Recomendaciones para el uso clínico del microarray genómico en diagnóstico prenatal

Introducción

El «microarray genómico», también llamado «microarray cromosómico», «cariotipo molecular» o simplemente «array», es un método de análisis genético basado en una hibridación sobre una matriz de sondas de ADN que interrogan varios loci distribuidos a lo largo del genoma. Tiene una resolución de entre 10 y 1.000 veces superior a la del cariotipo convencional y un tiempo de respuesta más corto, ya que habitualmente no requiere cultivo celular. Detecta pérdidas y ganancias de material genético, llamadas «variantes del número del copias» (CNV [copy number variations]), pero no detecta ni las reorganizaciones equilibradas (a diferencia del cariotipo), ni las alteraciones de secuencia o mutaciones (al igual que el cariotipo).

En función de su relevancia clínica, las CNV se clasifican en 3 tipos: benignas, patogénicas o inciertas (VOUS o VUS [variantes of unknown significance]). Se considera que una variante del número de copia es una VOUS cuando no hay suficiente evidencia en la literatura (o en las bases de datos) ni de su presencia en población general sana, ni de su asociación con fenotipos anómalos. El hecho de que algunas variantes tengan una penetrancia incompleta hace más difícil demostrar su patogenicidad.

En diagnóstico prenatal, el microarray ha demostrado una capacidad de detección de anomalías superior a la del cariotipo convencional, en cualquiera de las indicaciones de prueba invasiva. En caso de malformaciones fetales, detecta un 6-9% de anomalías adicionales al cariotipo y en otras indicaciones, o en ausencia de indicación, entre 1-1,5% addicional^1–5. Estos hallazgos adicionales del microarray son causantes de síndromes de microdeleción o microduplicación y no son detectables con el cariotipo. Hay síndromes clásicos, como la microdeleción 22q11 o síndrome de DiGeorge/velocardiofacial, la microdeleción 7q11.23 o síndrome de Williams, y las hay descritas más recientemente como son las microdeleciones y microduplicacions 1q21.1, 16p11.2, etc… En Pediatría, el microarray se ha convertido desde 2010 en la técnica de análisis genético de primera línea en el estudio de la discapacidad intelectual, de las malformaciones mayores o menores y del trastorno del espectro autista⁶. En diagnóstico prenatal hay quien también sugiere la sustitución del cariotipo por microarray y quien no descarta su oferta universal a las gestantes².

Metodología

Tipos de microarray y sondas

Hay dos tecnologías de microarrays:

• -

  Array-CGH: se realiza una hibridación genómica competitiva (CGH) entre un ADN fetal y un ADN control, en una matriz de sondas de ADN. Las sondas pueden ser de gran tamaño BAC (bacterial artificial chromosomes) o de menor tamaño (oligonucleótidos).

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  SNP-array: compara la intensidad de hibridación del ADN fetal con una señal control previamente determinado, en una matriz de SNP (single nucleotid polymorphisms).

Tipos de diseño de array

Hay 3 diseños diferenciados de microarray en función de la disposición de las sondas de ADN:

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  Microarrays dirigidos (targeted): todas las sondas están dirigidas a regiones causantes de trastornos conocidos.

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  Microarrays de genoma completo (WGA [Whole Genome Array]): tienen una distribución uniforme de las sondas de ADN en todas las regiones.

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  Microarrays mixtos: combinan sondas distribuidas a lo largo de todo el genoma con una separación uniforme (backbone coverage), con una mayor densidad de sondas en las regiones causantes de trastornos conocidos. Son los microarrays más utilizados en diagnóstico prenatal.

Resolución y filtrado

La resolución de los microarrays depende del número de sondas, su tamaño y sobre todo de su separación. En diagnóstico prenatal se recomienda una resolución media no inferior a 0,5Mb-1Mb^7,8. Los arrays-CGH de oligonucleótidos ofrecen una resolución más alta que los de BAC, pero son más exigentes en cuanto a calidad y cantidad de ADN de la muestra. La dificultad de la extracción de ADN a partir de líquido amniótico no cultivado ha propiciado la difusión de los microarrays de BAC, con una resolución media mínima 1 Mb. De todos modos, este tipo de microarrays están siendo progresivamente sustituidos por los microarrays de oligonucleótidos, con una resolución media mínima 0,5 Mb⁷.

