La deficiencia en el transporte de N-acetilglucosamina en Lysinibacillus sphaericus ASB13052 afecta el proceso de esporulación e incrementa la actividad hemolítica de su S-layer

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A) Tinción con Coomassie blue luego de la separación por electroforesis en gel de poliacrilamida (7,5%). B) Western Blot utilizando anticuerpos policlonales anti-S-layer de la cepa L. sphaericus 2362. Cepas de L. sphaericus empleadas: 2362, C7, ASB13052 Pts+ (cepa salvaje), ASB13052 ptsH (cepa mutada Pts−), Mk: marcador de peso molecular." ] ] ] "textoCompleto" => "IntroducciónLa bacteria Lysinibacillus sphaericus, inicialmente caracterizada como Bacillus sphaericus, fue aislada por primera vez en 1904 por Neide y Meyer en ambientes acuáticos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0195">9</a> y renombrada tiempo después debido al alto contenido de lisina, alanina, ácido aspártico y ácido glutámico en su peptidoglicano<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0155">1</a>. Muchas de las especies del género Lysinibacillus poseen una cobertura externa compuesta por proteínas conocidas como S-layer (capa S). Las S-layer son proteínas o glicoproteínas capaces de autoensamblarse para formar rearreglos cristalinos en la envoltura celular de manera de recubrir toda la superficie celular<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0225">15,25</a>. Estas proteínas, ubicuas en los dominios Bacteria y Arquea, tienen alta tasa de síntesis y, en ocasiones, se las encuentra en el medio extracelular cumpliendo funciones diferentes a las descritas en la fisiología bacteriana. Si bien la funcionalidad de la capa S es variable, se la ha podido relacionar con el mantenimiento de la forma; la estabilización mecánica, osmótica y térmica; el reconocimiento de superficie y la adhesión al sustrato y la patogenicidad<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0170">4,6,14,20,23</a>. En particular, en cepas filogenéticamente emparentadas con la cepa ASB13052 de L. sphaericus, se las asoció con la capacidad de bioadsorber metales y con la actividad entomopatógena<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0165">3,4</a>.Las S-layer mejor caracterizadas, como las de L. sphaericus C3-41 y 2362, tienen un peso molecular de 125kDa<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0170">4,16</a>. La producción de variantes de S-layer podría modificar la funcionalidad de la capa S<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0260">22</a>.L. sphaericus es conocida por su actividad larvicida frente a mosquitos, lo que la vuelve una alternativa ecológica frente a los insecticidas químicos. Durante el proceso de esporulación, esta bacteria sintetiza una toxina dimérica compuesta por las proteínas BinA y BinB, las que conforman inclusiones paraesporales conocidas habitualmente como «cristal»<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0175">5</a>. Estas proteínas se encontraron en todas las cepas de L. sphaericus con alta capacidad entomopatógena<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0280">26</a>. Durante la fase de crecimiento vegetativo, esta especie sintetiza otro set de toxinas insecticidas, menos estables, designadas como Mtx y conformadas por las familias Mtx1 y Mtx2. Las Mtx quedan asociadas a la membrana de la bacteria<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0175">5</a> y son degradadas por las proteasas características del proceso de esporulación bacteriana, por lo que dejan de ejercer su acción en preparaciones de esporas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0270">24</a>. Por último, las proteínas S-layer sintetizadas en las distintas fases de crecimiento, en el caso de las cepas que las portan, contribuyen en la función larvicida confiriendo actividad hemolítica. Las proteínas S-layer, además, permanecen asociadas a las esporas potenciando la actividad de las proteínas del cristal<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0170">4,27</a>.Como característica metabólica relevante, L. sphaericus es incapaz de utilizar hexosas o pentosas como fuentes de carbono, aunque puede utilizar el aminoazúcar N-acetilglucosamina (GlcNAc), monómero de la quitina, entre otros polisacáridos. Para su utilización, posee un transportador PTS activo (sistema de fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160">2</a>. El sistema PTS cuenta con dos enzimas que catalizan el primer paso de la reacción de transferencia y fosforilación: la enzima I (EI) y la proteína termoestable HPr, que se fosforila a expensas de fosfoenolpiruvato. El tercer componente del sistema de transporte son las enzimas II (EII). Las EII son proteínas transportadoras sustrato-específicas que reconocen moléculas orgánicas. 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De este modo, podría funcionar como donor de grupos glicosídicos, sustratos ligados a la glicosilación de proteínas.En vistas de estos antecedentes, en este trabajo se utilizó la cepa L. sphaericus ASB13052 y la mutante isogénica ptsH (gen codificante de HPr)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160">2</a> para evaluar si la falla en el transporte de aminoazúcares (donores de grupos glicosídicos) genera modificaciones en el perfil proteico o postraduccionales que ocasionen cambios funcionales.Materiales y métodosCepas bacterianas y condiciones de crecimientoSe utilizó la bacteria L. sphaericus ASB13052 y su mutante isogénica ptsH (Pts−) con inserción de un casete de resistencia a kanamicina interrumpiendo el gen del transportador de aminoazúcares ptsH<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160">2</a>. Se cultivaron con agitación constante a 30°C en medio Luria Bertani (LB). Cuando fue necesario, se suplementó con N-acetilglucosamina. Los cultivos en medio mínimo se realizaron en CTB (K2HPO4 70mM; KH2PO4 30mM; (NH4)2SO4 25mM; MgSO4 0,5mM; MnSO4 0,01mM; citrato de amonio férrico 22mg/l; tiamina 0,02%; biotina 0,02μg/ml), utilizando como fuente de carbono N-acetilglucosamina o glutamato, ambas en una concentración final del 1%. La cepa mutante se cultivó en presencia de 15μg/ml de kanamicina (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.).Purificación de proteínas S-layer desde cultivos líquidosLa extracción se basó en un método de sustitución catiónica por el agregado de LiCl, tal como fue reportado<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170">4</a>. Las cepas de L. sphaericus se cultivaron en 50ml de LB el tiempo correspondiente (4, 8, 16 o 96h). Las células se cosecharon y se lavaron una vez con PBS. Se extrajeron las proteínas S-layer de las células resuspendiendo en 4ml de LiCl 6M, realizando 3min de agitación vigorosa seguido de una incubación con agitación suave a temperatura ambiente por 1h. Las muestras se centrifugaron a 14000 × g por 15min; el sobrenadante se dializó en dos pasos contra CaCl2 10mM a 4°C. Luego de una centrifugación a 10000 × g durante 20min, las proteínas se resuspendieron en agua desionizada y se almacenaron a −20°C. Las proteínas se cuantificaron mediante el método de Bradford utilizando el kit Quick Start™ Bradford Protein Assay (BioRad, Hercules, California, EE.UU.), según indicaciones del fabricante.Electroforesis de proteínas y células enteras y tinción con Coomassie blueLas células enteras crecidas en LB, con o sin suplementar con GlcNAc, fueron hervidas 5min a 100°C en loading buffer (10% glicerol, 4% SDS, 4M urea, 2% beta-mercaptoetanol y 0,05% azul de bromofenol) y las muestras obtenidas se sometieron a una SDS-PAGE con un porcentaje de gel de 7,5%. Los geles se tiñieron con Coomassie brilliant blue. Se sembró el mismo material en cada pocillo (107 UFC de células o esporas y 0,5mg de proteína S-layer).Western BlotPara el análisis por Western Blot, los geles se electrotransfirieron con un equipo Semi-dry Blotter (Amersham Biosciences, Chicago, EE. UU.) a membranas de PVDF previamente activadas con metanol (Macherey-Nagel, Düren, Alemania). Se reveló con anticuerpo policlonal anti-S-layer preparado en conejo (diluido 1:2000). El revelado se realizó mediante un anticuerpo biotinilado anti-conejo, seguido del conjugado estreptavidina-HRP (Pierce, Rockford, IL, EE. UU.). Para la detección quimioluminiscente, se utilizó como sustrato luminol ECL (Amersham, GE Healthcare, Chicago, EE. UU.) y las imágenes se obtuvieron con un digitalizador Fuji LAS1000 (Fuji Film, Tokyo, Japón).Tinción de glicoproteínasSe utilizó el kit PRO-Q EmeraldTM (Invitrogen, Paisley, UK) para detectar bajas concentraciones de glicoproteínas. Se utilizó luego de realizar un SDS-PAGE siguiendo las instrucciones del fabricante para la tinción. La detección es posible luego de una excitación a 280-300nm en un transiluminador Benchtop 3UV™ (UVP, Inc., Upland, CA, EE.UU.). Como control positivo se utilizó el Candy Cane markerTM.Preparación de esporasSe cultivaron ambas cepas de L. sphaericus durante 96h con agitación constante en medio líquido a 30°C con o sin suplemento de GlcNAc. Se recolectó la masa bacteriana por centrifugación y se lavó con una solución de NaCl 1M. Las muestras se centrifugaron durante 10min a 14000 × g y se realizaron tres lavados con H2O milliQ. Finalmente, el cultivo bacteriano enriquecido en esporas fue resuspendido en acetato de sodio 10mM pH 4,5, para prevenir la germinación, y almacenado a −20°C.Observación microscópica de esporasSe utilizó un microscopio óptico Axio Scope A1 modelo Microphot microscope (Axiostar Plus; Carl Zeiss, Jena, Alemania), con un aumento ×1.000, para observar y fotografiar las preparaciones de esporas en LB. Se cuantificaron los distintos fenotipos observados (n=100) y se evaluó la presencia de diferencias significativas entre cepas (p<0,005).Análisis de termorresistencia de esporasLas esporas se calentaron a 70°C durante distintos intervalos de tiempo (5, 10, 15 y 20min) y posteriormente se realizó un recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) en placas con LB incubando durante 24h a 30°C. Para cada cepa se realizaron tres experimentos independientes.Ensayo de hemólisisSe realizó según Allievi et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170">4</a>, en un volumen final de 1ml. Se colocaron 500μl de glóbulos rojos de carnero estabilizados al 0,05% y se llevó a 1ml agregando la cantidad necesaria de proteínas y PBS. Luego se incubó por 30min a 37°C y se midió la absorbancia del sobrenadante a 405nm, longitud de onda que corresponde al pico máximo de absorbancia de los grupos hemo procedentes de los glóbulos rojos lisados. La hemólisis total de los glóbulos rojos corresponde a la incubación de los glóbulos rojos con agua destilada mientras que el 0% de hemólisis se corresponde con la incubación con buffer fosfato (PBS). Se analizó la capacidad hemolítica de preparaciones de S-layer obtenidas de células en fase vegetativa crecidas en medio líquido, extraídas según lo descripto. Las concentraciones de proteína utilizadas en este ensayo fueron 0,5, 2, 10, 20, 50 y 100μg/ml. Como control negativo, se utilizó la misma concentración de seroalbúmina bovina. Para analizar la hemólisis de los cultivos esporulados, se realizó el mismo procedimiento agregando cantidades conocidas de esporas.Análisis estadísticoSe analizó la significación de los resultados de hemólisis mediante la prueba U de Mann-Whitney para datos no paramétricos. Un valor de p<0,05 se consideró estadísticamente significativo. El análisis de los supuestos y de la varianza se efectuó con el programa InfoStat (Grupo InfoStat, Córdoba, Argentina).ResultadosEn este trabajo se propuso estudiar la influencia de la inactivación del gen ptsH en el perfil proteico y funcional de L. sphaericus ASB13052, en particular, el efecto sobre la esporogénesis y la actividad larvicida. En primer lugar, se corroboró la inserción del casete de resistencia a kanamicina en el gen ptsH (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0085">fig. S1A, fig. S1B</a>) en la mutante ptsH (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0085">fig. S1C</a>), conforme con reportes anteriores<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160">2</a>.Luego, se analizó la presencia de proteína S-layer en células enteras de cultivos líquidos en fase exponencial mediante Western Blot, utilizando anticuerpos policlonales anti-S-layer<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165">3</a>. En este análisis, se incluyeron dos cepas adicionales: la cepa de referencia L. sphaericus 2362 y la cepa L. sphaericus C7, cuya S-layer tiene actividad larvicida contra Aedes aegypti<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170">4</a>. Los resultados indican que los perfiles proteicos de la cepa salvaje y de su mutante ptsH no presentan diferencias entre sí ni con las cepas de referencia. Se destaca la presencia de una banda proteica mayoritaria, de aproximadamente 130kDa (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig. 1</a>A), reconocida por los anticuerpos específicos anti-S-layer (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig. 1</a>B).<elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia>Debido a que la mutación en el gen ptsH afecta el transporte de aminoazúcares, por ejemplo, el de N-acetilglucosamina (GlcNAc), se analizó su posible rol en las modificaciones postraduccionales de la proteína S-layer. Para ello, se realizaron cultivos en LB suplementados o no con N-acetilglucosamina (donor de grupos glucanos) y se analizaron las fracciones proteicas de ambas cepas en la fase exponencial del crecimiento (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig. 2</a>A). No se encontraron patrones de peso molecular de S-layer alterados. Por otro lado, para evaluar el efecto del sustrato, se utilizó un medio con una única fuente de carbono: medio mínimo suplementado con GlcNAc o con glutamato (control) (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig. 2</a>B). La cepa mutante ptsH no logró crecer con GlcNAc como única fuente de carbono, tal como se esperaba. La cepa salvaje no mostró diferencias en sus S-layer cuando fue crecida con o sin el aminoazúcar GlcNAc.<elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia>A su vez, se realizó una purificación de la proteína S-layer de los cultivos en fase exponencial (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3</a>). Se comprobó la presencia de la misma banda de peso molecular de 130kDa correspondiente a la S-layer hallada en los extractos proteicos de las bacterias enteras. Además, en la mutante ptsH, se detectó una banda de mayor peso molecular (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3</a>A). Se analizó la identidad de dicha banda por Western Blot utilizando anticuerpos específicos anti-S-layer y se comprobó que también esa banda correspondía a una isoforma de S-layer (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3</a>B). Para determinar si la mutación del gen ptsH afecta la incorporación de grupos glicosídicos y, por lo tanto, incide en las modificaciones postraduccionales de estas proteínas, específicamente en la glicosilación, se evaluó la N-glicosilación de la proteína S-layer de la cepa salvaje y la mutante ptsH utilizando el kit PRO-Q EmeraldTM (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3</a>C). Las proteínas S-layer obtenidas de fase exponencial de ambas cepas se tiñeron en esta reacción, por lo que se concluye que la proteína S-layer de la cepa salvaje y ambas isoformas de la cepa ptsH se encuentran glicosiladas.<elsevierMultimedia ident="fig0015"></elsevierMultimedia>Las esporas de L. sphaericus suelen retener sus proteínas S-layer, que luego cumplen funciones específicas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165">3</a>. Por ello, se estudió el patrón de proteínas S-layer provenientes de cultivos enriquecidos en esporas (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig. 4</a>A). En este análisis se observó la presencia de bandas correspondientes a la proteína S-layer con la cepa salvaje y la mutante. Al igual que lo reportado en la cepa 2362<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165">3</a>, el peso molecular de las proteínas en estos cultivos fue menor que los observados en los cultivos líquidos en fase exponencial de crecimiento. Asimismo, la cepa ptsH presentó dos isoformas de S-layer, frente a las tres isoformas detectadas en la cepa salvaje. Por otra parte, algunas cepas de esta especie se caracterizan por su actividad larvicida, mayormente asociada a proteínas de fase exponencial (Mtx y S-layer) y proteínas Bin de las esporas. Debido a que las proteínas S-layer remanentes en las esporas presentaron diferencias entre cepas (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig. 4</a>A), se evaluó mediante un ensayo de termosensibilidad la calidad del proceso de esporulación para ambas cepas (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig. 4</a>B). La cepa ptsH, deficiente en el transporte de aminoazúcares, mostró una sensibilidad térmica mucho mayor, ya detectable después de 5min de exposición a 70°C. Estos hallazgos indican que el comportamiento fisiológico de esporulación se encuentra alterado en la cepa mutante.<elsevierMultimedia ident="fig0020"></elsevierMultimedia>Para continuar con el estudio del proceso de esporulación, a las 96h se caracterizaron fenotípicamente los cultivos mediante observación y recuento al microscopio. En las <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">figuras 5A y 5B</a> se muestran las microscopías ópticas de la cepa salvaje y la mutante, respectivamente, utilizadas en el ensayo de termorresistencia. En concordancia con los hallazgos del ensayo de resistencia térmica, se puede observar que la cepa mutante fue incapaz de concluir la esporulación, dando lugar a cultivos con un alto porcentaje de bacilos con endosporas (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">fig. 5</a>C). Estos resultados indican que la interrupción del gen ptsH provoca una disrupción en el proceso de esporulación en medios ricos.