La aplicación de metabolitos antimicrobianos biosintetizados por especies de Bacillus es una alternativa potencial para controlar Phytophthora capsici (P. capsici) en hortalizas y podría evitar el uso de productos químicos con acción oomiceticida. El objetivo de este estudio fue evaluar el impacto de la adición al medio de cultivo de distintos agentes (ácido glutámico, hierro, celulosa, quitina y células inactivas de Colletotrichum spp.) sobre la biosíntesis de lipopéptidos en Bacillus amyloliquefaciens KX953161.1 y examinar la capacidad oomiceticida de dichos compuestos in vitro sobre las zoosporas de P. capsici. Los lipopéptidos identificados y cuantificados por cromatografía en capa fina de alta resolución (HPTLC) en los extractos crudos fueron fengicina y surfactina. El cultivo bacteriano adicionado con células inactivas de Colletotrichum spp. demostró la mayor biosíntesis de lipopéptidos: 1.847,02 ± 11,8 μg/mL de fengicina y 2.563,45 ± 18,4 μg/mL de surfactina. Los tratamientos con menor producción de estos lipopéptidos fueron aquellos a los que se añadió hierro (608,05 ± 22,6 μg/mL de fengicina y 903,74 ± 22,1 μg/mL de surfactina) o celulosa (563,31 ± 11,9 y 936,96 ± 41,1 μg/mL, igual orden). El extracto con los lipopéptidos presentó una inhibición del 100% en la germinación de zoosporas de P. capsici, se observó enquistamiento, malformaciones en el tubo germinal y degradación celular. Se concluye que los lipopéptidos producidos por B. amyloliquefaciens KX953161.1 podrían contribuir al control de P. capsici, sin embargo, se requieren más estudios a fin de elucidar el modo de acción biológica de estos compuestos y optimizar el perfil de producción y el rendimiento.
A potential alternative to the use of chemical products with oomyceticidal action for the control of Phytophthora capsici in vegetables is the use of antimicrobial metabolites, biosynthesized in Bacillus species. The objective of this study was to induce the biosynthesis of lipopeptides in Bacillus amyloliquefaciens KX953161.1 by using glutamic acid, iron, cellulose, chitin, or inactive Colletotrichum spp. cells. The in vitro oomyceticidal effect of the bacterial lipopeptides on zoospores of Phytophthora capsici was evaluated. The lipopeptides identified and quantified in the crude extracts by high performance thin layer chromatography (HPTLC) were fengycin and surfactin. The bacterial culture with inactive fungal cells yielded the greatest biosynthesis of lipopeptides, at 1847.02± 11.8 and 2563.45± 18.4 μg/ml of fengycin and surfactin, respectively and the treatments that obtained lower production of these lipopeptides, were those to which iron and cellulose were added with 608.05 ± 22.6 and 903.74± 22.1; 563.31± 11.9 and 936.96± 41.1 μg/ml for fengicin and surfactin, respectively. The lipopeptide extracted showed 100% germination inhibition on zoospores of P. capsici, revealing encystment, malformations in the germ tube and cellular degradation. Lipopeptides have the potential to control P. capsici; however, the biosynthesis of these lipopeptides requires further study to determine their biological mode of action and optimize lipopeptide performance and profile.
La marchitez del chile causada por Phytophthora capsici (P. capsici) Leonian es de gran importancia debido a que provoca la muerte y pérdidas significativas a nivel mundial en los cultivos de solanáceas, como pimiento y tomate25,28. En cualquier etapa de crecimiento de las plantas, P. capsici puede afectar su desarrollo, a menudo se observa muerte de plántulas aproximadamente a los cinco días después de la infección29,52.