En diagnóstico prenatal se prefiere que los microarrays no sean de muy alta resolución para minimizar la detección de VOUS. Otra vía de obviar este problema es utilizar un microarray de alta resolución y filtrar posteriormente los resultados, seleccionando solo las CNV patogénicas y las de mayor tamaño.

Muestras

Cualquier muestra fetal con suficiente contenido de ADN es válida para realizar un microarray, como las vellosidades coriales, el líquido amniótico, la sangre u otro fluido o tejido fetal. En paralelo a la extracción del ADN, es recomendable establecer un cultivo celular de rescate, que puede ser útil para extraer más ADN, realizar un cariotipo o para otras técnicas de confirmación diagnóstica ulteriores. Por este motivo se aconseja la extracción de 15-20 cc de líquido amniótico o 20-40 mg. de vellosidad corial.

Si no se emplean SNP-arrays, es conveniente realizar una QF-PCR (Quantitative Fluorescence Polymerase Chain Reaction) previa para descartar la contaminación materna de las muestras, determinar el sexo fetal (para seleccionar el sexo del ADN control) y diagnosticar las aneuploidías más frecuentes y las triploidías.

En caso de una interrupción legal de la gestación (ILE), hay que asegurar la toma de una muestra fetal (líquido amniótico, tejido o sangre) para futuros estudios en ADN fetal y poder disponer de células fijadas o extensiones aptas para FISH (fluorescent in situ hybridization). En caso de que la decisión de ILE no dependa del resultado del microarray, es factible diferir la prueba hasta después del estudio de la necropsia, ya que puede aportar datos que indiquen que otra prueba es más adecuada.

En caso de pérdida gestacional, tanto en abortos espontáneos como en muertes anteparto, los microarrays presentan la ventaja de no requerir cultivo celular y de esta manera se minimiza el riesgo de fracaso técnico.

Indicaciones del microarray

Son indicaciones bien establecidas del microarray:

• 1.

  Identificación de un defecto congénito mayor o hallazgos ecográficos sugerentes de defectos congénitos menores⁹. En caso de cualquier malformación la probabilidad de un hallazgo relacionado con el fenotipo es de entre un 6 y un 9%¹, superior en el microarray que en el cariotipo. En caso de cardiopatía este porcentaje aumenta hasta el 12%¹⁰.

• 2.

  Restricción del crecimiento intrauterino (RCIU/CIR) precoz (< 24 semanas) y severo (< percentil 3).

• 3.

  Translucencia nucal aumentada (> 3,5 mm o percentil 99). Presenta una probabilidad de un 5% de hallazgos adicionales al cariotipo¹¹.

• 4.

  Presencia de una deleción o duplicación familiar críptica (no detectable por el cariotipo), con riesgo de transmisión y penetrancia significativas, así como de suficiente relevancia clínica para dar opción a ILE.

• 5.

  Hallazgo de una translocación o inversión «de novo» aparentemente equilibrada o de un cromosoma marcador (especialmente del tipo anillo y marcador no satelizado) en el cariotipo fetal, ya que no son fácilmente identificables por otras técnicas.

• 6.

  Muerte fetal intrauterina y aborto de segundo trimestre, ya que el microarray tiene más éxito que el cultivo y mayor capacidad de detección que el cariotipo.

• 7.

  Antecedente familiar de reordenamiento cromosómico (translocación parental recíproca o inversión pericéntrica) en equilibrio, para detectar segregaciones desequilibradas potencialmente no visibles por el cariotipo.

  Otros motivos:

• 8.

  Deleción o duplicación críptica (no detectable por cariotipo y por tanto detectada por FISH/microarray) «de novo» en un descendiente previo. Aunque no esté demostrado un incremento en el riesgo de recurrencia, siempre existe la posibilidad de un mosaico germinal en uno de los progenitores. Se podría recurrir también al FISH o MLPA (multiplex ligation-dependent probe amplification) dirigidos.

• 9.

  En cualquier indicación de técnica invasiva (y sobre todo en riesgo bajo de aneuploidía) para asegurar la mayor capacidad de detección posible.

Resultados a informar

El contenido de los informes de los microarrays debe incluir siempre

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  Las especificaciones técnicas del microarray utilizado (tipo de microarray, tipo y distribución de las sondas y resolución media alcanzada en las regiones interrogadas).

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  Los criterios de inclusión o exclusión de los diferentes tipos de CNV (filtrado).