<elsevierMultimedia ident="fig0025"></elsevierMultimedia>En trabajos anteriores se identificó a la S-layer como un factor de virulencia y se estableció una relación directa entre la capacidad hemolítica de la S-layer de una cepa y su actividad como patógeno de mosquitos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170">4</a>. Teniendo en cuenta estos antecedentes, se analizó la capacidad hemolítica de extracciones de S-layer obtenidas de ambas cepas en la fase exponencial de crecimiento (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">fig. 5</a>D). Las S-layer provenientes de ambas cepas presentaron actividad hemolítica (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">fig. 5</a>D). Sin embargo, la S-layer de la mutante ptsH se asoció con mayores niveles de hemólisis que la S-layer de la cepa salvaje a iguales concentraciones (por debajo del máximo ensayado), en coincidencia con el hallazgo de una mayor proporción de la isoforma de S-layer de alto peso molecular.Discusión y conclusionesEn este trabajo confirmamos la presencia de proteínas S-layer en L. sphaericus ASB13052, las que fueron reconocidas por anticuerpos anti-S-layer generados contra la cepa de referencia 2362. Esto demuestra la similitud antigénica.Uno de los objetivos principales de esta investigación fue determinar si la presencia de una mutación en el gen ptsH, involucrado en el transporte de N-acetilglucosamina al interior celular, podría afectar a los componentes de envoltura, más específicamente, a la S-layer. Se sabe que la N-acetilglucosamina funciona como donor de grupos glicosídicos y que, a su vez, regula procesos de represión catabólica<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160">2</a>. Si la síntesis y actividad de la S-layer fuesen afectadas por el fenómeno de represión catabólica o la glicosilación, una mutación en un gen clave en estos procesos, como el gen ptsH, podría ocasionar la aparición de patrones proteicos diferentes en la cepa que porta la mutación.En este estudio no se observaron cambios en los patrones proteicos de la cepa mutada comparada con la salvaje al hacerlas crecer por hasta 8h en medios ricos, suplementados o no con N-acetilglucosamina. Cuando se emplean medios ricos no definidos, cabe esperar que no existan diferencias debido a que moléculas de diversa índole podrían cumplir el papel de intermediarios de reacción en el interior celular. Sin embargo, en esta investigación, tampoco se alteraron los patrones proteicos en bacterias provenientes de medios mínimos. Estos resultados indicarían que la síntesis de la proteína S-layer, al menos la de la asociada a la banda de 130kDa, ocurre con independencia de la fuente de carbono o del medio de cultivo utilizado.Se sabe que hay organismos donde la fase de crecimiento altera la composición de la envoltura. En Bacillus anthracis, por ejemplo, la entrada en la fase estacionaria provoca el recambio de una proteína de superficie por otra<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0255">21</a>. En la cepa secuenciada L. sphaericus C3-41, se encontraron 22 marcos de lectura que podían codificar la S-layer<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0230">16</a>.En otros microorganismos de la misma especie, como la cepa de referencia 2362 (Accession Number CP015224.1), se han identificado al menos 13 genes codificantes de S-layer de distinto peso molecular, y en la cepa JG-B53, 8 genes de expresión alternativa<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0245">19</a>. Recientemente, se demostró en la bacteria emparentada Bacillus cereus que una modificación de la dinámica de expresión de SL2 y EA1, las dos proteínas S-layer que produce, modifica su abundancia relativa. Esto determina cambios en sus propiedades superficiales, lo cual contribuye a la supervivencia de B. cereus en condiciones de inanición<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0185">7</a>. En resumen, en muchas cepas de L. sphaericus, no hay una única proteína S-layer y estas pueden sufrir algún tipo de modificación.En esta investigación, al cultivar durante un período más largo, de 16h, se observó en la cepa mutante ptsH la aparición de una banda de mayor peso molecular que la correspondiente a la S-layer característica, de 130kDa. Asimismo, a medida que avanzó el proceso de esporulación, se pudieron distinguir tres bandas de menos de 130kDa en la cepa salvaje y solo dos bandas de menos de 130kDa en la mutante. Así, nuestros resultados muestran que el patrón proteico de S-layer se modifica conforme cambia el estadio de crecimiento de la bacteria. Futuros ensayos ayudarán a dilucidar si estas bandas representan el producto de síntesis de un nuevo tipo de S-layer o son la consecuencia de un clivaje proteico, resultado de la acción de las proteasas secretadas en el proceso de esporulación. También será preciso analizar si las distintas bandas observadas corresponden a asociaciones entre la S-layer y las proteínas del cristal (BinA y BinB), tal cual fue demostrado previamente en el laboratorio<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170">4</a>.Las glicosilaciones en las proteínas S-layer son las modificaciones postraduccionales más frecuentes en bacterias. Se han encontrado en cepas cercanas a L. sphaericus, como Paenibacillus alvei o Lentilactobacilluskefiri, y en Geobacillusstearothermophylus<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0190">8,24</a>. Hasta la fecha, no se han informado glicosilaciones sobre la S-layer de Lysinibacillussphaericus. En este trabajo hemos analizado cualitativamente este punto y verificamos la presencia de grupos glicanos en las S-layer en este microorganismo, con un patrón de glicosilación coincidente en ambas cepas. Por consiguiente, todas las variaciones que se detectaron en el patrón de peso molecular de la S-layer se podrían atribuir a modificaciones que sufre la proteína debido a la transición por distintas fases de crecimiento o a la expresión de otros genes codificantes de proteínas de capa S. Estas hipótesis se basan en hallazgos reportados no solo en el dominio Bacteria, sino también en el dominio Arquea. En este último dominio, se han documentado modificaciones postraduccionales de proteínas S-layer, incluido el clivaje proteolítico por proteasas de membrana o la formación de multímeros<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0240">18</a>. En el dominio Bacteria, se ha documentado el recambio de isoformas de S-layer en B. anthracis, mientras que en L. sphaericus JG-B53 se observó que genes alternativos de S-layer se expresaron parcialmente frente a distintas condiciones, lo que permitiría rápidas adaptaciones en entornos cambiantes<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0245">19,21</a>.Los experimentos de resistencia térmica revelaron que la mutación en el gen ptsH produce efectos no solo sobre la S-layer, sino también sobre la esporulación, dando lugar a esporulaciones incompletas que afectan la calidad de la forma de resistencia de la cepa. Incluso en cultivos de más de 96h, la cepa mutante no mostró la completa liberación de esporas y un gran porcentaje de células se presentaban con endosporas. Todo esto indica que la interrupción del gen ptsH provoca una disrupción en el proceso de esporulación en medios ricos. Es sabido que el sistema PTS participa en la regulación de muchas funciones celulares importantes para controlar procesos relacionados con la colonización de ambientes, aunque las funciones exactas no han sido dilucidadas. En B. cereus, el gen ptsH juega un papel importante en la resistencia al estrés oxidativo, la absorción de glucosa (azúcar PTS), la formación de biofilms y el movimiento de swarming, eventos característicos de la colonización bacteriana en la rizosfera<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0215">13</a>.El sistema de transporte de aminoazúcares PTS está directamente relacionado con la represión catabólica por carbono, lo que les permite a las bacterias utilizar más eficientemente las fuentes de carbono y mejorar, así, la tasa de crecimiento y su sobrevida en ambientes naturales y en entornos cambiantes<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210">12</a>. En este caso, pudimos comprobar que la disrupción de la función del gen ptsH perjudica el proceso de esporulación, estrategia adaptativa de las bacterias para sobrevivir en condiciones desfavorables. Sin embargo, como este proceso involucra la síntesis y función de múltiples proteasas, una esporulación defectuosa permitiría conservar la actividad de proteínas que hubieran sido degradadas en una cepa salvaje.Es sabido que la proteína S-layer está directamente relacionada con la virulencia del organismo en bacterias como Tannerella forsythia, B. cereus y B. anthracis<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0200">10,11,28</a>. En L. sphaericus, hemos demostrado que la toxicidad de su S-layer está directamente relacionada con la capacidad hemolítica y que su presencia es sinérgica con su actividad mosquitocida<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170">4</a>. Los resultados obtenidos en este trabajo indican un mayor potencial hemolítico en la cepa mutante, coincidente con la aparición de una isoforma de la proteína S-layer de mayor peso molecular. La diferencia entre estas isoformas podría deberse a la ausencia de clivaje (por menor actividad de proteasas en la mutante) del péptido líder de características hidrofóbicas hacia el extremo amino terminal, de aproximadamente 7,2kDa, en L. sphaericus 2362. Una versión de la S-layer portadora de una región altamente hidrofóbica podría interactuar más fácilmente con la membrana de los glóbulos rojos y perturbarlos en mayor medida. Otra posibilidad que justificaría el mayor grado de hemólisis es que la proteína Mtx (cuyo peso molecular es similar al de la S-layer) permanezca asociada a la S-layer en la mutante, mientras que, en condiciones normales, en la cepa salvaje dicha proteína es fácilmente degradada hacia el final de la fase exponencial de crecimiento<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0300">30</a>. Una tercera posibilidad es que, al ser incapaz de esporular eficientemente con la correspondiente batería de proteasas preponderantes, las células de la cepa mutante retuvieran las toxinas Mtx. La sinergia entre las toxinas Bin (o Cry de Bacillusthuringiensis) y las toxinas Mtx ya ha sido documentada, también se ha determinado que la combinación de toxinas Cry y Mtx es capaz de anular la resistencia a las preparaciones esporales por parte de los mosquitos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0295">29</a>. Sería interesante realizar experimentos con preparaciones mixtas (toxinas Cry, Mtx y S-layer) con el fin de evaluar el efecto conjunto en cepas defectuosas en esporulación, como la empleada en este trabajo.FinanciaciónEl estudio fue financiado con fondos provenientes de subsidios UBACyT (20020220400185BA) y ANPCyT (PICT 2020 N.