Esta enfermedad es difícil de controlar debido a la rápida reproducción y diseminación de los propágulos infecciosos, lo que incluye la liberación de una gran cantidad de zoosporas (zoosporogénesis) y estructuras latentes del patógeno20,49. Cualquier interrupción en el desarrollo de zoosporas o en la liberación o motilidad de estas disminuye la posibilidad de infección19,25. Por lo tanto, la capacidad de inhibir la formación de esporangios o la liberación de zoosporas de este hongo fitopatógeno, o de afectar su motilidad, puede considerarse un criterio de selección de agentes de control biológico para la supresión de la enfermedad ocasionada por P. capsici54. Convencionalmente, en el control de esta enfermedad se utilizan productos químicos de acción oomiceticida51, sin embargo, el uso intensivo de estos productos ha generado efectos no deseados, como toxicidad residual, resistencia de los patógenos y contaminación ambiental24. Consecuentemente, el control biológico es también una alternativa para prevenir el daño colateral causado por los residuos químicos37.
Algunos microorganismos, como las rizobacterias promotoras del crecimiento de plantas (PGPR) pertenecientes al orden Bacillales, son reconocidos por su actividad antagonista sobre hongos fitopatógenos22,42. Bacillus amyloliquefaciens (B. amyloliquefaciens), de la familia Bacillaceae, produce resistencia sistémica inducida en la planta huésped y es capaz de generar una variedad de compuestos antimicrobianos7,23. B. amyloliquefaciens es eficaz en el control de enfermedades ocasionadas por algunas especies fitopatógenas de oomicetos y hongos, esto se debe a la posible producción de una variedad de compuestos biológicos activos sobre dichos agentes patógenos31,39. Dentro de estos compuestos antimicrobianos se encuentran los lipopéptidos cíclicos, los que incluyen diversos miembros de las familias químicas de la surfactina, la iturina y la fengicina21. Sin embargo, no todas las especies pertenecientes al género Bacillus producen estos lipopéptidos antimicrobianos como mecanismo de defensa39,46.
La biosíntesis de los lipopéptidos antimicrobianos se lleva a cabo a través la síntesis del péptido no ribosómico (SPNR), la estructura química de estas proteínas cíclicas comprende un ácido graso, que se puede incorporar a la cadena principal del péptido –con 7 a 10 α-aminoácidos– mediante ciclación (a menudo, en el carbono C2 o C3) por grupos amino o hidroxilo34,46.
Estas moléculas antimicrobianas pertenecen a un grupo estructuralmente diverso de biosurfactantes y tienen un uso potencial en la agricultura y la industria farmacéutica11. En los últimos años, se ha puesto interés sobre los lipopéptidos por su baja toxicidad, alta biodegradabilidad, elevada compatibilidad ambiental, alta selectividad y actividad específica a temperaturas y pH extremos y en condiciones de salinidad45. Estos rasgos hacen que la aparición de resistencia a los lipopéptidos antimicrobianos sea menos probable que la resistencia a los antibióticos convencionales35. Por lo anterior, estas moléculas representan una fuente importante de nuevas estructuras para la biotecnología industrial46.
A pesar de que los mecanismos de acción de los compuestos pertenecientes a la familia fengicina son menos conocidos que los descriptos para las otras dos familias, se sabe que tienden a interactuar con las capas lipídicas y se asocian, por ende, a cambios en la estructura y permeabilidad de la membrana celular, que son dependientes de las concentraciones10. Asimismo, los miembros de la familia surfactina pueden interactuar con la capa lipídica de la membrana celular para desintegrar la estructura17, lo que hace que pierdan funciones biológicas y afecten las actividades vitales de las células de diferentes microrganismos fitopatógenos. Los miembros de la familia iturina no destruyen la estructura de la membrana, pero pueden aumentar su permeabilidad y formar agujeros de conducción iónica que interfieren con el transporte transmembrana de sustancias50.
Hoy en día, la producción y disponibilidad del lipopéptido fengicina es limitada, sin embargo, su biosíntesis se encuentra en proceso de investigación. Hasta el momento, son escasos los proveedores que disponen de lipopéptidos como fengicina, iturina, liquenicina y micosubtilina como estándares de alta pureza5. Entre estos lipopéptidos, el más accesible es la surfactina. La baja disponibilidad de estos lipopéptidos dificulta la evaluación del potencial industrial o farmacéutico de estos compuestos, por lo que es importante encontrar la forma de incrementar su producción.
