Criopreservación de células estromales derivadas del tejido adiposo: comparación de diferentes medios de criopreservación

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El cambio en los valores pre y postoperatorios fueron estadísticamente significativos, todos con p<0,001. 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Si bien el tejido adiposo rutinariamente se ha manejado como material de desecho, cirujanos plásticos y otros investigadores han documentado su uso como fuente abundante y accesible de células estromales multipotenciales utilizables en medicina regenerativa<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0125">1</a>. Dichas células se caracterizan por presentar marcadores estromales positivos (>90%) como CD13, CD73 y CD90, y marcadores hematopoyéticos negativos (<2%) como CD11b y CD45<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0130">2</a>. Diversos estudios han demostrado que estas mantienen su capacidad de diferenciación en múltiples tipos celulares incluyendo osteoblastos, condrocitos, adipocitos, miocitos y neuronas, luego de una expansión in vitro<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0125">1,3-5</a>.Las células estromales derivadas del tejido adiposo (CEDA) han probado ser candidatas adecuadas para muchas aplicaciones en medicina regenerativa e ingeniería de tejidos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0145">5</a>, tales como defectos y trastornos óseos, enfermedades cardiovasculares, trastornos neurológicos, enfermedades autoinmunes, así como para mejorar el resultado del trasplante de médula ósea y de órganos sólidos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0150">6,7</a>.Existe interés creciente en el almacenamiento y la preservación de estas células para su posterior aplicación clínica, para lo cual es importante que el método de criopreservación a utilizar logre mantener adecuadas tasas de la viabilidad y preservar el potencial de diferenciación de las CEDA luego de un ciclo de congelación<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160">8</a>. La comprensión de las características biológicas durante el almacenamiento y posdescongelación de estas células es esencial en la investigación preclínica y clínica para asegurar la preservación de sus propiedades<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165">9</a>. Por lo tanto, el desarrollo de protocolos efectivos de almacenamiento de CEDA aumentará su uso y su utilidad en la aplicación en ingeniería de tejidos.La criopreservación requiere de la utilización de productos químicos que cumplan con la función de ser agentes crioprotectores (CP), equipamiento de congelación y, obviamente, su almacenaje en nitrógeno líquido. Ha mostrado ser el protocolo más eficiente en cuanto a recuperación de células viables postalmacenamiento y es ampliamente utilizada. El medio ideal para criopreservar CEDA es aquel que reúna condiciones de atoxicidad y que logre una mayor tasa de viabilidad celular sin disminuir el potencial de diferenciación. Es así como la elección del CP o la composición de un medio óptimo de criopreservación es un área de intensa investigación en el campo de la criobiología, en la cual no hay consenso.Nuestra línea de trabajo está dirigida hacia la aplicación clínica de las CEDA para medicina regenerativa. Para esto, se deben generar protocolos que optimicen la tasa de viabilidad poscriopreservación sin necesidad de utilizar criopreservantes que contengan proteínas animales. El dimetilsulfóxido (DMSO) es uno de los CP más utilizados y de mejor rendimiento en cuanto a tasa de viabilidad poscriopreservación. Los resultados prometedores obtenidos con trehalosa en criopreservación de tejido adiposo y CEDA hacen suponer que la combinación de ambos optimizaría el proceso. La albúmina humana, por su parte, puede mejorar el control de pH y protegería a las CEDA contra el daño por congelación. Debido a lo anterior, creemos que la combinación de los diferentes medios de criopreservación mencionados previamente con nuestro medio de criopreservación de uso habitual (DMSO 10%), aumentaría la tasa de viabilidad poscriopreservación sin necesidad de utilizar CP que contengan proteínas animales.El objetivo de nuestro trabajo fue obtener células estromales humanas derivadas del tejido adiposo, medir y comparar las tasas de viabilidad justo antes e inmediatamente después de un ciclo de criopreservación con diferentes combinaciones de CP, de manera de obtener el mejor medio de criopreservación.Material y métodoPacientes y muestraSe utilizó grasa fresca de tejido celular subcutáneo de la pared abdominal de 5 pacientes lipoaspiradas de manera electiva en el Hospital Clínico de la Universidad de Chile. Se utilizaron como criterios de inclusión pacientes de sexo femenino, entre 20 a 45años de edad, con índice de masa corporal (IMC) inferior a 28kg/m2 y sin comorbilidades asociadas. Se excluyeron pacientes de sexo masculino, con comorbilidades, IMC mayor a 28, que tomen medicamentos, fumadores y menores de 20 o mayores de 45años de edad.Se obtuvo la autorización de cada paciente mediante un consentimiento informado escrito, aprobado por el comité de ética científico de la misma institución.El tamaño muestral se calculó mediante la siguiente fórmula, en la cual se considera que un grupo es su propio control<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170">10</a>:<elsevierMultimedia ident="eq0005"></elsevierMultimedia>Obtención de las células estromales derivadas del tejido adiposoLas muestras se obtuvieron al comienzo de la cirugía. Se transportaron en contenedores a 4°C y se almacenaron a la misma temperatura, para ser procesadas dentro de las 6h de ser extraídas de los pacientes. Se utilizaron 100ml de grasa fresca y se lavaron con una solución tampón fosfato (PBS) a temperatura ambiente para remover eritrocitos y leucocitos.Se rescató el tejido adiposo sobrenadante y se resuspendió en un volumen equivalente de medio DMEM/F12 (Gibco, EE.UU.) con colagenasa tipoi 0,1% (Gibco, EE.UU.). La solución se incubó en un baño a 37°C, con agitación continua durante 90min Luego de esto, la solución se centrifugó a 600G por 20min a temperatura ambiente para separar los adipocitos maduros de la fracción vascular estromal (FVE). Se aspiró el sobrenadante, quedando el pellet que corresponde a la FVE que contiene las CEDA. La FVE se resuspendió en el medio de cultivo (DMEM/F12 +10%SFB +gentamicina +ciprofloxacino [0,5mg/100ml] +voriconazol [50μl/100ml]) y se sembró en placas de cultivo de 100mm de diámetro para expansión celular. Todo fue realizado en condiciones de esterilidad y con campanas de bioseguridad claseii del Laboratorio de Terapia Celular del Programa de Farmacología Molecular y Clínica, Instituto de Ciencias Biomédicas de la Facultad de Medicina, Universidad de Chile.Se expandieron las células realizando subcultivos (1:2) cada vez que se alcanzaba el 80% de confluencia.Caracterización de las células estromales derivadas del tejido adiposoSe realizó un panel de inmunofenotipificación mediante citometría de flujo en 3 muestras de CEDA de nuestro laboratorio, en el subcultivo número3. Se consideraron 20.000 eventos por marcador, como control de calidad correspondiente a la utilización de estas células<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0130">2,11</a>.Proceso de criopreservaciónLa criopreservación se llevó a cabo entre los subcultivos 3-4 (dentro de la fase exponencial de crecimiento). Una vez alcanzada la cantidad celular necesaria (4,5 a 5 millones de células, aproximadamente), se liberaron las células de la misma forma que para un subcultivo. Luego se realizaron recuentos con Trypan Blue en cámara de Neubauer, rescatándose una muestra de 0,5×106células/ml para criopreservarla en un medio vehículo (DMEM/F12 con rojo fenol, Gibco, EE.UU.) con diferentes combinaciones de agentes criopreservantes. El control se realizó con medio vehículo sin CP. Las combinaciones de agentes criopreservantes utilizadas fueron las siguientes:<ul class="elsevierStyleList" id="lis0005"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0005">1)DMSO 10% (1,5M) (medio habitual).