° 1445).Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses." 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L. sphaericus se caracteriza por depender de moléculas peptídicas como la N-acetilglucosamina para obtener fuentes de carbono y posee un sistema de transferencia de moléculas orgánicas, conocido como phosphotransferase system (PTS) para incorporarlas. Algunas cepas tienen proteínas S-layer, cuya participación en la retención de metales y en la actividad larvicida contra mosquitos portadores de enfermedades ya hemos demostrado. Dado que las alteraciones en el sistema de incorporación de aminoazúcares podrían afectar el perfil de proteínas y su funcionalidad, se estudió comparativamente la cepa ASB13052 y una mutante isogénica en el gen ptsH, preponderante en la vía de señalización del PTS. Por primera vez, se confirmó la presencia de proteínas S-layer N-glicosiladas en ambas cepas, con una variación en el patrón de su peso molecular según la fase de crecimiento. En fase exponencial, se encontró una proteína S-layer mayor de 130kDa en la mutante ptsH, ausente en la cepa salvaje. La mutante presentó un proceso de esporulación alterado, incompleto y de calidad deficiente. El análisis de hemólisis, asociado a la actividad larvicida, mostró que la mutante posee mayor eficiencia de lisis, rasgo correlacionado con la proteína de alto peso molecular. Los resultados permiten proponer cuáles serían los efectos generados por la ausencia del transporte de N-acetilglucosamina sobre la actividad hemolítica, las isoformas de S-layer y la actividad larvicida de L. sphaericus." ] "en" => array:2 [ "titulo" => "Abstract" "resumen" => "Lysinibacillus sphaericus is a bacterium that, along with Bacillus thuringiensis var. israelensis, is considered the best biological insecticide for controlling mosquito larvae and an eco-friendly alternative to chemical insecticides. It depends on peptidic molecules such as N-acetylglucosamine to obtain carbon sources and possesses a phosphotransferase system (PTS) for their incorporation. Some strains carry S-layer proteins, whose involvement in metal retention and larvicidal activity against disease-carrying mosquitoes has been demonstrated. Alterations in the amino sugar incorporation system could affect the protein profile and functionality. Strain ASB13052 and the isogenic mutant in the ptsH gene, which is predominant in the PTS signaling pathway, were used in this study. For the first time, the presence of N-glycosylated S-layer proteins was confirmed in both strains, with a variation in their molecular weight pattern depending on the growth phase. In the exponential phase, an S-layer protein greater than 130 kDa was found in the ptsH mutant, which was absent in the wild-type strain. The mutant strain exhibited altered and incomplete low quality sporulation processes. Hemolysis analysis, associated with larvicidal activity, showed that the ptsH mutant has higher lytic efficiency, correlating with the high molecular weight protein. 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Original

Deficiency in N-acetylglucosamine transport affects the sporulation process and increases the hemolytic activity of the S-layer protein in Lysinibacillus sphaericus ASB13052

Julián Tarsitanoa,◊, Sabrina Sol Bockorb,◊, María Mercedes Palominob, Joaquina Fina Martinb, Sandra Mónica Ruzalb, Mariana Claudia Allievib,

Autor para correspondencia

mallievi@qb.fcen.uba.ar
marianaallievi@gmail.com

Autor para correspondencia.

a Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires, Ciudad Universitaria, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina

b Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Buenos Aires - Instituto de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (IQUIBICEN) - CONICET, Ciudad Universitaria, Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina

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Las S-layer son prote&#237;nas o glicoprote&#237;nas capaces de autoensamblarse para formar rearreglos cristalinos en la envoltura celular de manera de recubrir toda la superficie celular<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0225"><span class="elsevierStyleSup">15&#44;25</span></a>&#46; Estas prote&#237;nas&#44; ubicuas en los dominios Bacteria y Arquea&#44; tienen alta tasa de s&#237;ntesis y&#44; en ocasiones&#44; se las encuentra en el medio extracelular cumpliendo funciones diferentes a las descritas en la fisiolog&#237;a bacteriana&#46; Si bien la funcionalidad de la capa S es variable&#44; se la ha podido relacionar con el mantenimiento de la forma&#59; la estabilizaci&#243;n mec&#225;nica&#44; osm&#243;tica y t&#233;rmica&#59; el reconocimiento de superficie y la adhesi&#243;n al sustrato y la patogenicidad<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">4&#44;6&#44;14&#44;20&#44;23</span></a>&#46; En particular&#44; en cepas filogen&#233;ticamente emparentadas con la cepa ASB13052 de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span>&#44; se las asoci&#243; con la capacidad de bioadsorber metales y con la actividad entomopat&#243;gena<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0165"><span class="elsevierStyleSup">3&#44;4</span></a>&#46;</p><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las S-layer mejor caracterizadas&#44; como las de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span> C3-41 y 2362&#44; tienen un peso molecular de 125<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">4&#44;16</span></a>&#46; La producci&#243;n de variantes de S-layer podr&#237;a modificar la funcionalidad de la capa S<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0260"><span class="elsevierStyleSup">22</span></a>&#46;</p><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span> es conocida por su actividad larvicida frente a mosquitos&#44; lo que la vuelve una alternativa ecol&#243;gica frente a los insecticidas qu&#237;micos&#46; Durante el proceso de esporulaci&#243;n&#44; esta bacteria sintetiza una toxina dim&#233;rica compuesta por las prote&#237;nas BinA y BinB&#44; las que conforman inclusiones paraesporales conocidas habitualmente como &#171;cristal&#187;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0175"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a>&#46; Estas prote&#237;nas se encontraron en todas las cepas de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span> con alta capacidad entomopat&#243;gena<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0280"><span class="elsevierStyleSup">26</span></a>&#46; Durante la fase de crecimiento vegetativo&#44; esta especie sintetiza otro set de toxinas insecticidas&#44; menos estables&#44; designadas como Mtx y conformadas por las familias Mtx1 y Mtx2&#46; Las Mtx quedan asociadas a la membrana de la bacteria<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0175"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a> y son degradadas por las proteasas caracter&#237;sticas del proceso de esporulaci&#243;n bacteriana&#44; por lo que dejan de ejercer su acci&#243;n en preparaciones de esporas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0270"><span class="elsevierStyleSup">24</span></a>&#46; Por &#250;ltimo&#44; las prote&#237;nas S-layer sintetizadas en las distintas fases de crecimiento&#44; en el caso de las cepas que las portan&#44; contribuyen en la funci&#243;n larvicida confiriendo actividad hemol&#237;tica&#46; Las prote&#237;nas S-layer&#44; adem&#225;s&#44; permanecen asociadas a las esporas potenciando la actividad de las prote&#237;nas del cristal<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">4&#44;27</span></a>&#46;</p><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Como caracter&#237;stica metab&#243;lica relevante&#44; <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span> es incapaz de utilizar hexosas o pentosas como fuentes de carbono&#44; aunque puede utilizar el aminoaz&#250;car N-acetilglucosamina &#40;GlcNAc&#41;&#44; mon&#243;mero de la quitina&#44; entre otros polisac&#225;ridos&#46; Para su utilizaci&#243;n&#44; posee un transportador PTS activo &#40;sistema de fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>&#46; El sistema PTS cuenta con dos enzimas que catalizan el primer paso de la reacci&#243;n de transferencia y fosforilaci&#243;n&#58; la enzima I &#40;EI&#41; y la prote&#237;na termoestable HPr&#44; que se fosforila a expensas de fosfoenolpiruvato&#46; El tercer componente del sistema de transporte son las enzimas II &#40;EII&#41;&#46; Las EII son prote&#237;nas transportadoras sustrato-espec&#237;ficas que reconocen mol&#233;culas org&#225;nicas&#46; Suelen estar compuestas por 3 o 4 subunidades fusionadas que forman parte de un complejo&#44; conformando una cascada de fosforilaciones<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0235"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a>&#46; La N-acetilglucosamina&#44; entonces&#44; es