La biosíntesis de lipopéptidos difiere entre las cepas bacterianas y puede variar en respuesta a ciertas condiciones. Por ejemplo, se ha reportado que la suplementación de hierro en el medio de crecimiento de las bacterias productoras favorece la síntesis de estos compuestos4. Chen et al.6 reportaron que los filtrados de Streptomyces spp. obtenidos de medio de cultivo con quitina tienen un efecto oomiceticida sobre P. capsici.
Algunos autores mencionan que, añadiendo diferentes aminoácidos o fuentes de carbono y nitrógeno, como Arg, Gln o Val, es posible aumentar la síntesis del lipopéptido surfactina, y que el L-Glu aumenta la producción de bacilomicina30,36. No obstante, no está claro cómo estos aminoácidos afectan la producción de los lipopéptidos, asimismo, no se conoce bien el efecto de la presencia de microorganismos competidores en la producción de algunos metabolitos secundarios por parte de estas bacterias. Rojo-Bezares et al.38 utilizaron células inactivas de Lactobacillus spp. para inducir la producción de bacteriocinas en Lactobacillus plantarum y mostraron una actividad antimicrobiana sobre microorganismos pertenecientes a un género distinto al de la especie inductora, lo que refleja las dificultades de los métodos de producción y purificación de estos lipopéptidos.
En estudios previos, reportamos la significativa actividad antimicrobiana de la cepa KX953161.1 de B. amyloliquefaciens sobre P. capsiciin vitro y en plantas de tomate y chile29, dicha cepa fue aislada de la rizósfera de plantas de hortalizas. Se desconocen las sustancias bacterianas que afectan el desarrollo del oomiceto P. capsici. Asimismo, resulta importante conocer qué sustancias o condiciones promueven la síntesis de los compuestos responsables de la actividad oomiceticida. El objetivo de este estudio fue inducir la biosíntesis de lipopéptidos mediante la adición de compuestos químicos inductores y de células inactivas de Colletotrichum spp. al medio de crecimiento de la cepa KX953161.1 de B. amyloliquefaciens, la cual demostró actividad oomiceticida sobre las zoosporas de P. capsici.
Materiales y métodosMaterial biológicoLa cepa B. amyloliquefaciens KX953161.129 utilizada en este estudio fue aislada de la rizósfera de plantas de Solanum lycopersicum. Esta cepa se cultivó en agar nutritivo (AN) a 27°C durante cinco días y se preservó en buffer fosfato a 4°C hasta su uso. El patógeno P. capsici, aislado del tejido de plántulas de Capsicum annuum, se reactivó en agar con V8 a 30-35°C durante 72 h. Por otra parte, se aisló una cepa de Colletotrichum spp. del fruto de Carica papaya y esta se reactivó en papa dextrosa agar (PDA) durante 10 días a 28-30°C, tras lo que se inactivaron sus células mediante calor (55-65°C).
Productos químicos y materialesLos productos químicos empleados para preparar el medio de cultivo, los inductores (quitina, celulosa, hierro y ácido glutámico), los solventes utilizados para preparar la fase móvil de la HPTLC (metanol y cloroformo) y los productos necesarios para la extracción se adquirieron en Sigma-Aldrich®, en grado analítico. Se utilizaron placas de cromatografía de capa fina (TLC) de gel de sílice 60 F254 de 20 x 10 cm elaboradas por Merck® (Darmstadt, Alemania). Se emplearon estándares de surfactina (≥ 98%), iturina A (≥ 95%) y fengicina (≥ 90%) de Sigma-Aldrich®, Lipofabrik (Villeneuve d’Ascq, Francia).
Producción de lipopéptidosSe cultivó la bacteria B. amyloliquefaciens KX953161.1 en un matraz (500 mL) con 200 mL de caldo Luria-Bertani (LB), compuesto de peptona de caseína 10 g/L, extracto de lavadura 5 g/L y cloruro sódico 10 g/L, ajustado a pH = 7. El cultivo bacteriano se incubó a 30-35°C en un agitador orbital a 150 rpm por 18 a 20 h y alcanzó una concentración de 3x108 UFC/mL, de acuerdo a la escala de McFarland.