</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0010">2)DMSO 10% (1,5M)+trehalosa 7,6% (0,2M).</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0015">3)DMSO 10% (1,5M)+albúmina humana 10%.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0020">4)DMSO 10% (1,5M)+trehalosa 7,6% (0,2M)+albúmina humana 10%.</li></ul>Se utilizó una técnica para llevar los criotubos a −80°C de manera semicontrolada. Para este fin, se utilizó un receptáculo con isopropil alcohol que produce una disminución de la temperatura a una velocidad aproximada de 1°C/min (Thermo Scientific Nalgene Mr. Frosty)<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0180">12,13</a>. Al día siguiente los criotubos se cambiaron a nitrógeno líquido para ser almacenados hasta su utilización. A las 4 semanas se descongelaron en un baño a 37°C (1min) y se evaluó la viabilidad.Evaluación de la viabilidadSe determinó la viabilidad de las CEDA con citometría de flujo cuantitativa antes y después de un ciclo de criopreservación. Luego de 4 semanas de criopreservación se descongelan los criotubos en un baño a 37°C (1 a 1,5min). Una vez descongelados, se lavan las células de CP con 3ml de medio completo, se homogeneiza la muestra y se traspasa a tubos de 15ml para centrifugar a 2.000rpm por 10min Se descarta el sobrenadante, se agrega 2ml de medio completo y se resuspende. Se realiza conteo en cámara de Neubauer para utilizar la cantidad de células necesarias para cada ensayo.Luego se cargaron 3 tubos para citometría con 200μl de suspensión celular (0,5×106células/ml) por cada condición y paciente. Como controles se utilizaron células necróticas inducidas por metanol<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0190">14</a> (un tubo) y células vivas no criopreservadas (un tubo) de cada paciente. Se utilizó el marcador ioduro de propidio (IP), mezclando la suspensión celular con 2μl de IP antes de la adquisición de datos por el citómetro. La tinción celular con IP indica que se ha alterado la integridad de la membrana plasmática, por lo que su marcación con el colorante indica que las células se encuentran necróticas, distinguiéndose así de las células vivas. La citometría, por lo tanto, mostrará 2 poblaciones celulares: vivas (IP-negativas) y necróticas (IP-positivas). Las células se analizaron mediante un sistema de citometría de flujo Becton-Dickinson, considerando 40.000 eventos como significativos.La tasa de viabilidad obtenida mediante citometría de flujo con IP se calculó mediante la siguiente fórmula:<elsevierMultimedia ident="eq0010"></elsevierMultimedia>Análisis estadísticoTodos los datos se expresaron como promedio ±desviación estándar (promedio ±DS). El análisis estadístico se realizó comparando las diferentes condiciones de criopreservación entre sí, utilizando el test de ANOVA para comparaciones múltiples, seguido de un test post hoc no paramétrico (Tukey's Test), utilizando el programa inerSTAT 1.3. Se consideró un valor de p<0,05 como estadísticamente significativo.ResultadosSe obtuvieron células estromales derivadas del tejido adiposo lipoaspirado en los 5 pacientes que cumplieron con los criterios de inclusión. El panel de inmunofenotipificación fue compatible con CEDA (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a>).<elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia>Se midió la viabilidad de las CEDA de cada paciente mediante citometría de flujo con IP en cada una de las condiciones estudiadas. En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">figura 1</a> se observan ejemplos de histogramas obtenidos del control negativo (células necróticas), control positivo (células vivas), precriopreservación y poscriopreservación.<elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia>El promedio de las tasas de viabilidad y mortalidad obtenidas con IP en las diferentes condiciones se observan en la <a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#fig0010">figuras 2 y 3</a>, respectivamente. Las tasas de viabilidad obtenidas en las diferentes condiciones fueron, respectivamente: 1)61,88%; 2)58,05%; 3)66,09%, y 4)68,08%. Las tasas de mortalidad obtenidas en las diferentes condiciones fueron, respectivamente: 1)32,62%; 2)35,76%; 3)29,15%, y 4)26,52%. Al analizar las tasas de viabilidad y mortalidad en cada condición de CP y comparándolas entre sí mediante ANOVA, se concluye que ningún medio tiene mejor rendimiento, ya que no hay diferencias significativas entre ellos (p=0,50394).<elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="fig0015"></elsevierMultimedia>El análisis de la viabilidad mediante citometría de flujo con IP, previo y posterior a un ciclo de criopreservación, sugiere que ninguna condición estudiada es estadísticamente superior a las demás en cuanto a rendimiento.DiscusiónEl medio ideal para criopreservar CEDA es aquel que sea no tóxico y que logre una mayor viabilidad celular sin disminuir el potencial de diferenciación. Está descrito que la combinación de CP en el medio de criopreservación podría lograr mayores tasas de vitalidad<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0195">15</a>.La optimización los resultados en el proceso de criopreservación de tejido adiposo<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0200">16,17</a> y CEDA al agregar trehalosa no se vio reflejada en nuestros resultados. Es posible que el efecto sinérgico descrito para la trehalosa no se observe a concentraciones de DMSO 10%. De Rosa et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210">18</a>, al evaluar el efecto de diferentes CP sobre la viabilidad de CEDA, concluyeron que el efecto óptimo criopreservante se logra con DMSO 4%, trehalosa 6% y suero fetal bovino (SFB) 90%. Otro estudio, recientemente publicado demuestra que se obtienen mayores tasas de viabilidad al utilizar DMSO 5% comparado con trehalosa 0,25M, y que no se obtienen mayores tasas al combinar DMSO 5% con diferentes concentraciones SFB, concluyendo que el CP ideal es DMSO 5%<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160">8</a>. En nuestro caso, la razón de no lograr mejores tasas de vitalidad al combinar trehalosa con DMSO 10% probablemente radica en el hecho que el efecto final de ambos CP de disminuir la formación de hielo intracelular mediante distintos mecanismos es redundante.Una forma de optimizar la viabilidad posterior a un ciclo de criopreservación es agregando SFB a la solución de CP. Se han logrado tasas de viabilidad mayores al 80% cuando se usa SFB a concentraciones del 90%<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210">18</a> o del 95%<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0215">19</a>, en asociación a DMSO 4% +trehalosa 6% o DMSO 5%, respectivamente. El problema de utilizar SFB radica en la pérdida del principio alogénico, con el consiguiente riesgo de transmisión de enfermedades virales o por priones y la ocurrencia de rechazo inmunogénico.Estudios recientes han visto que al reemplazar el SFB por plasma humano autógeno (HP) en el protocolo de criopreservación (DMSO 5% +HP 95%) se logran tasas similares de viabilidad, todas mayores al 80%, analizadas con Trypan Blue<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0215">19</a>. El plasma humano autógeno tiene la desventaja de ser un medio no definido en cuanto a su composición y ser variable inter e intrapersonal, con respecto al sexo, edad, estados patológicos etc.