transportada por una enzima II&#46; De este modo&#44; podr&#237;a funcionar como donor de grupos glicos&#237;dicos&#44; sustratos ligados a la glicosilaci&#243;n de prote&#237;nas&#46;</p><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En vistas de estos antecedentes&#44; en este trabajo se utiliz&#243; la cepa <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span> ASB13052 y la mutante isog&#233;nica <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> &#40;gen codificante de HPr&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a> para evaluar si la falla en el transporte de aminoaz&#250;cares &#40;donores de grupos glicos&#237;dicos&#41; genera modificaciones en el perfil proteico o postraduccionales que ocasionen cambios funcionales&#46;</p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0035">Materiales y m&#233;todos</span><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0040">Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento</span><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se utiliz&#243; la bacteria <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span> ASB13052 y su mutante isog&#233;nica <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> &#40;Pts&#8722;&#41; con inserci&#243;n de un casete de resistencia a kanamicina interrumpiendo el gen del transportador de aminoaz&#250;cares <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a><span class="elsevierStyleItalic">&#46;</span> Se cultivaron con agitaci&#243;n constante a 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C en medio Luria Bertani &#40;LB&#41;&#46; Cuando fue necesario&#44; se suplement&#243; con N-acetilglucosamina&#46; Los cultivos en medio m&#237;nimo se realizaron en CTB &#40;K<span class="elsevierStyleInf">2</span>HPO<span class="elsevierStyleInf">4</span> 70<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM&#59; KH<span class="elsevierStyleInf">2</span>PO<span class="elsevierStyleInf">4</span> 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM&#59; &#40;NH<span class="elsevierStyleInf">4</span>&#41;<span class="elsevierStyleInf">2</span>SO<span class="elsevierStyleInf">4</span> 25<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM&#59; MgSO<span class="elsevierStyleInf">4</span> 0&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM&#59; MnSO<span class="elsevierStyleInf">4</span> 0&#44;01<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM&#59; citrato de amonio f&#233;rrico 22<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg&#47;l&#59; tiamina 0&#44;02&#37;&#59; biotina 0&#44;02<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;g&#47;ml&#41;&#44; utilizando como fuente de carbono N-acetilglucosamina o glutamato&#44; ambas en una concentraci&#243;n final del 1&#37;&#46; La cepa mutante se cultiv&#243; en presencia de 15<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;g&#47;ml de kanamicina &#40;Sigma&#44; St&#46; Louis&#44; MO&#44; EE&#46; UU&#46;&#41;&#46;</p></span><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0045">Purificaci&#243;n de prote&#237;nas S-layer desde cultivos l&#237;quidos</span><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La extracci&#243;n se bas&#243; en un m&#233;todo de sustituci&#243;n cati&#243;nica por el agregado de LiCl&#44; tal como fue reportado<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">4</span></a>&#46; Las cepas de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span> se cultivaron en 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de LB el tiempo correspondiente &#40;4&#44; 8&#44; 16 o 96<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h&#41;&#46; Las c&#233;lulas se cosecharon y se lavaron una vez con PBS&#46; Se extrajeron las prote&#237;nas S-layer de las c&#233;lulas resuspendiendo en 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de LiCl 6<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M&#44; realizando 3<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min de agitaci&#243;n vigorosa seguido de una incubaci&#243;n con agitaci&#243;n suave a temperatura ambiente por 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h&#46; Las muestras se centrifugaron a 14000 &#215; g por 15<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#59; el sobrenadante se dializ&#243; en dos pasos contra CaCl<span class="elsevierStyleInf">2</span> 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM a 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#46; Luego de una centrifugaci&#243;n a 10000 &#215; g durante 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#44; las prote&#237;nas se resuspendieron en agua desionizada y se almacenaron a &#8722;20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#46; Las prote&#237;nas se cuantificaron mediante el m&#233;todo de Bradford utilizando el kit Quick Start&#8482; Bradford Protein Assay &#40;BioRad&#44; Hercules&#44; California&#44; EE&#46;UU&#46;&#41;&#44; seg&#250;n indicaciones del fabricante&#46;</p></span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0050">Electroforesis de prote&#237;nas y c&#233;lulas enteras y tinci&#243;n con <span class="elsevierStyleItalic">Coomassie</span> blue</span><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las c&#233;lulas enteras crecidas en LB&#44; con o sin suplementar con GlcNAc&#44; fueron hervidas 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C en loading buffer &#40;10&#37; glicerol&#44; 4&#37; SDS&#44; 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M urea&#44; 2&#37; beta-mercaptoetanol y 0&#44;05&#37; azul de bromofenol&#41; y las muestras obtenidas se sometieron a una SDS-PAGE con un porcentaje de gel de 7&#44;5&#37;&#46; Los geles se ti&#241;ieron con <span class="elsevierStyleItalic">Coomassie brilliant blue&#46;</span> Se sembr&#243; el mismo material en cada pocillo &#40;10<span class="elsevierStyleSup">7</span> UFC de c&#233;lulas o esporas y 0&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg de prote&#237;na S-layer&#41;&#46;</p></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0055">Western Blot</span><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para el an&#225;lisis por Western Blot&#44; los geles se electrotransfirieron con un equipo Semi-dry Blotter &#40;Amersham Biosciences&#44; Chicago&#44; EE&#46; UU&#46;&#41; a membranas de PVDF previamente activadas con metanol &#40;Macherey-Nagel&#44; D&#252;ren&#44; Alemania&#41;&#46; Se revel&#243; con anticuerpo policlonal anti-S-layer preparado en conejo &#40;diluido 1&#58;2000&#41;&#46; El revelado se realiz&#243; mediante un anticuerpo biotinilado anti-conejo&#44; seguido del conjugado estreptavidina-HRP &#40;Pierce&#44; Rockford&#44; IL&#44; EE&#46; UU&#46;&#41;&#46; Para la detecci&#243;n quimioluminiscente&#44; se utiliz&#243; como sustrato luminol ECL &#40;Amersham&#44; GE Healthcare&#44; Chicago&#44; EE&#46; UU&#46;&#41; y las im&#225;genes se obtuvieron con un digitalizador Fuji LAS1000 &#40;Fuji Film&#44; Tokyo&#44; Jap&#243;n&#41;&#46;</p></span><span id="sec0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0060">Tinci&#243;n de glicoprote&#237;nas</span><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se utiliz&#243; el kit PRO-Q Emerald<span class="elsevierStyleSup">TM</span> &#40;Invitrogen&#44; Paisley&#44; UK&#41; para detectar bajas concentraciones de glicoprote&#237;nas&#46; Se utiliz&#243; luego de realizar un SDS-PAGE siguiendo las instrucciones del fabricante para la tinci&#243;n&#46; La detecci&#243;n es posible luego de una excitaci&#243;n a 280-300<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm en un transiluminador Benchtop 3UV&#8482; &#40;UVP&#44; Inc&#46;&#44; Upland&#44; CA&#44; EE&#46;UU&#46;&#41;&#46; Como control positivo se utiliz&#243; el Candy Cane marker<span class="elsevierStyleSup">TM</span>&#46;</p></span><span id="sec0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0065">Preparaci&#243;n de esporas</span><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se cultivaron ambas cepas de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span> durante 96<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h con agitaci&#243;n constante en medio l&#237;quido a 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C con o sin suplemento de GlcNAc&#46; Se recolect&#243; la masa bacteriana por centrifugaci&#243;n y se lav&#243; con una soluci&#243;n de NaCl 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M&#46; Las muestras se centrifugaron durante 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a 14000 &#215; g y se realizaron tres lavados con H<span class="elsevierStyleInf">2</span>O milliQ&#46; Finalmente&#44; el cultivo bacteriano enriquecido en esporas fue resuspendido en acetato de sodio 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM pH 4&#44;5&#44; para prevenir la germinaci&#243;n&#44; y almacenado a &#8722;20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#46;</p></span><span id="sec0045" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0070">Observaci&#243;n microsc&#243;pica de esporas</span><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se utiliz&#243; un microscopio &#243;ptico Axio Scope A1 modelo Microphot microscope &#40;Axiostar Plus&#59; Carl Zeiss&#44; Jena&#44; Alemania&#41;&#44; con un aumento &#215;1&#46;000&#44; para observar y fotografiar las preparaciones de esporas en LB&#46; Se cuantificaron los distintos fenotipos observados &#40;n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>100&#41; y se evalu&#243; la presencia de diferencias significativas entre cepas &#40;p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;005&#41;&#46;</p></span><span id="sec0050" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0075">An&#225;lisis de termorresistencia de esporas</span><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las esporas se calentaron a 70<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C durante distintos intervalos de tiempo &#40;5&#44; 10&#44; 15 y 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#41; y posteriormente se realiz&#243; un recuento de unidades formadoras de colonias &#40;UFC&#41; en placas con LB incubando durante 24<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h a 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#46; Para cada cepa se realizaron tres experimentos independientes&#46;</p></span><span id="sec0055" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0080">Ensayo de hem&#243;lisis</span><p id="par0090" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se realiz&#243; seg&#250;n Allievi et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">4</span></a>&#44; en un volumen final de 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml&#46; Se colocaron 500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de gl&#243;bulos rojos de carnero estabilizados al 0&#44;05&#37; y se llev&#243; a 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml agregando la cantidad necesaria de prote&#237;nas y PBS&#46; Luego se incub&#243; por 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C y se midi&#243; la absorbancia del sobrenadante a 405<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm&#44; longitud de onda que corresponde al pico m&#225;ximo de absorbancia de los grupos hemo procedentes de los gl&#243;bulos rojos lisados&#46; La hem&#243;lisis total de los gl&#243;bulos rojos corresponde a la incubaci&#243;n de los gl&#243;bulos rojos con agua destilada mientras que el 0&#37; de hem&#243;lisis se corresponde con la incubaci&#243;n con <span class="elsevierStyleItalic">buffer</span> fosfato &#40;PBS&#41;&#46; Se analiz&#243; la capacidad hemol&#237;tica de preparaciones de S-layer obtenidas de c&#233;lulas en fase vegetativa crecidas en medio l&#237;quido&#44; extra&#237;das seg&#250;n lo descripto&#46; Las concentraciones de prote&#237;na utilizadas en este ensayo fueron 0&#44;5&#44; 2&#44; 10&#44; 20&#44; 50 y 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;g&#47;ml&#46; Como control negativo&#44; se utiliz&#243; la misma concentraci&#243;n de seroalb&#250;mina bovina&#46; Para analizar la hem&#243;lisis de los cultivos esporulados&#44; se realiz&#243; el mismo procedimiento agregando cantidades conocidas de esporas&#46;</p></span><span id="sec0060" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0085">An&#225;lisis estad&#237;stico</span><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se analiz&#243; la significaci&#243;n de los resultados de hem&#243;lisis mediante la prueba U de Mann-Whitney para datos no param&#233;tricos&#46; Un valor de p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;05 se consider&#243; estad&#237;sticamente significativo&#46; El an&#225;lisis de los supuestos y de la varianza se efectu&#243; con el programa InfoStat &#40;Grupo InfoStat&#44; C&#243;rdoba&#44; Argentina&#41;&#46;</p></span></span><span id="sec0065" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0090">Resultados</span><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En este trabajo se propuso estudiar la influencia de la inactivaci&#243;n del gen <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> en el perfil proteico y funcional de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span> ASB13052&#44; en particular&#44; el efecto sobre la esporog&#233;nesis y la actividad larvicida&#46; En primer lugar&#44; se corrobor&#243; la inserci&#243;n del casete de resistencia a kanamicina en el gen <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0085">fig&#46; S1A&#44; fig&#46; S1B</a>&#41; en la mutante <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0085">fig&#46; S1C</a>&#41;&#44; conforme con reportes anteriores<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>&#46;</p><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Luego&#44; se analiz&#243; la presencia de prote&#237;na S-layer en c&#233;lulas enteras de cultivos l&#237;quidos en fase exponencial mediante Western Blot&#44; utilizando anticuerpos policlonales anti-S-layer<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a>&#46; En este an&#225;lisis&#44; se incluyeron dos cepas adicionales&#58; la cepa de referencia <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span> 2362 y la cepa <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span> C7&#44; cuya S-layer tiene actividad larvicida contra <span class="elsevierStyleItalic">Aedes aegypti</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">4</span></a>&#46; Los resultados indican que los perfiles proteicos de la cepa salvaje y de su mutante <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> no presentan diferencias entre s&#237; ni con las cepas de referencia&#46; Se destaca la presencia de una banda proteica mayoritaria&#44; de aproximadamente 130<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig&#46; 1</a>A&#41;&#44; reconocida por los anticuerpos espec&#237;ficos anti-S-layer &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig&#46; 1</a>B&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Debido a que la mutaci&#243;n en el gen <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> afecta el transporte de aminoaz&#250;cares&#44; por ejemplo&#44; el de N-acetilglucosamina &#40;GlcNAc&#41;&#44; se analiz&#243; su posible rol en las modificaciones postraduccionales de la prote&#237;na S-layer&#46; Para ello&#44; se realizaron cultivos en LB suplementados o no con N-acetilglucosamina &#40;donor de grupos glucanos&#41; y se analizaron las fracciones proteicas de ambas cepas en la fase exponencial del crecimiento &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig&#46; 2</a>A&#41;&#46; No se encontraron patrones de peso molecular de S-layer alterados&#46; Por otro lado&#44; para evaluar el efecto del sustrato&#44; se utiliz&#243; un medio con una &#250;nica fuente de carbono&#58; medio m&#237;nimo suplementado con GlcNAc o con glutamato &#40;control&#41; &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig&#46; 2</a>B&#41;&#46; La cepa mutante <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> no logr&#243; crecer con GlcNAc como &#250;nica fuente de carbono&#44; tal como se esperaba&#46; La cepa salvaje no mostr&#243; diferencias en sus S-layer cuando fue crecida con o sin el aminoaz&#250;car GlcNAc&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A su vez&#44; se realiz&#243; una purificaci&#243;n de la prote&#237;na S-layer de los cultivos en fase exponencial &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig&#46; 3</a>&#41;&#46; Se comprob&#243; la presencia de la misma banda de peso molecular de 130<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa correspondiente a la S-layer hallada en los extractos proteicos de las bacterias enteras&#46; Adem&#225;s&#44; en la mutante <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span>&#44; se detect&#243; una banda de mayor peso molecular &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig&#46; 3</a>A&#41;&#46; Se analiz&#243; la identidad de dicha banda por Western Blot utilizando anticuerpos espec&#237;ficos anti-S-layer y se comprob&#243; que tambi&#233;n esa banda correspond&#237;a a una isoforma de S-layer &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig&#46; 3</a>B&#41;&#46; Para determinar si la mutaci&#243;n del gen <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> afecta la incorporaci&#243;n de grupos glicos&#237;dicos y&#44; por lo tanto&#44; incide en las modificaciones postraduccionales de estas prote&#237;nas&#44; espec&#237;ficamente en la glicosilaci&#243;n&#44; se evalu&#243; la N-glicosilaci&#243;n de la prote&#237;na S-layer de la cepa salvaje y la mutante <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> utilizando el kit PRO-Q Emerald<span class="elsevierStyleSup">TM</span> &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig&#46; 3</a>C&#41;&#46; Las prote&#237;nas S-layer obtenidas de fase exponencial de ambas cepas se ti&#241;eron en esta reacci&#243;n&#44; por lo que se concluye que la prote&#237;na S-layer de la cepa salvaje y ambas isoformas de la cepa <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> se encuentran glicosiladas&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0015"></elsevierMultimedia><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las esporas de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span> suelen retener sus prote&#237;nas S-layer&#44; que luego cumplen funciones espec&#237;ficas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a>&#46; Por ello&#44; se estudi&#243; el patr&#243;n de prote&#237;nas S-layer provenientes de cultivos enriquecidos en esporas &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig&#46; 4</a>A&#41;&#46; En este an&#225;lisis se observ&#243; la presencia de bandas correspondientes a la prote&#237;na S-layer con la cepa salvaje y la mutante&#46; Al igual que lo reportado en la cepa 