El efecto del tipo de inductor se evaluó en un diseño completamente al azar, con seis tratamientos y tres repeticiones por tratamiento, a saber: cultivo sin inductor como control(T1), 4 g/L de ácido glutámico (T2), 0,3 mg/L de hierro (T3), 1 mL de suspensión de células fúngicas inactivas (1x106 células/mL) (T4), 20 g/L de celulosa (T5), 4 g/L de quitina (T6).
Excepto las células fúngicas inactivas, que se agregaron luego de la esterilización del medio de cultivo, los otros inductores se agregaron al medio de cultivo antes de su esterilización, que fue a 115°C por 15 min. La producción de lipopéptidos se indujo agregando 30 mL de un inóculo de B. amyloliquefaciens KX953161.1 (3x108 UFC/mL) en frascos Erlenmeyer (2 L) con 750 mL de medio Landy27, compuesto por glucosa 20 g/L–1, ácido L-glutámico 5 g/L, extracto de levadura 1 g/L, K2HPO4 1 g/L, MgSO4 0,5 g/L, KCl 0,5 g/L, CuSO4 1,6 mg/L Fe2(SO4)3 0,4 mg/L y MnSO4 1,2 mg/L, el pH inicial se ajustó a 7. Se incubó durante seis días en un agitador orbital horizontal a 180 rpm y 30-32°C.
Extracción de los lipopéptidosLas células bacterianas fueron separadas del medio de cultivo por centrifugación (HERMLE Z 36 HK, Alemania) a 10.000 rpm durante 12 min, a 4°C. El extracto crudo con los lipopéptidos se obtuvo mediante el método de precipitación ácida del sobrenadante45. La acidificación (pH = 2) se realizó con la adición de HCl 6 N. Se dejó reposar por 24 h a 4°C y se centrifugó a 12.000 rpm durante 20 min, a 4°C. El sedimento obtenido se liofilizó (FreeZone Triad Benchtop Freeze Dryer, LABCONCO, E.E. U.U.).
Proteína totalEl contenido de proteína del extracto crudo se determinó utilizando el kit de ensayo de Bradford, empleando la curva estándar para el microensayo de proteína Bio-Rad con albúmina de suero bovino (ASB), en concentraciones de 1 a 20 μg/mL. Se usó un espectrofotómetro Varian Cary 60 UV (Australia). Un volumen de 160 μL de la muestra estándar diluida se hizo reaccionar con 40 μL de reactivo de Bradford, se midió la densidad óptica a 595 nm a los 5-20 min.
Identificación y cuantificación de los lipopéptidos cromatografía en capa fina de alta resoluciónLos lipopéptidos producidos por B. amyloliquefaciens KX953161.1 se identificaron y cuantificaron mediante un análisis de cromatografía de capa fina de alta resolución (HPTLC, CAMAG, Muttenz, Suiza), utilizando el software CATS Server, versión 2.5.18072.1, de acuerdo con la metodología descripta por Geissler et al.14, con ligeras modificaciones. Se sembraron muestras de 20 μL de los extractos liofilizados (bandas de 6 mm) en un equipo automático (TLC Linomat 5, S/N: 220730), manteniendo una distancia de 8 mm desde el borde inferior y 15 mm desde el borde izquierdo. Se utilizó metanol como disolvente de enjuague.
La cromatografía se realizó con una cámara de doble paso de 20 x 10 cm con revelado automático (ADC 2). La muestra se eluyó con la fase móvil cloroformo:metanol:agua (65:25:4; v:v:v. La distancia de migración fue de 60 mm y la saturación de la cámara se ajustó con la fase móvil durante 10 min. Finalmente, la placa se secó con una corriente de aire frío durante 5 min. El análisis de las muestras se realizó utilizando 20 μL por muestra a la placa. La exploración y el registro del densitograma se llevó a cabo en un sistema TLC Scanner 4 (S/N: 220265), con modo de absorción a una longitud de onda de 195 nm. La placa se escaneó a una velocidad de exploración de 20 mm/s, con una resolución de datos de 100 μm/paso y una dimensión de hendidura de 5 x 0,20 mm. Después del desarrollo, las imágenes de la placa se registraron en un sistema de documentación Visualizer 2 (CAMAG). Los espectros de absorbancia de los estándares y de las muestras se escanearon con el Scanner 4 a una velocidad de exploración de 20 mm/s, con una resolución de datos de 1 nm, una dimensión de hendidura de 5 x 0,20 mm y un rango de longitud de onda de 190-366 nm. La cuantificación de los lipopéptidos identificados a partir de 20 ± 1 mg mL–1 de cada extracto crudo liofilizado se realizó considerando la curva de calibración de cada estándar analítico, con 5 puntos de concentración, entre 100 y 1000 μg/mL.