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0220">20</a>. El uso de plasma autógeno sería intercambiable por albúmina humana 5% como criopreservantes en asociación a DMSO 7,5%, en células madres derivadas de sangre periférica<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0225">21</a>. Esto nos hace suponer que ellos se aproximarían al medio ideal definido y libre de proteína animal. En nuestros resultados existe una mayor tasa de viabilidad poscriopreservación al agregar albúmina humana que, si bien no es significativa, muestra una tendencia que podría explicarse por el efecto de la albúmina mediante otro mecanismo, probablemente mejorando el control del pH<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0230">22</a>.La menor tasa de viabilidad a la descrita previamente, posterior a 4 semanas de criopreservación, no puede ser explicada por el tiempo de almacenamiento de las CEDA en nitrógeno líquido (aproximadamente −196°C). Se ha observado que estas células mantienen tasas de viabilidad >80% luego de 1 y 6meses, cayendo solo al 70% al año de criopreservación<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210">18</a>. Sin embargo, estas mantienen su capacidad de diferenciación y el fenotipo de los marcadores de superficie. Otro factor que podría haber influido en las tasas de viabilidad poscriopreservación obtenidas es la velocidad a la cual las células son congeladas. La velocidad controlada (1°C/min) tiene mejores resultado en la criopreservación de células mamíferas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0235">23</a>. El descenso controlado de la temperatura permite que se forme hielo extracelular mientras el agua supercooled (proceso mediante el cual se disminuye la temperatura de un líquido o gas bajo su punto de congelación sin llevarlo a estado sólido) se transporta fuera de la célula, logrando así la vitrificación del medio intracelular. A velocidades más lentas se genera daño, producto de un aumento de la concentración de solutos intracelulares a medida que el agua sale de la célula llegando a la deshidratación. Por el contrario, a velocidades más rápidas el agua no alcanza a salir de la célula y se genera hielo intracelular que produce la rotura de la membrana<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0235">23</a>. La utilización de un sistema semicontrolado o no automático podría exponer a las células a velocidades mayores o menores a la ideal durante el proceso de congelación, provocando una disminución en las tasas de viabilidad cuando se compara con sistemas automatizados de disminución de la temperatura.Si bien nuestro rendimiento en cuanto a viabilidad poscriopreservación es inferior al reportado por otros autores<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0190">14,15</a>, la evaluación de estas tasas habitualmente se realiza mediante una técnica poco precisa, como es la exclusión con Trypan Blue<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0215">19,24</a>. Se ha descrito que esta técnica tiende a sobreestimar la viabilidad; por ejemplo, un 90% de células descongeladas se excluyen con esta prueba (viables). Sin embargo, solo un 60% demuestra ser capaz de adherirse a sustrato a las 24h<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0240">24</a>. La medición de la viabilidad utilizando una técnica más precisa como IP por citometría de flujo es una estrategia más adecuada para enfrentar esta interrogante, ya que mide la viabilidad evaluando la integridad de la membrana plasmática y nuclear, que nos informa la etapa final de la muerte celular, por lo que células inviables no impactan la mortalidad.Es así como podemos afirmar que la criopreservación de las CEDA en un medio que combine DMEM/F12 con DMSO 10% +trehalosa 0,2M +albúmina humana 10% no resulta en una tasa de recuperación de células viables significativamente mayor que las congeladas solo con DMSO 10%, en lo cual pueden influir diversos factores, previamente discutidos.Llama la atención que aun utilizando diversas combinaciones de CP se obtuvieron tasas de vitalidad relativamente menores en todas las condiciones (60-70%) comparado a lo descrito en la literatura (alrededor de 85-95%)<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0190">14,15,19</a>. El desafío ahora es intentar esclarecer las variables que podrían haber influido en este proceso mediante estudios de criopreservación con un sistema de descenso automatizado de la temperatura, a través de la utilización de diferentes combinaciones de CP, ya sea disminuyendo la concentración de DMSO para evitar mecanismos redundantes o incorporando otros CP como la sericina, que han mostrado tasas de viabilidad de CEDA alentadoras poscriopreservación<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0240">24</a>. Además sería interesante conocer las características de las células descongeladas en cuanto a su capacidad de adherirse y expandirse en la placa, formar colonias y diferenciarse en diferentes tipos celulares.ConclusionesLa medición de la viabilidad de CEDA posterior a un ciclo de criopreservación mediante el análisis a nivel estructural del IP por citometría de flujo nos hace concluir que ninguna condición estudiada es superior a las demás en cuanto a rendimiento. Es así como podemos afirmar que la criopreservación de las CEDA en un medio que combine DMEM/F12 con DMSO 10% +trehalosa 0,2M +albúmina humana 10% no logra una tasa de recuperación de células vitales significativamente mayor que las congeladas solo con DMSO 10%.Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses." 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Material y métodoMedición de la tasa de viabilidad poscriopreservación de células estromales derivadas del tejido adiposo obtenidas de 5 pacientes utilizando medios definidos (DMEM/Ham F12) libres de suero bovino y suplementados con una de los siguientes combinaciones de compuestos: dimetilsulfóxido (DMSO) 10%; DMSO 10% +trehalosa 7,6%; DMSO 10% +albúmina humana 10% y DMSO 10% +trehalosa 7,6% +albúmina humana 10%, mediante citometría de flujo con ioduro de propidio. ResultadosNo existen diferencias estadísticamente significativas en las tasas de viabilidad de las células estromales posterior a un ciclo de criopreservación. Sin embargo, se observa una tendencia a mejorar la tasa de recuperación de células vitales al agregar albúmina humana. ConclusionesNo se observaron diferencias significativas entre las condiciones estudiadas, sugiriendo que ninguna es superior a las demás en cuanto a rendimiento. Es así como podemos afirmar que la criopreservación de las células estromales derivadas del tejido adiposo en un medio que combine DMEM/F12 con DMSO 10%+trehalosa 7,6%+albúmina humana 10% no logra una tasa de recuperación de células vitales significativamente mayor que las congeladas solo con DMSO 10%." "secciones" => array:4 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "abst0005" "titulo" => "Objetivo" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "abst0010" "titulo" => "Material y método" ] 2 => array:2 [ "identificador" => "abst0015" "titulo" => "Resultados" ] 3 => array:2 [ "identificador" => "abst0020" "titulo" => "Conclusiones" ] ] ] "en" => array:3 [ "titulo" => "Abstract" "resumen" => "AimTo obtain stromal cells derived from adipose tissue, to measure and compare viability rates before and immediately after cryopreservation cycle, using different combinations of cryoprotective agents in order to identify the best cryopreservation medium. Material and methodViability rate after cryopreservation of stromal cells derived from adipose tissue were assessed by flow cytometry with propidium iodide. Samples of stromal cells obtained from 5 patients were kept defined, bovine serum-free media (DMEM/Ham-F12), supplemented with one of the following combinations of compounds: 10% dymethylsulfoxide (DMSO); Trehalose 10% DMSO +7.6%; 10% DMSO +10% human albumin and 10% DMSO +7.6% Trehalose +10% human albumin. ResultsNo statistically significant differences were observed in the viability rates of stromal cells derived from adipose tissue after a cryopreservation cycle. However, we observed a tendency towards improvement of recovery rate when human albumin was added to the medium. ConclusionsNone of the studied conditions proved superior to others in terms of cell vitality after a cryopreservation cycle. Hence, we conclude that the cryopreservation of stromal cells derived from adipose tissue in an environment that combines DMEM/F12 with 10% DMSO+7.6% Trehalose+human albumin 10% does not achieve a significantly higher recovery rate than only frozen solely with DMSO 10%." 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Artículo original