2362<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a>&#44; el peso molecular de las prote&#237;nas en estos cultivos fue menor que los observados en los cultivos l&#237;quidos en fase exponencial de crecimiento&#46; Asimismo&#44; la cepa <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> present&#243; dos isoformas de S-layer&#44; frente a las tres isoformas detectadas en la cepa salvaje&#46; Por otra parte&#44; algunas cepas de esta especie se caracterizan por su actividad larvicida&#44; mayormente asociada a prote&#237;nas de fase exponencial &#40;Mtx y S-layer&#41; y prote&#237;nas Bin de las esporas&#46; Debido a que las prote&#237;nas S-layer remanentes en las esporas presentaron diferencias entre cepas &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig&#46; 4</a>A&#41;&#44; se evalu&#243; mediante un ensayo de termosensibilidad la calidad del proceso de esporulaci&#243;n para ambas cepas &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig&#46; 4</a>B&#41;&#46; La cepa <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span>&#44; deficiente en el transporte de aminoaz&#250;cares&#44; mostr&#243; una sensibilidad t&#233;rmica mucho mayor&#44; ya detectable despu&#233;s de 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min de exposici&#243;n a 70<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#46; Estos hallazgos indican que el comportamiento fisiol&#243;gico de esporulaci&#243;n se encuentra alterado en la cepa mutante&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0020"></elsevierMultimedia><p id="par0125" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para continuar con el estudio del proceso de esporulaci&#243;n&#44; a las 96<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h se caracterizaron fenot&#237;picamente los cultivos mediante observaci&#243;n y recuento al microscopio&#46; En las <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">figuras 5A y 5B</a> se muestran las microscop&#237;as &#243;pticas de la cepa salvaje y la mutante&#44; respectivamente&#44; utilizadas en el ensayo de termorresistencia&#46; En concordancia con los hallazgos del ensayo de resistencia t&#233;rmica&#44; se puede observar que la cepa mutante fue incapaz de concluir la esporulaci&#243;n&#44; dando lugar a cultivos con un alto porcentaje de bacilos con endosporas &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">fig&#46; 5</a>C&#41;&#46; Estos resultados indican que la interrupci&#243;n del gen <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> provoca una disrupci&#243;n en el proceso de esporulaci&#243;n en medios ricos&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0025"></elsevierMultimedia><p id="par0130" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En trabajos anteriores se identific&#243; a la S-layer como un factor de virulencia y se estableci&#243; una relaci&#243;n directa entre la capacidad hemol&#237;tica de la S-layer de una cepa y su actividad como pat&#243;geno de mosquitos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">4</span></a>&#46; Teniendo en cuenta estos antecedentes&#44; se analiz&#243; la capacidad hemol&#237;tica de extracciones de S-layer obtenidas de ambas cepas en la fase exponencial de crecimiento &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">fig&#46; 5</a>D&#41;&#46; Las S-layer provenientes de ambas cepas presentaron actividad hemol&#237;tica &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">fig&#46; 5</a>D&#41;&#46; Sin embargo&#44; la S-layer de la mutante <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> se asoci&#243; con mayores niveles de hem&#243;lisis que la S-layer de la cepa salvaje a iguales concentraciones &#40;por debajo del m&#225;ximo ensayado&#41;&#44; en coincidencia con el hallazgo de una mayor proporci&#243;n de la isoforma de S-layer de alto peso molecular&#46;</p></span><span id="sec0070" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0095">Discusi&#243;n y conclusiones</span><p id="par0135" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En este trabajo confirmamos la presencia de prote&#237;nas S-layer en <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span> ASB13052&#44; las que fueron reconocidas por anticuerpos anti-S-layer generados contra la cepa de referencia 2362&#46; Esto demuestra la similitud antig&#233;nica&#46;</p><p id="par0140" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Uno de los objetivos principales de esta investigaci&#243;n fue determinar si la presencia de una mutaci&#243;n en el gen <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span>&#44; involucrado en el transporte de N-acetilglucosamina al interior celular&#44; podr&#237;a afectar a los componentes de envoltura&#44; m&#225;s espec&#237;ficamente&#44; a la S-layer&#46; Se sabe que la N-acetilglucosamina funciona como donor de grupos glicos&#237;dicos y que&#44; a su vez&#44; regula procesos de represi&#243;n catab&#243;lica<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>&#46; Si la s&#237;ntesis y actividad de la S-layer fuesen afectadas por el fen&#243;meno de represi&#243;n catab&#243;lica o la glicosilaci&#243;n&#44; una mutaci&#243;n en un gen clave en estos procesos&#44; como el gen <span class="elsevierStyleItalic">ptsH&#44;</span> podr&#237;a ocasionar la aparici&#243;n de patrones proteicos diferentes en la cepa que porta la mutaci&#243;n&#46;</p><p id="par0145" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En este estudio no se observaron cambios en los patrones proteicos de la cepa mutada comparada con la salvaje al hacerlas crecer por hasta 8<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h en medios ricos&#44; suplementados o no con N-acetilglucosamina&#46; Cuando se emplean medios ricos no definidos&#44; cabe esperar que no existan diferencias debido a que mol&#233;culas de diversa &#237;ndole podr&#237;an cumplir el papel de intermediarios de reacci&#243;n en el interior celular&#46; Sin embargo&#44; en esta investigaci&#243;n&#44; tampoco se alteraron los patrones proteicos en bacterias provenientes de medios m&#237;nimos&#46; Estos resultados indicar&#237;an que la s&#237;ntesis de la prote&#237;na S-layer&#44; al menos la de la asociada a la banda de 130<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa&#44; ocurre con independencia de la fuente de carbono o del medio de cultivo utilizado&#46;</p><p id="par0150" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se sabe que hay organismos donde la fase de crecimiento altera la composici&#243;n de la envoltura&#46; En <span class="elsevierStyleItalic">Bacillus anthracis</span>&#44; por ejemplo&#44; la entrada en la fase estacionaria provoca el recambio de una prote&#237;na de superficie por otra<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0255"><span class="elsevierStyleSup">21</span></a>&#46; En la cepa secuenciada <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span> C3-41&#44; se encontraron 22 marcos de lectura que pod&#237;an codificar la S-layer<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">16</span></a>&#46;</p><p id="par0155" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En otros microorganismos de la misma especie&#44; como la cepa de referencia 2362 &#40;Accession Number CP015224&#46;1&#41;&#44; se han identificado al menos 13 genes codificantes de S-layer de distinto peso molecular&#44; y en la cepa JG-B53&#44; 8 genes de expresi&#243;n alternativa<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0245"><span class="elsevierStyleSup">19</span></a>&#46; Recientemente&#44; se demostr&#243; en la bacteria emparentada <span class="elsevierStyleItalic">Bacillus cereus</span> que una modificaci&#243;n de la din&#225;mica de expresi&#243;n de SL2 y EA1&#44; las dos prote&#237;nas S-layer que produce&#44; modifica su abundancia relativa&#46; Esto determina cambios en sus propiedades superficiales&#44; lo cual contribuye a la supervivencia de <span class="elsevierStyleItalic">B&#46; cereus</span> en condiciones de inanici&#243;n<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0185"><span class="elsevierStyleSup">7</span></a>&#46; En resumen&#44; en muchas cepas de <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span>&#44; no hay una &#250;nica prote&#237;na S-layer y estas pueden sufrir alg&#250;n tipo de modificaci&#243;n&#46;</p><p id="par0160" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En esta investigaci&#243;n&#44; al cultivar durante un per&#237;odo m&#225;s largo&#44; de 16<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h&#44; se observ&#243; en la cepa mutante <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> la aparici&#243;n de una banda de mayor peso molecular que la correspondiente a la S-layer caracter&#237;stica&#44; de 130<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa&#46; Asimismo&#44; a medida que avanz&#243; el proceso de esporulaci&#243;n&#44; se pudieron distinguir tres bandas de menos de 130<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa en la cepa salvaje y solo dos bandas de menos de 130<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa en la mutante&#46; As&#237;&#44; nuestros resultados muestran que el patr&#243;n proteico de S-layer se modifica conforme cambia el estadio de crecimiento de la bacteria&#46; Futuros ensayos ayudar&#225;n a dilucidar si estas bandas representan el producto de s&#237;ntesis de un nuevo tipo de S-layer o son la consecuencia de un clivaje proteico&#44; resultado de la