La ecuación de regresión para el estándar de fengicina fue Abs = 0,00001*[fengicina μg/mL] + 0,0022 y mostró una fuerte linealidad (R2 = 0,9953). Para el estándar de surfactina, fue Abs = 0,00001*[surfactina μg mL–1] + 0,00004 y también demostró elevada linealidad, R2 = 0,9939, por lo que la cuantificación de lipopéptidos con este método se consideró confiable.
Preparación de estándaresSe prepararon soluciones madres de los estándares de surfactina y fengicina a una concentración de 1 mg/mL en metanol. A partir de estas soluciones, se prepararon las curvas de calibración (100, 300, 500, 700 y 1.000 μg/mL). El análisis por HPTLC se realizó con 10 μL de cada concentración en la placa, para proporcionar un intervalo de linealidad de 100 a 1.000 μg.
Pruebas de germinación de zoosporasSe evaluó la inhibición de la germinación de zoosporas de P. capsici (20 zoosporas μL–1) en portaobjetos cóncavos, utilizando el extracto liofilizado con los lipopéptidos producidos por B. amyloliquefaciens KX953161.1 (5 mg/mL de agua destilada estéril). En cada cavidad del portaobjeto, se colocó 20 μL de suspensión de zoosporas de P. capsici y 10 μL de la suspensión de lipopéptidos. Se cubrió con un cubreobjetos para prevenir la evaporación y se mantuvo bajo observación a 25-27°C durante 12 h. La inhibición en la formación de esporangios se determinó usando discos de 5 mm de agar con micelio de cinco días de crecimiento, estos se colocaron en cajas de Petri (10 x 10 cm) con 10 mL de agua destilada y se incubaron durante 48 h a 28-30°C. Para inducir la liberación de zoosporas del esporangio, se incubó a 4°C por 30 min26. En el testigo, se repitió el procedimiento anterior, pero sin aplicar la suspensión de lipopéptidos. En estos bioensayos, se registró el porcentaje de inhibición germinativa de zoosporas contabilizando 100 zoosporas en cada cavidad con la ayuda de un microscopio óptico (Carl Zeiss AXIO Imager.A2) con cámara integrada (AxioCam ERc5s), con los objetivos 10× y 40×. El experimento se realizó por triplicado.
Análisis estadísticoSe utilizó un diseño completo al azar para determinar el contenido total de proteínas (en mg/mL) y la cantidad de lipopéptidos (en μg mL) producida por B. amyloliquefaciens KX953161.1. Para ambos análisis, se consideró un solo nivel representado por una concentración del inductor por tratamiento. Los resultados se examinaron mediante análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba de Tukey para la comparación de medias (p ≤ 0,05) con el software Minitab 18.
ResultadosContenido proteico en el extracto crudoLa concentración proteica en los extractos crudos producidos por B. amyloliquefaciens KX953161.1 con distintos inductores se determinó mediante la prueba de Bradford y se reportó en mg/mL. El tratamiento con células de Colletotrichum spp. inactivadas mostró una concentración proteica de 4,07 mg/mL, valor superior a la del tratamiento control (1,56 mg/mL). La menor concentración proteica se detectó en el tratamiento al que se le agregó hierro, esta fue de 0,33 mg/mL (tabla 1).
Contenido proteico en el extracto crudo de cultivos de Bacillus amyloliquefaciens KX953161.1 en presencia de distintos inductores
| Tratamiento | Inductor | Proteína (mg/mL) |
|---|---|---|
| T1 | Control | 1,56 d |
| T2 | Acido glutámico | 2,06 c |
| T3 | Hierro | 0,33 f |
| T4 | Células inactivas (Colletotrichum sp.) | 4,07 a |
| T5 | Celulosa | 0,43 e |
| T6 | Quitina | 2,92 b |
Letras diferentes indican diferencias significativas de acuerdo con la prueba de Tukey (p ≤ 0,05).