Cryopreservation of adipose derived stromal cells: comparison of different cryopreservation media

Nicolás Pereiraa,b,c,

Autor para correspondencia

doctornicolaspereira@gmail.com

Autor para correspondencia.

, Esteban Gonzáleza, Pablo Caviedesa

a Laboratorio de Terapia Celular, Programa de Farmacología Molecular y Clínica, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile, Santiago, Chile

b Departamento de Cirugía Plástica y Quemados, Hospital del Trabajador, Santiago, Chile

c Departamento de Cirugía Plástica, Clínica Las Condes, Santiago, Chile

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y marcadores hematopoy&#233;ticos negativos &#40;&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>2&#37;&#41; como CD11b y CD45<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0130"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>&#46; Diversos estudios han demostrado que estas mantienen su capacidad de diferenciaci&#243;n en m&#250;ltiples tipos celulares incluyendo osteoblastos&#44; condrocitos&#44; adipocitos&#44; miocitos y neuronas&#44; luego de una expansi&#243;n in vitro<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0125"><span class="elsevierStyleSup">1&#44;3-5</span></a>&#46;</p><p id="par0010" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las c&#233;lulas estromales derivadas del tejido adiposo &#40;CEDA&#41; han probado ser candidatas adecuadas para muchas aplicaciones en medicina regenerativa e ingenier&#237;a de tejidos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0145"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a>&#44; tales como defectos y trastornos &#243;seos&#44; enfermedades cardiovasculares&#44; trastornos neurol&#243;gicos&#44; enfermedades autoinmunes&#44; as&#237; como para mejorar el resultado del trasplante de m&#233;dula &#243;sea y de &#243;rganos s&#243;lidos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0150"><span class="elsevierStyleSup">6&#44;7</span></a>&#46;</p><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Existe inter&#233;s creciente en el almacenamiento y la preservaci&#243;n de estas c&#233;lulas para su posterior aplicaci&#243;n cl&#237;nica&#44; para lo cual es importante que el m&#233;todo de criopreservaci&#243;n a utilizar logre mantener adecuadas tasas de la viabilidad y preservar el potencial de diferenciaci&#243;n de las CEDA luego de un ciclo de congelaci&#243;n<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160"><span class="elsevierStyleSup">8</span></a>&#46; La comprensi&#243;n de las caracter&#237;sticas biol&#243;gicas durante el almacenamiento y posdescongelaci&#243;n de estas c&#233;lulas es esencial en la investigaci&#243;n precl&#237;nica y cl&#237;nica para asegurar la preservaci&#243;n de sus propiedades<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165"><span class="elsevierStyleSup">9</span></a>&#46; Por lo tanto&#44; el desarrollo de protocolos efectivos de almacenamiento de CEDA aumentar&#225; su uso y su utilidad en la aplicaci&#243;n en ingenier&#237;a de tejidos&#46;</p><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La criopreservaci&#243;n requiere de la utilizaci&#243;n de productos qu&#237;micos que cumplan con la funci&#243;n de ser agentes crioprotectores &#40;CP&#41;&#44; equipamiento de congelaci&#243;n y&#44; obviamente&#44; su almacenaje en nitr&#243;geno l&#237;quido&#46; Ha mostrado ser el protocolo m&#225;s eficiente en cuanto a recuperaci&#243;n de c&#233;lulas viables postalmacenamiento y es ampliamente utilizada&#46; El medio ideal para criopreservar CEDA es aquel que re&#250;na condiciones de atoxicidad y que logre una mayor tasa de viabilidad celular sin disminuir el potencial de diferenciaci&#243;n&#46; Es as&#237; como la elecci&#243;n del CP o la composici&#243;n de un medio &#243;ptimo de criopreservaci&#243;n es un &#225;rea de intensa investigaci&#243;n en el campo de la criobiolog&#237;a&#44; en la cual no hay consenso&#46;</p><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Nuestra l&#237;nea de trabajo est&#225; dirigida hacia la aplicaci&#243;n cl&#237;nica de las CEDA para medicina regenerativa&#46; Para esto&#44; se deben generar protocolos que optimicen la tasa de viabilidad poscriopreservaci&#243;n sin necesidad de utilizar criopreservantes que contengan prote&#237;nas animales&#46; El dimetilsulf&#243;xido &#40;DMSO&#41; es uno de los CP m&#225;s utilizados y de mejor rendimiento en cuanto a tasa de viabilidad poscriopreservaci&#243;n&#46; Los resultados prometedores obtenidos con trehalosa en criopreservaci&#243;n de tejido adiposo y CEDA hacen suponer que la combinaci&#243;n de ambos optimizar&#237;a el proceso&#46; La alb&#250;mina humana&#44; por su parte&#44; puede mejorar el control de pH y proteger&#237;a a las CEDA contra el da&#241;o por congelaci&#243;n&#46; Debido a lo anterior&#44; creemos que la combinaci&#243;n de los diferentes medios de criopreservaci&#243;n mencionados previamente con nuestro medio de criopreservaci&#243;n de uso habitual &#40;DMSO 10&#37;&#41;&#44; aumentar&#237;a la tasa de viabilidad poscriopreservaci&#243;n sin necesidad de utilizar CP que contengan prote&#237;nas animales&#46;</p><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El objetivo de nuestro trabajo fue obtener c&#233;lulas estromales humanas derivadas del tejido adiposo&#44; medir y comparar las tasas de viabilidad justo antes e inmediatamente despu&#233;s de un ciclo de criopreservaci&#243;n con diferentes combinaciones de CP&#44; de manera de obtener el mejor medio de criopreservaci&#243;n&#46;</p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0070">Material y m&#233;todo</span><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0075">Pacientes y muestra</span><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se utiliz&#243; grasa fresca de tejido celular subcut&#225;neo de la pared abdominal de 5 pacientes lipoaspiradas de manera electiva en el Hospital Cl&#237;nico de la Universidad de Chile&#46; Se utilizaron como criterios de inclusi&#243;n pacientes de sexo femenino&#44; entre 20 a 45<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>a&#241;os de edad&#44; con &#237;ndice de masa corporal &#40;IMC&#41; inferior a 28<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kg&#47;m<span class="elsevierStyleSup">2</span> y sin comorbilidades asociadas&#46; Se excluyeron pacientes de sexo masculino&#44; con comorbilidades&#44; IMC mayor a 28&#44; que tomen medicamentos&#44; fumadores y menores de 20 o mayores de 45<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>a&#241;os de edad&#46;</p><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se obtuvo la autorizaci&#243;n de cada paciente mediante un consentimiento informado escrito&#44; aprobado por el comit&#233; de &#233;tica cient&#237;fico de la misma instituci&#243;n&#46;</p><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El tama&#241;o muestral se calcul&#243; mediante la siguiente f&#243;rmula&#44; en la cual se considera que un grupo es su propio control<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">10</span></a>&#58;<elsevierMultimedia ident="eq0005"></elsevierMultimedia></p></span><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0080">Obtenci&#243;n de las c&#233;lulas estromales derivadas del tejido adiposo</span><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las muestras se obtuvieron al comienzo de la cirug&#237;a&#46; Se transportaron en contenedores a 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C y se almacenaron a la misma temperatura&#44; para ser procesadas dentro de las 6<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h de ser extra&#237;das de los pacientes&#46; Se utilizaron 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de grasa fresca y se lavaron con una soluci&#243;n tamp&#243;n fosfato &#40;PBS&#41; a temperatura ambiente para remover eritrocitos y leucocitos&#46;</p><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se rescat&#243; el tejido adiposo sobrenadante y se resuspendi&#243; en un volumen equivalente de medio DMEM&#47;F12 &#40;Gibco&#44; EE&#46;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>UU&#46;&#41; con colagenasa tipo<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleSmallCaps">i</span> 0&#44;1&#37; &#40;Gibco&#44; EE&#46;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>UU&#46;&#41;&#46; La soluci&#243;n se incub&#243; en un ba&#241;o a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#44; con agitaci&#243;n continua durante 90<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min Luego de