acci&#243;n de las proteasas secretadas en el proceso de esporulaci&#243;n&#46; Tambi&#233;n ser&#225; preciso analizar si las distintas bandas observadas corresponden a asociaciones entre la S-layer y las prote&#237;nas del cristal &#40;BinA y BinB&#41;&#44; tal cual fue demostrado previamente en el laboratorio<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">4</span></a>&#46;</p><p id="par0165" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las glicosilaciones en las prote&#237;nas S-layer son las modificaciones postraduccionales m&#225;s frecuentes en bacterias&#46; Se han encontrado en cepas cercanas a <span class="elsevierStyleItalic">L</span>&#46; <span class="elsevierStyleItalic">sphaericus</span>&#44; como <span class="elsevierStyleItalic">Paenibacillus alvei</span> o <span class="elsevierStyleItalic">Lentilactobacillus</span><span class="elsevierStyleItalic">kefiri</span>&#44; y en <span class="elsevierStyleItalic">Geobacillus</span><span class="elsevierStyleItalic">stearothermophylus</span><a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0190"><span class="elsevierStyleSup">8&#44;24</span></a>&#46; Hasta la fecha&#44; no se han informado glicosilaciones sobre la S-layer de <span class="elsevierStyleItalic">Lysinibacillus</span><span class="elsevierStyleItalic">sphaericus</span>&#46; En este trabajo hemos analizado cualitativamente este punto y verificamos la presencia de grupos glicanos en las S-layer en este microorganismo&#44; con un patr&#243;n de glicosilaci&#243;n coincidente en ambas cepas&#46; Por consiguiente&#44; todas las variaciones que se detectaron en el patr&#243;n de peso molecular de la S-layer se podr&#237;an atribuir a modificaciones que sufre la prote&#237;na debido a la transici&#243;n por distintas fases de crecimiento o a la expresi&#243;n de otros genes codificantes de prote&#237;nas de capa S&#46; Estas hip&#243;tesis se basan en hallazgos reportados no solo en el dominio Bacteria&#44; sino tambi&#233;n en el dominio Arquea&#46; En este &#250;ltimo dominio&#44; se han documentado modificaciones postraduccionales de prote&#237;nas S-layer&#44; incluido el clivaje proteol&#237;tico por proteasas de membrana o la formaci&#243;n de mult&#237;meros<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0240"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a>&#46; En el dominio Bacteria&#44; se ha documentado el recambio de isoformas de S-layer en <span class="elsevierStyleItalic">B</span>&#46; <span class="elsevierStyleItalic">anthracis</span>&#44; mientras que en <span class="elsevierStyleItalic">L</span>&#46; <span class="elsevierStyleItalic">sphaericus</span> JG-B53 se observ&#243; que genes alternativos de S-layer se expresaron parcialmente frente a distintas condiciones&#44; lo que permitir&#237;a r&#225;pidas adaptaciones en entornos cambiantes<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0245"><span class="elsevierStyleSup">19&#44;21</span></a>&#46;</p><p id="par0170" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los experimentos de resistencia t&#233;rmica revelaron que la mutaci&#243;n en el gen <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> produce efectos no solo sobre la S-layer&#44; sino tambi&#233;n sobre la esporulaci&#243;n&#44; dando lugar a esporulaciones incompletas que afectan la calidad de la forma de resistencia de la cepa&#46; Incluso en cultivos de m&#225;s de 96<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h&#44; la cepa mutante no mostr&#243; la completa liberaci&#243;n de esporas y un gran porcentaje de c&#233;lulas se presentaban con endosporas&#46; Todo esto indica que la interrupci&#243;n del gen <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> provoca una disrupci&#243;n en el proceso de esporulaci&#243;n en medios ricos&#46; Es sabido que el sistema PTS participa en la regulaci&#243;n de muchas funciones celulares importantes para controlar procesos relacionados con la colonizaci&#243;n de ambientes&#44; aunque las funciones exactas no han sido dilucidadas&#46; En <span class="elsevierStyleItalic">B&#46; cereus</span>&#44; el gen <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> juega un papel importante en la resistencia al estr&#233;s oxidativo&#44; la absorci&#243;n de glucosa &#40;az&#250;car PTS&#41;&#44; la formaci&#243;n de biofilms y el movimiento de <span class="elsevierStyleItalic">swarming</span>&#44; eventos caracter&#237;sticos de la colonizaci&#243;n bacteriana en la rizosfera<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0215"><span class="elsevierStyleSup">13</span></a>&#46;</p><p id="par0175" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El sistema de transporte de aminoaz&#250;cares PTS est&#225; directamente relacionado con la represi&#243;n catab&#243;lica por carbono&#44; lo que les permite a las bacterias utilizar m&#225;s eficientemente las fuentes de carbono y mejorar&#44; as&#237;&#44; la tasa de crecimiento y su sobrevida en ambientes naturales y en entornos cambiantes<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210"><span class="elsevierStyleSup">12</span></a>&#46; En este caso&#44; pudimos comprobar que la disrupci&#243;n de la funci&#243;n del gen <span class="elsevierStyleItalic">ptsH</span> perjudica el proceso de esporulaci&#243;n&#44; estrategia adaptativa de las bacterias para sobrevivir en condiciones desfavorables&#46; Sin embargo&#44; como este proceso involucra la s&#237;ntesis y funci&#243;n de m&#250;ltiples proteasas&#44; una esporulaci&#243;n defectuosa permitir&#237;a conservar la actividad de prote&#237;nas que hubieran sido degradadas en una cepa salvaje&#46;</p><p id="par0180" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Es sabido que la prote&#237;na S-layer est&#225; directamente relacionada con la virulencia del organismo en bacterias como <span class="elsevierStyleItalic">Tannerella forsythia</span>&#44; <span class="elsevierStyleItalic">B&#46; cereus</span> y <span class="elsevierStyleItalic">B&#46; anthracis</span><a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0200"><span class="elsevierStyleSup">10&#44;11&#44;28</span></a>&#46; En <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span>&#44; hemos demostrado que la toxicidad de su S-layer est&#225; directamente relacionada con la capacidad hemol&#237;tica y que su presencia es sin&#233;rgica con su actividad mosquitocida<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">4</span></a>&#46; Los resultados obtenidos en este trabajo indican un mayor potencial hemol&#237;tico en la cepa mutante&#44; coincidente con la aparici&#243;n de una isoforma de la prote&#237;na S-layer de mayor peso molecular&#46; La diferencia entre estas isoformas podr&#237;a deberse a la ausencia de clivaje &#40;por menor actividad de proteasas en la mutante&#41; del p&#233;ptido l&#237;der de caracter&#237;sticas hidrof&#243;bicas hacia el extremo amino terminal&#44; de aproximadamente 7&#44;2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa&#44; en <span class="elsevierStyleItalic">L&#46; sphaericus</span> 2362&#46; Una versi&#243;n de la S-layer portadora de una regi&#243;n altamente hidrof&#243;bica podr&#237;a interactuar m&#225;s f&#225;cilmente con la membrana de los gl&#243;bulos rojos y perturbarlos en mayor medida&#46; Otra posibilidad que justificar&#237;a el mayor grado de hem&#243;lisis es que la prote&#237;na Mtx &#40;cuyo peso molecular es similar al de la S-layer&#41; permanezca asociada a la S-layer en la mutante&#44; mientras que&#44; en condiciones normales&#44; en la cepa salvaje dicha prote&#237;na es f&#225;cilmente degradada hacia el final de la fase exponencial de crecimiento<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0300"><span class="elsevierStyleSup">30</span></a>&#46; Una tercera posibilidad es que&#44; al ser incapaz de esporular eficientemente con la correspondiente bater&#237;a de proteasas preponderantes&#44; las c&#233;lulas de la cepa mutante retuvieran las toxinas Mtx&#46; La sinergia entre las toxinas Bin &#40;o Cry de <span class="elsevierStyleItalic">Bacillus</span><span class="elsevierStyleItalic">thuringiensis</span>&#41; y las toxinas Mtx ya ha sido documentada&#44; tambi&#233;n se ha determinado que la combinaci&#243;n de toxinas Cry y Mtx es capaz de anular la resistencia a las preparaciones esporales por parte de los mosquitos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0295"><span class="elsevierStyleSup">29</span></a>&#46; Ser&#237;a interesante realizar experimentos con preparaciones mixtas &#40;toxinas Cry&#44; Mtx y S-layer&#41; con el fin de evaluar el efecto conjunto en cepas defectuosas en esporulaci&#243;n&#44; como la empleada en este trabajo&#46;</p></span><span id="sec0075" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0100">Financiaci&#243;n</span><p id="par0185" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El estudio fue financiado con fondos provenientes de subsidios UBACyT &#40;20020220400185BA&#41; y ANPCyT &#40;PICT 2020 N&#46;&#176; 1445&#41;&#46;</p></span><span id="sec0080" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0105">Conflicto de intereses</span><p id="par0190" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran no tener ning&#250;n conflicto de intereses&#46;</p></span></span>"
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Información del artículo

ISSN: 03257541
Idioma original: Español

DOI:10.1016/j.ram.2024.05.006

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