Los extractos crudos y los estándares analíticos (fengicina, surfactina e iturina) se aplicaron en la misma placa para HPTLC. Los extractos crudos mostraron diferentes fracciones en distintos niveles de migración, correspondientes a distintas moléculas de lipopéptidos (fig. 1A) de acuerdo al Rf obtenido respecto de los valores de los estándares. Los cromatogramas de los extractos crudos mostraron tres zonas separadas y tres picos definidos, el primer pico con un valor de Rf = 0,09, el segundo con Rf = 0,17 y el tercero con Rf = 0,52 (fig. 1A-1). El primer y el tercer pico de la muestra coincidieron con los Rf de los estándares de fengicina y surfactina, respectivamente (fig. 1A-2 y 4), mientras que el segundo pico de la muestra no coincidió con el estándar de iturina, con un Rf = 0,24 (fig. 1A-3).
(A) Análisis por HPTLC del extracto crudo de cultivos de B. amyloliquefaciens KX953161.1. (A-2) Muestra del estándar de fengicina. (A-3) Muestra del estándar de iturina y (A-4) muestra del estándar de surfactina. Todos los estándares se prepararon a una concentración de 2,5 mg/L; el volumen sembrado fue 5 μL; para el desarrollo se empleó la fase móvil cloroformo:metanol:agua (65:25:4, v:v:v) a una distancia de migración de 60 mm. (B, C y D) Comparación de espectros UV; espectro del estándar de fengicina, surfactina e iturina (a), y del primer, tercer y segundo compuesto detectado por HPTLC en el extracto del cultivo de B. amyloliquefaciens KX953161.1 (b).
Los espectros de absorbancia de los picos de los estándares se compararon con los de la muestra en un intervalo de longitud de onda de 190 a 366 nm. Para el primer pico de la muestra se obtuvieron tres lecturas, con máximos de absorbancia a 189, 225 y 280 nm (fig. 1B), que coincidieron con los máximos de absorbancia del estándar de fengicina, con un coeficiente de correlación de 0,9933 (tabla 2). En cuanto al tercer pico, su espectro se comparó con el del estándar de surfactina (fig. 1C): en ambos solo se observó una lectura en sus máximos de absorbancia, con un coeficiente de correlación de 0,9969 (tabla 2). El segundo pico varió en el espectro del estándar de iturina; el compuesto de la muestra analizada solo obtuvo dos máximos de absorbancia, mientras que la iturina presentó tres máximos (202, 228 y 281 nm) (fig. 1D) y entre ambos compuestos se halló un coeficiente de correlación bajo, de 0,1785 (tabla 2).
Máximos de absorbancia del extracto crudo de cultivos de Bacillus amyloliquefaciens KX953161.1 y de los estándares analíticos
| Max. Abs. [λ, nm] | Analitos | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| Estándar (fengicina) | Compuesto 1 | Estándar (iturina) | Compuesto 2 | Estándar (surfactina) | Compuesto 3 | |
| Pico 1 | 189 | 189 | 202 | 242 | 198 | 199 |
| Pico 2 | 225 | 225 | 228 | 280 | - | - |
| Pico 3 | 279 | 280 | 281 | - | - | - |
| Correlación | 0,9933 | 0,1785 | 0,9969 | |||
El tipo de inductor evaluado afectó (p = 0,05) la biosíntesis de lipopéptidos en B. amyloliquefaciens KX953161.1. La mayor producción, tanto de fengicina como de surfactina, se obtuvo con el tratamiento de células inactivas del hongo Colletotrichum spp. (1847,02 ± 11,8 μg/mL y 2563,45 ± 18,4 μg/mL, respectivamente). Muy cerca de este nivel de producción estuvieron los tratamientos con quitina y ácido glutámico como inductores. En el tratamiento control, se observaron concentraciones de 1.588,74 ± 28,2 μg/mL y 1.519,5 ± 33,0 μg/mL de fengicina y surfactina, respectivamente. El tratamiento con celulosa dio como resultado una menor producción de fengicina (563,31 ± 11,96 μg/mL). De modo similar, el tratamiento con hierro redujo la biosíntesis de surfactina (903,74 ± 22,1 μg/mL) (tabla 3).