esto&#44; la soluci&#243;n se centrifug&#243; a 600<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>G por 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min a temperatura ambiente para separar los adipocitos maduros de la fracci&#243;n vascular estromal &#40;FVE&#41;&#46; Se aspir&#243; el sobrenadante&#44; quedando el <span class="elsevierStyleItalic">pellet</span> que corresponde a la FVE que contiene las CEDA&#46; La FVE se resuspendi&#243; en el medio de cultivo &#40;DMEM&#47;F12 &#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>10&#37;SFB &#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>gentamicina &#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ciprofloxacino &#91;0&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg&#47;100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml&#93; &#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>voriconazol &#91;50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l&#47;100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml&#93;&#41; y se sembr&#243; en placas de cultivo de 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm de di&#225;metro para expansi&#243;n celular&#46; Todo fue realizado en condiciones de esterilidad y con campanas de bioseguridad clase<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleSmallCaps">ii</span> del Laboratorio de Terapia Celular del Programa de Farmacolog&#237;a Molecular y Cl&#237;nica&#44; Instituto de Ciencias Biom&#233;dicas de la Facultad de Medicina&#44; Universidad de Chile&#46;</p><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se expandieron las c&#233;lulas realizando subcultivos &#40;1&#58;2&#41; cada vez que se alcanzaba el 80&#37; de confluencia&#46;</p></span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0085">Caracterizaci&#243;n de las c&#233;lulas estromales derivadas del tejido adiposo</span><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se realiz&#243; un panel de inmunofenotipificaci&#243;n mediante citometr&#237;a de flujo en 3 muestras de CEDA de nuestro laboratorio&#44; en el subcultivo n&#250;mero<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>3&#46; Se consideraron 20&#46;000 eventos por marcador&#44; como control de calidad correspondiente a la utilizaci&#243;n de estas c&#233;lulas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0130"><span class="elsevierStyleSup">2&#44;11</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0090">Proceso de criopreservaci&#243;n</span><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La criopreservaci&#243;n se llev&#243; a cabo entre los subcultivos 3-4 &#40;dentro de la fase exponencial de crecimiento&#41;&#46; Una vez alcanzada la cantidad celular necesaria &#40;4&#44;5 a 5 millones de c&#233;lulas&#44; aproximadamente&#41;&#44; se liberaron las c&#233;lulas de la misma forma que para un subcultivo&#46; Luego se realizaron recuentos con Trypan Blue en c&#225;mara de Neubauer&#44; rescat&#225;ndose una muestra de 0&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#215;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>106<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>c&#233;lulas&#47;ml para criopreservarla en un medio veh&#237;culo &#40;DMEM&#47;F12 con rojo fenol&#44; Gibco&#44; EE&#46;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>UU&#46;&#41; con diferentes combinaciones de agentes criopreservantes&#46; El control se realiz&#243; con medio veh&#237;culo sin CP&#46; Las combinaciones de agentes criopreservantes utilizadas fueron las siguientes&#58;<ul class="elsevierStyleList" id="lis0005"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0005"><span class="elsevierStyleLabel">1&#41;</span><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">DMSO 10&#37; &#40;1&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M&#41; &#40;medio habitual&#41;&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0010"><span class="elsevierStyleLabel">2&#41;</span><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">DMSO 10&#37; &#40;1&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>trehalosa 7&#44;6&#37; &#40;0&#44;2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M&#41;&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0015"><span class="elsevierStyleLabel">3&#41;</span><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall">DMSO 10&#37; &#40;1&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>alb&#250;mina humana 10&#37;&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0020"><span class="elsevierStyleLabel">4&#41;</span><p id="par0090" class="elsevierStylePara elsevierViewall">DMSO 10&#37; &#40;1&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>trehalosa 7&#44;6&#37; &#40;0&#44;2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>alb&#250;mina humana 10&#37;&#46;</p></li></ul></p><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se utiliz&#243; una t&#233;cnica para llevar los criotubos a &#8722;80<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C de manera semicontrolada&#46; Para este fin&#44; se utiliz&#243; un recept&#225;culo con isopropil alcohol que produce una disminuci&#243;n de la temperatura a una velocidad aproximada de 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#47;min &#40;Thermo Scientific Nalgene Mr&#46; Frosty&#41;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0180"><span class="elsevierStyleSup">12&#44;13</span></a>&#46; Al d&#237;a siguiente los criotubos se cambiaron a nitr&#243;geno l&#237;quido para ser almacenados hasta su utilizaci&#243;n&#46; A las 4 semanas se descongelaron en un ba&#241;o a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C &#40;1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#41; y se evalu&#243; la viabilidad&#46;</p></span><span id="sec0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0095">Evaluaci&#243;n de la viabilidad</span><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se determin&#243; la viabilidad de las CEDA con citometr&#237;a de flujo cuantitativa antes y despu&#233;s de un ciclo de criopreservaci&#243;n&#46; Luego de 4 semanas de criopreservaci&#243;n se descongelan los criotubos en un ba&#241;o a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C &#40;1 a 1&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#41;&#46; Una vez descongelados&#44; se lavan las c&#233;lulas de CP con 3<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de medio completo&#44; se homogeneiza la muestra y se traspasa a tubos de 15<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml para centrifugar a 2&#46;000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>rpm por 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min Se descarta el sobrenadante&#44; se agrega 2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de medio completo y se resuspende&#46; Se realiza conteo en c&#225;mara de Neubauer para utilizar la cantidad de c&#233;lulas necesarias para cada ensayo&#46;</p><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Luego se cargaron 3 tubos para citometr&#237;a con 200<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de suspensi&#243;n celular &#40;0&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#215;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>10<span class="elsevierStyleSup">6</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>c&#233;lulas&#47;ml&#41; por cada condici&#243;n y paciente&#46; Como controles se utilizaron c&#233;lulas necr&#243;ticas inducidas por metanol<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0190"><span class="elsevierStyleSup">14</span></a> &#40;un tubo&#41; y c&#233;lulas vivas no criopreservadas &#40;un tubo&#41; de cada paciente&#46; Se utiliz&#243; el marcador ioduro de propidio &#40;IP&#41;&#44; mezclando la suspensi&#243;n celular con 2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;l de IP antes de la adquisici&#243;n de datos por el cit&#243;metro&#46; La tinci&#243;n celular con IP indica que se ha alterado la integridad de la membrana plasm&#225;tica&#44; por lo que su marcaci&#243;n con el colorante indica que las c&#233;lulas se encuentran necr&#243;ticas&#44; distingui&#233;ndose as&#237; de las c&#233;lulas vivas&#46; La citometr&#237;a&#44; por lo tanto&#44; mostrar&#225; 2 poblaciones celulares&#58; vivas &#40;IP-negativas&#41; y necr&#243;ticas &#40;IP-positivas&#41;&#46; Las c&#233;lulas se analizaron mediante un sistema de citometr&#237;a de flujo Becton-Dickinson&#44; considerando 40&#46;000 eventos como significativos&#46;</p><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La tasa de viabilidad