfermedad en nuestro entorno&#46;</p><p id="par0140" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se debe desarrollar conocimiento a fin de entender la epidemiolog&#237;a y la patogenia a nivel local y regional&#44; as&#237; como reproducir experimentalmente la enfermedad en animales j&#243;venes&#44; en hembras que van a recibir servicio y en hembras pre&#241;adas&#46; Asimismo&#44; es importante investigar su presencia en el aparato genital&#44; donde tambi&#233;n est&#225; descripta su localizaci&#243;n&#46;</p><p id="par0145" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Es necesario estudiar el papel de este serovar en explotaciones lecheras&#44; donde en teor&#237;a deber&#237;a estar mucho m&#225;s difundido dado el estrecho contacto entre animales&#46;</p><p id="par0150" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El papel potencial de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; borgpetersenii</span> serovar Hardjo Bovis como agente zoon&#243;tico no ha sido a&#250;n suficientemente investigado&#44; dado que los casos reportados de leptospirosis rural en humanos son escasos&#44; y cuando se han efectuado aislamientos o serolog&#237;a de los pacientes&#44; el serovar involucrado fue Pomona<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0100"><span class="elsevierStyleSup">6&#44;11</span></a>&#46;</p><p id="par0155" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La metodolog&#237;a utilizada para la toma de muestras con aplicaci&#243;n de diur&#233;tico&#44; siembra inmediata en el campo&#44; medio de cultivo y diluciones permiti&#243; aislar <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; borgpetersenii</span> serovar Hardjo Bovis en 7 de 20 animales muestreados &#40;35&#37;&#41;&#44; un porcentaje de recuperaci&#243;n elevado considerando la dificultad intr&#237;nseca de aislar leptospiras y&#44; m&#225;s a&#250;n&#44; trat&#225;ndose particularmente de este serovar&#46;</p><p id="par0160" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La tipificaci&#243;n realizada en Argentina por microaglutinaci&#243;n hasta nivel de serogrupo&#44; PCR y MLVA fue confirmada por los resultados efectuados en un centro de referencia mundial como el KIT&#46; De este modo&#44; se demostr&#243; la participaci&#243;n de este serovar como agente causal de abortos bovinos en Argentina&#46;</p><span id="sec0005" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0025">Financiaci&#243;n</span><p id="par0165" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Laboratorio Biog&#233;nesis Bag&#243;&#46;</p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0030">Conflicto de intereses</span><p id="par0170" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran no tener ning&#250;n conflicto de intereses&#46;</p></span></span>"
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Información del artículo
ISSN: 03257541
Idioma original: Español
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2021 Abril 104 17 121
2021 Marzo 70 8 78
2021 Febrero 47 14 61
2021 Enero 51 9 60
2020 Diciembre 51 13 64
2020 Noviembre 51 16 67
2020 Octubre 33 19 52
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2020 Julio 39 12 51
2020 Junio 24 14 38
2020 Mayo 32 14 46
2020 Abril 29 14 43
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