Cuantificación de la producción de surfactina y fengicina por Bacillus amyloliquefiens KX953161.1 en presencia de distintos inductores
| Tratamientos | Concentración (μg/mL) | |
|---|---|---|
| Fengicina | Surfactina | |
| Ácido glutámico | 1.690,07 ± 15,3 b | 1.646,22 ± 24,9 c |
| Quitina | 1.709,04 ± 13,6 b | 2035,2 ± 34,0 b |
| Hierro | 608,05 ± 22,6 d | 903,74 ± 22,1 e |
| Células inactivas (Colletotrichum sp.) | 1.847,02 ± 11,8 a | 2563,45 ± 18,4 a |
| Celulosa | 563,31 ± 11,9 d | 936,96 ± 41,1 e |
| Control | 1.588,74 ± 28,2 c | 1.519,5 ± 33,0 d |
Letras diferentes en una misma columna indican diferencias significativas de acuerdo a la prueba de Tukey (p ≤ 0,05).
En la evaluación del efecto de los extractos crudos liofilizados aplicados directamente sobre la suspensión de zoosporas de P. capsici, se observó un impacto sobre la motilidad y la germinación. Con todos los extractos se observó un comportamiento similar: inmediatamente después de ser agregados (0,5-2 min), los extractos provocaron una reducción notable de la motilidad. En solo minutos causaron lisis de las esporas (fig. 2D). El tratamiento con células fúngicas inactivas exhibió una actividad inmediata de degradación estructural de las zoosporas (fig. 2E) y una inhibición germinativa de zoosporas del 100% (fig. 2C).
Efecto del extracto crudo producido por B. amyloliquefaciens KX953161.1 en la germinación de zoosporas de P. capsici. (A y B) Se advierte la germinación de zoosporas con tubo germinal largo, sin ramificar, en ausencia de extracto. (C y D) Se observa la inhibición germinativa de zoosporas en presencia del extracto crudo. Las imágenes fueron tomadas bajo microscopio, con objetivo de 10× en campo claro.
En los tratamientos que llevaron a concentraciones bajas de lipopéptidos se observó la detención de la motilidad en la mayoría de las zoosporas y las zoosporas que aún presentaban motilidad exhibían un movimiento variable, lento o de manera circular, que por último cesaba y derivaba en el enquistamiento (fig. 3C y D). Bajo este tratamiento, las zoosporas que lograron germinar mostraron una malformación del tubo germinativo (abultamiento anormal o degradación de ápices hifales) (fig. 2B). Por su parte, las zoosporas control, a las que no se les aplicó la suspensión del extracto crudo, mostraron una motilidad normal por horas y tuvieron una germinación completa (fig. 3A y B).
Efectos del extracto crudo producido por B. amyloliquefaciens KX953161.1 sobre la morfología y la germinación de zoosporas de P. capsici. (A) Zoosporas germinadas en ausencia del extracto. (B) Tubo germinativo anormal. (C) Zoosporas sin geminación (enquistadas). (D y E) Las paredes de la zoospora de P. capsici se lisaron al momento del contacto con el extracto crudo que contenía los lipopéptidos producidos por B. amyloliquefaciens KX953161.1. Las imágenes fueron tomadas bajo microscopio, con objetivo de 40× en campo claro.
El control de la enfermedad ocasionada por el oomiceto P. capsici ha sido un desafío, principalmente en hortalizas, por los efectos secundarios resultantes del uso desmedido de productos químicos48. Una posible alternativa para el control de P. capsici en hortalizas es el uso de Bacillus spp., por el efecto de sus metabolitos32,52.
Algunas especies de Bacillus presentan adaptación a entornos ambientales adversos, además, secretan metabolitos secundarios antagonistas, como proteínas, lípidos, polisacáridos y péptidos13. En el presente estudio se comprobó la producción de lipopéptidos de B. amyloliquefaciens KX953161.1 en presencia de distintos inductores, y se demostró su capacidad para inhibir la germinación de zoosporas de P. capsici.