obtenida mediante citometr&#237;a de flujo con IP se calcul&#243; mediante la siguiente f&#243;rmula&#58;<elsevierMultimedia ident="eq0010"></elsevierMultimedia></p></span><span id="sec0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0100">An&#225;lisis estad&#237;stico</span><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Todos los datos se expresaron como promedio &#177;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>desviaci&#243;n est&#225;ndar &#40;promedio &#177;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>DS&#41;&#46; El an&#225;lisis estad&#237;stico se realiz&#243; comparando las diferentes condiciones de criopreservaci&#243;n entre s&#237;&#44; utilizando el test de ANOVA para comparaciones m&#250;ltiples&#44; seguido de un test <span class="elsevierStyleItalic">post hoc</span> no param&#233;trico &#40;Tukey&#39;s Test&#41;&#44; utilizando el programa inerSTAT 1&#46;3&#46; Se consider&#243; un valor de p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;05 como estad&#237;sticamente significativo&#46;</p></span></span><span id="sec0045" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0105">Resultados</span><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se obtuvieron c&#233;lulas estromales derivadas del tejido adiposo lipoaspirado en los 5 pacientes que cumplieron con los criterios de inclusi&#243;n&#46; El panel de inmunofenotipificaci&#243;n fue compatible con CEDA &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia><p id="par0125" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se midi&#243; la viabilidad de las CEDA de cada paciente mediante citometr&#237;a de flujo con IP en cada una de las condiciones estudiadas&#46; En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">figura 1</a> se observan ejemplos de histogramas obtenidos del control negativo &#40;c&#233;lulas necr&#243;ticas&#41;&#44; control positivo &#40;c&#233;lulas vivas&#41;&#44; precriopreservaci&#243;n y poscriopreservaci&#243;n&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia><p id="par0130" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El promedio de las tasas de viabilidad y mortalidad obtenidas con IP en las diferentes condiciones se observan en la <a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#fig0010">figuras 2 y 3</a>&#44; respectivamente&#46; Las tasas de viabilidad obtenidas en las diferentes condiciones fueron&#44; respectivamente&#58; 1&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>61&#44;88&#37;&#59; 2&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>58&#44;05&#37;&#59; 3&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>66&#44;09&#37;&#44; y 4&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>68&#44;08&#37;&#46; Las tasas de mortalidad obtenidas en las diferentes condiciones fueron&#44; respectivamente&#58; 1&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>32&#44;62&#37;&#59; 2&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>35&#44;76&#37;&#59; 3&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>29&#44;15&#37;&#44; y 4&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>26&#44;52&#37;&#46; Al analizar las tasas de viabilidad y mortalidad en cada condici&#243;n de CP y compar&#225;ndolas entre s&#237; mediante ANOVA&#44; se concluye que ning&#250;n medio tiene mejor rendimiento&#44; ya que no hay diferencias significativas entre ellos &#40;p<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#61;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0&#44;50394&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="fig0015"></elsevierMultimedia><p id="par0135" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El an&#225;lisis de la viabilidad mediante citometr&#237;a de flujo con IP&#44; previo y posterior a un ciclo de criopreservaci&#243;n&#44; sugiere que ninguna condici&#243;n estudiada es estad&#237;sticamente superior a las dem&#225;s en cuanto a rendimiento&#46;</p></span><span id="sec0050" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0110">Discusi&#243;n</span><p id="par0140" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El medio ideal para criopreservar CEDA es aquel que sea no t&#243;xico y que logre una mayor viabilidad celular sin disminuir el potencial de diferenciaci&#243;n&#46; Est&#225; descrito que la combinaci&#243;n de CP en el medio de criopreservaci&#243;n podr&#237;a lograr mayores tasas de vitalidad<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0195"><span class="elsevierStyleSup">15</span></a>&#46;</p><p id="par0145" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La optimizaci&#243;n los resultados en el proceso de criopreservaci&#243;n de tejido adiposo<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0200"><span class="elsevierStyleSup">16&#44;17</span></a> y CEDA al agregar trehalosa no se vio reflejada en nuestros resultados&#46; Es posible que el efecto sin&#233;rgico descrito para la trehalosa no se observe a concentraciones de DMSO 10&#37;&#46; De Rosa et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a>&#44; al evaluar el efecto de diferentes CP sobre la viabilidad de CEDA&#44; concluyeron que el efecto &#243;ptimo criopreservante se logra con DMSO 4&#37;&#44; trehalosa 6&#37; y suero fetal bovino &#40;SFB&#41; 90&#37;&#46; Otro estudio&#44; recientemente publicado demuestra que se obtienen mayores tasas de viabilidad al utilizar DMSO 5&#37; comparado con trehalosa 0&#44;25<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M&#44; y que no se obtienen mayores tasas al combinar DMSO 5&#37; con diferentes concentraciones SFB&#44; concluyendo que el CP ideal es DMSO 5&#37;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160"><span class="elsevierStyleSup">8</span></a>&#46; En nuestro caso&#44; la raz&#243;n de no lograr mejores tasas de vitalidad al combinar trehalosa con DMSO 10&#37; probablemente radica en el hecho que el efecto final de ambos CP de disminuir la formaci&#243;n de hielo intracelular mediante distintos mecanismos es redundante&#46;</p><p id="par0150" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Una forma de optimizar la viabilidad posterior a un ciclo de criopreservaci&#243;n es agregando SFB a la soluci&#243;n de CP&#46; Se han logrado tasas de viabilidad mayores al 80&#37; cuando se usa SFB a concentraciones del 90&#37;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a> o del 95&#37;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0215"><span class="elsevierStyleSup">19</span></a>&#44; en asociaci&#243;n a DMSO 4&#37; &#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>trehalosa 6&#37; o DMSO 5&#37;&#44; respectivamente&#46; El problema de utilizar SFB radica en la p&#233;rdida del principio alog&#233;nico&#44; con el consiguiente riesgo de transmisi&#243;n de enfermedades virales o por priones y la ocurrencia de rechazo inmunog&#233;nico&#46;</p><p id="par0155" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Estudios recientes han visto que al reemplazar el SFB por plasma humano aut&#243;geno &#40;HP&#41; en el protocolo de criopreservaci&#243;n &#40;DMSO 5&#37; &#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>HP 95&#37;&#41; se logran tasas similares de viabilidad&#44; todas mayores al 80&#37;&#44; analizadas con Trypan Blue<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0215"><span class="elsevierStyleSup">19</span></a>&#46; El plasma humano aut&#243;geno tiene la desventaja de ser un medio no definido en cuanto a su composici&#243;n y ser variable inter e intrapersonal&#44; con respecto al sexo&#44; edad&#44; estados patol&#243;gicos etc&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0220"><span class="elsevierStyleSup">20</span></a>&#46; El uso de plasma aut&#243;geno ser&#237;a intercambiable por alb&#250;mina humana 5&#37; como criopreservantes en asociaci&#243;n a DMSO 7&#44;5&#37;&#44; en c&#233;lulas madres derivadas de sangre perif&#233;rica<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0225"><span class="elsevierStyleSup">21</span></a>&#46; Esto nos hace suponer que ellos se aproximar&#237;an al medio ideal definido y libre de prote&#237;na animal&#46; En nuestros resultados existe una mayor tasa de viabilidad poscriopreservaci&#243;n al agregar alb&#250;mina humana que&#44; si bien no es significativa&#44; muestra una tendencia que podr&#237;a explicarse por el efecto de la alb&#250;mina mediante otro mecanismo&#44; probablemente mejorando el control del pH<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">22</span></a>&#46;</p><p id="par0160" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La