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  Las limitaciones de la técnica: que son la imposibilidad de detectar reordenamientos equilibrados, las triploidías XXX (no detectables por los arrays-CGH, pero sí por los SNP-arrays), mosaicismos bajos (<20%) y mosaicos que resulten en una dosis genómica compensada (mosaico 45, X/47, XXX).

En caso de CNV patogénica o probablemente patogénica, en el informe debe constar

• -

  Descripción detallada de las consecuencias fenotípicas descritas citando las referencias bibliográficas y las bases de datos consultadas.

• -

  Porcentaje de penetrancia conocida, variabilidad y gravedad de los fenotipos asociados en las de penetrancia incompleta.

• -

  La indicación de estudios familiares o de pruebas de confirmación (cariotipo, MLPA, FISH, microarray …).

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  Las CNV patogénicas de penetrancia incompleta, predictivas, de estado de portador sano o presintomáticas solo deben ser incluidas cuando tengan suficiente penetrancia y gravedad para que puedan justificar una ILE o cuando su información haya sido solo citada en el consentimiento informado previo.

Las CNV de significado incierto o VOUS (que de entrada no sean probablemente patogénicas)

Solo se incluirán en el informe cuando el estudio de segregación familiar pueda facilitar el reconocimiento de su carácter probablemente patogénico. La decisión de estudiar una VOUS en los progenitores durante el embarazo se basará en los siguientes criterios de probable patogenicidad: tamaño, contenido génico, funciones conocidas o previsibles de estos genes y concordancia con el fenotipo observado.

No es necesario incluir lasCNV benignasen los informes.

Asesoramiento genético

Como en cualquier prueba genética, es imprescindible el acto de asesoramiento genético previo y posterior a la realización del microarray. El asesoramiento debe ser ofrecido por parte del asesor genético, el genetista clínico o el obstetra, de una manera no directiva.

Asesoramiento pretest

Hay que comentar los siguientes puntos:

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  Tanto el microarray como el cariotipo son incapaces de detectar mutaciones puntuales del ADN.

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  El microarray tiene más capacidad de detección que el cariotipo, pero no detecta alteraciones equilibradas, triploidías XXX (arrays-CGH) o mosaicismos de bajo grado o compensados.

• -

  Solo las CNV patogénicas (o probablemente patogénicas) con suficiente repercusión para la salud actual o futura del feto deben ser consideradas en una decisión de ILE.

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  Se pueden detectar enfermedades de gravedad muy variable y difíciles de predecir.

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  Hay CNV patogénicas de susceptibilidad o con penetrancia incompleta, que implican solo un riesgo de afectación.

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  Se pueden identificar CNV que causen enfermedades de presentación tardía y si son heredadas de uno de los progenitores, pueden aparecer antes en el progenitor.

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  Se pueden detectar estados de portador sano para algunas enfermedades. En general no se informan prenatalmente, pero idealmente se debería articular un mecanismo para informar al individuo cuando llegue a la edad reproductiva.

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  Como norma general, las CNV de significado incierto (VOUS) que no sean probablemente patogénicas no serán informadas en la etapa prenatal.

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  El uso de microarrays puede identificar que las relaciones biológicas reales no coincidan con las reportadas por la pareja (falsas paternidades o incestos) e informar sobre grados de consanguinidad elevados.

Asesoramiento postest

Hay que comentar los diversos hallazgos:

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  En las CNV patogénicas (o VOUS probablemente patogénicas) deberán abordar los conceptos de penetrancia y variabilidad en la expresión.

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  En las CNV patogénicas (y VOUS con alguna sospecha de patogenicidad) que requieran estudios familiares para su mejor clasificación, se deberán tomar muestras parentales si no se han tomado previamente.

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  Se deben comentar los posibles tratamientos y medidas de prevención destinadas a modificar el pronóstico a largo plazo, en caso de que existan.

Asesoramiento post-ILE/nacimiento

El asesoramiento que se realiza post-ILE o posnacimiento del feto es el momento más adecuado para completar el diagnóstico multidisciplinario, comentar los riesgos futuros y las opciones reproductivas disponibles en una reflexión conjunta con la pareja.

Consentimientos

Se recomienda que haya un consentimiento específico de las pruebas genéticas adicional al consentimiento de la prueba invasiva. Muchos de los puntos que forman parte del asesoramiento genético pretest deberán ser incluidos en el documento de información y obtener el consentimiento escrito.

Aprobado en abril de 2015.