menor tasa de viabilidad a la descrita previamente&#44; posterior a 4 semanas de criopreservaci&#243;n&#44; no puede ser explicada por el tiempo de almacenamiento de las CEDA en nitr&#243;geno l&#237;quido &#40;aproximadamente &#8722;196<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#41;&#46; Se ha observado que estas c&#233;lulas mantienen tasas de viabilidad &#62;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>80&#37; luego de 1 y 6<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>meses&#44; cayendo solo al 70&#37; al a&#241;o de criopreservaci&#243;n<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a>&#46; Sin embargo&#44; estas mantienen su capacidad de diferenciaci&#243;n y el fenotipo de los marcadores de superficie&#46; Otro factor que podr&#237;a haber influido en las tasas de viabilidad poscriopreservaci&#243;n obtenidas es la velocidad a la cual las c&#233;lulas son congeladas&#46; La velocidad controlada &#40;1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#47;min&#41; tiene mejores resultado en la criopreservaci&#243;n de c&#233;lulas mam&#237;feras<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0235"><span class="elsevierStyleSup">23</span></a>&#46; El descenso controlado de la temperatura permite que se forme hielo extracelular mientras el agua <span class="elsevierStyleItalic">supercooled</span> &#40;proceso mediante el cual se disminuye la temperatura de un l&#237;quido o gas bajo su punto de congelaci&#243;n sin llevarlo a estado s&#243;lido&#41; se transporta fuera de la c&#233;lula&#44; logrando as&#237; la vitrificaci&#243;n del medio intracelular&#46; A velocidades m&#225;s lentas se genera da&#241;o&#44; producto de un aumento de la concentraci&#243;n de solutos intracelulares a medida que el agua sale de la c&#233;lula llegando a la deshidrataci&#243;n&#46; Por el contrario&#44; a velocidades m&#225;s r&#225;pidas el agua no alcanza a salir de la c&#233;lula y se genera hielo intracelular que produce la rotura de la membrana<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0235"><span class="elsevierStyleSup">23</span></a>&#46; La utilizaci&#243;n de un sistema semicontrolado o no autom&#225;tico podr&#237;a exponer a las c&#233;lulas a velocidades mayores o menores a la ideal durante el proceso de congelaci&#243;n&#44; provocando una disminuci&#243;n en las tasas de viabilidad cuando se compara con sistemas automatizados de disminuci&#243;n de la temperatura&#46;</p><p id="par0165" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Si bien nuestro rendimiento en cuanto a viabilidad poscriopreservaci&#243;n es inferior al reportado por otros autores<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0190"><span class="elsevierStyleSup">14&#44;15</span></a>&#44; la evaluaci&#243;n de estas tasas habitualmente se realiza mediante una t&#233;cnica poco precisa&#44; como es la exclusi&#243;n con Trypan Blue<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0215"><span class="elsevierStyleSup">19&#44;24</span></a>&#46; Se ha descrito que esta t&#233;cnica tiende a sobreestimar la viabilidad&#59; por ejemplo&#44; un 90&#37; de c&#233;lulas descongeladas se excluyen con esta prueba &#40;viables&#41;&#46; Sin embargo&#44; solo un 60&#37; demuestra ser capaz de adherirse a sustrato a las 24<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0240"><span class="elsevierStyleSup">24</span></a>&#46; La medici&#243;n de la viabilidad utilizando una t&#233;cnica m&#225;s precisa como IP por citometr&#237;a de flujo es una estrategia m&#225;s adecuada para enfrentar esta interrogante&#44; ya que mide la viabilidad evaluando la integridad de la membrana plasm&#225;tica y nuclear&#44; que nos informa la etapa final de la muerte celular&#44; por lo que c&#233;lulas inviables no impactan la mortalidad&#46;</p><p id="par0170" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Es as&#237; como podemos afirmar que la criopreservaci&#243;n de las CEDA en un medio que combine DMEM&#47;F12 con DMSO 10&#37; &#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>trehalosa 0&#44;2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M &#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>alb&#250;mina humana 10&#37; no resulta en una tasa de recuperaci&#243;n de c&#233;lulas viables significativamente mayor que las congeladas solo con DMSO 10&#37;&#44; en lo cual pueden influir diversos factores&#44; previamente discutidos&#46;</p><p id="par0175" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Llama la atenci&#243;n que aun utilizando diversas combinaciones de CP se obtuvieron tasas de vitalidad relativamente menores en todas las condiciones &#40;60-70&#37;&#41; comparado a lo descrito en la literatura &#40;alrededor de 85-95&#37;&#41;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0190"><span class="elsevierStyleSup">14&#44;15&#44;19</span></a>&#46; El desaf&#237;o ahora es intentar esclarecer las variables que podr&#237;an haber influido en este proceso mediante estudios de criopreservaci&#243;n con un sistema de descenso automatizado de la temperatura&#44; a trav&#233;s de la utilizaci&#243;n de diferentes combinaciones de CP&#44; ya sea disminuyendo la concentraci&#243;n de DMSO para evitar mecanismos redundantes o incorporando otros CP como la sericina&#44; que han mostrado tasas de viabilidad de CEDA alentadoras poscriopreservaci&#243;n<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0240"><span class="elsevierStyleSup">24</span></a>&#46; Adem&#225;s ser&#237;a interesante conocer las caracter&#237;sticas de las c&#233;lulas descongeladas en cuanto a su capacidad de adherirse y expandirse en la placa&#44; formar colonias y diferenciarse en diferentes tipos celulares&#46;</p></span><span id="sec0055" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0115">Conclusiones</span><p id="par0180" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La medici&#243;n de la viabilidad de CEDA posterior a un ciclo de criopreservaci&#243;n mediante el an&#225;lisis a nivel estructural del IP por citometr&#237;a de flujo nos hace concluir que ninguna condici&#243;n estudiada es superior a las dem&#225;s en cuanto a rendimiento&#46; Es as&#237; como podemos afirmar que la criopreservaci&#243;n de las CEDA en un medio que combine DMEM&#47;F12 con DMSO 10&#37; &#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>trehalosa 0&#44;2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M &#43;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>alb&#250;mina humana 10&#37; no logra una tasa de recuperaci&#243;n de c&#233;lulas vitales significativamente mayor que las congeladas solo con DMSO 10&#37;&#46;</p></span><span id="sec0060" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0120">Conflicto de intereses</span><p id="par0185" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran no tener ning&#250;n conflicto de intereses&#46;</p></span></span>"
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                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Criterio IFATS-ISCT&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">IgG1k- FITC&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">3&#44;76&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">1&#44;1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">2&#44;58&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">NA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">1&#44;63&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">2&#44;46&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">IgG1k-AF488&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">3&#44;42&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">0&#44;14&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">3&#44;24&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">99&#44;8&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">100&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">¿ 80&#37; Positivo&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">CD44-FITC&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">CD73-PE&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">99&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">99&#44;8&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">CD90-FITC&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">99&#44;5&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">CD105-PE&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="char" valign="top">99&#44;2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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Información del artículo

ISSN: 03793893
Idioma original: Español

DOI:10.1016/j.rchic.2016.03.007

Datos actualizados diariamente

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2020 Abril	12	11	23
2020 Marzo	14	2	16
2020 Febrero	12	2	14
2020 Enero	13	3	16
2019 Diciembre	30	10	40
2019 Noviembre	11	15	26
2019 Octubre	17	3	20
2019 Septiembre	25	2	27
2019 Agosto	15	2	17
2019 Julio	18	1	19
2019 Junio	21	5	26
2019 Mayo	18	5	23
2019 Abril	31	4	35
2019 Marzo	11	8	19
2019 Febrero	12	5	17
2019 Enero	6	2	8
2018 Diciembre	8	4	12
2018 Noviembre	35	9	44
2018 Octubre	21	10	31
2018 Septiembre	9	8	17
2018 Agosto	8	3	11
2018 Julio	15	4	19
2018 Junio	14	7	21
2018 Mayo	13	13	26
2018 Abril	15	3	18
2018 Marzo	10	2	12
2018 Febrero	7	1	8
2018 Enero	10	0	10
2017 Diciembre	12	3	15
2017 Noviembre	7	7	14
2017 Octubre	11	3	14
2017 Septiembre	9	7	16
2017 Agosto	5	3	8
2017 Julio	13	3	16
2017 Junio	17	17	34
2017 Mayo	28	20	48
2017 Abril	14	9	23
2017 Marzo	13	62	75
2017 Febrero	78	17	95
2017 Enero	21	5	26
2016 Diciembre	36	2	38
2016 Noviembre	46	6	52
2016 Octubre	41	10	51
2016 Septiembre	38	8	46
2016 Agosto	44	12	56
2016 Julio	46	6	52
2016 Junio	19	12	31

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