La síntesis de compuestos antimicrobianos por cepas de Bacillus ha sido descrita en distintos estudios; los antibióticos de naturaleza lipopeptídica más estudiados en biocontrol son iturina y surfactina21,40. La búsqueda de nuevos compuestos antimicrobianos de origen biológico es lenta en comparación con el ritmo de crecimiento de los casos de infección ocasionados por fitopatógenos, por lo tanto, es relevante la evaluación de nuevos compuestos antifúngicos eficientes, seguros, no tóxicos y con menor tendencia a generar resistencia.
En nuestro estudio, detectamos tres compuestos por cromatografía HPTLC, dos de los cuales se identificaron como fengicina y surfactina (fig. 1). Los resultados del cromatograma se compararon con los valores de Rf de los estándares analíticos de los tres compuestos; sin embargo, el compuesto correspondiente al pico 2 no coincidió con el valor de Rf del estándar de iturina (fig. 1A-1 y 3), al seguir la metodología de Geissler et al.14, quienes reportaron cromatogramas similares de HPTLC para la identificación y cuantificación simultánea, con valores de Rf para fengicina y surfactina de 0,07 y 0,44, respectivamente.
Se obtuvo una correlación mayor de 0,99 para los compuestos de los picos 1 y 3 con los estándares de fengicina y surfactina, mientras que la correlación del compuesto 2 con el estándar de iturina fue de 0,1785. Para que un compuesto se considere similar al del estándar, la correlación debe ser igual o mayor de 0,902,3,33. Por tal razón, el compuesto del pico 2 detectado en la muestra no corresponde al lipopéptido iturina. Será necesario identificarlo por un método distinto al utilizado en este estudio.
En investigaciones previas en las que se utilizó espectrometría de masas de tiempo de vuelo de ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF), se reporta que B. amyloliquefaciens produce diversos lipopéptidos, como bacilomicina, flagelina, mersacidina, pliplastina e iturina18,31, y se menciona la dificultad que existe en la caracterización de estas moléculas, por su baja producción y dificultad para la purificación.
La modificación del medio de cultivo es una de las posibles estrategias para mejorar la biosíntesis de lipopéptidos antimicrobianos. Esto consiste en agregar en la mezcla fuentes de carbono a base de azúcar y nitrógeno1,12,21. Además, algunos carbohidratos mejoran la formación de metabolitos bioactivos y la actividad enzimática53 dado que las proteínas de señalización afectan directa o indirectamente la síntesis de los lipopéptidos44,47. En este sentido, el uso de un nutriente o un inductor adecuado en el medio de cultivo estimula a la bacteria a aumentar la biosíntesis de metabolitos secundarios.
En este estudio, la mayor síntesis de lipopéptidos se obtuvo en el tratamiento con células inactivas del hongo Colletotrichum, seguido de los tratamientos con quitina y ácido glutámico, que resultaron superiores con respecto al control. Sin embargo, en los tratamientos con hierro y celulosa se obtuvo baja producción de lipopéptidos. Aunque se ha reportado que la presencia de hierro en el medio de cultivo favorece la síntesis de lipopéptidos4, en nuestro estudio se observó lo opuesto: la producción de fengicina y surfactina en presencia de hierro agregado fue inferior a la que se detectó en el tratamiento control y en el tratamiento con células inactivas de hongo (tabla 3). Lo mismo sucedió en el tratamiento con celulosa. Aun cuando algunos autores han obtenido resultados favorables en la síntesis de lipopéptidos con el uso de inductores como fuentes de carbono y nitrógeno, una relación carbono/nitrógeno no óptima es un parámetro crítico que disminuye la síntesis de los lipopéptidos15,16.
La presencia de microorganismos competidores es un factor ambiental que afecta la biosíntesis de antimicrobianos38,41. En algunos estudios se menciona que las células inductoras deben estar inactivas o parcialmente desnaturalizadas por calor (55-65°C), y que una proteína asociada a la pared celular, de aproximadamente 58 kDa, es, probablemente, la que induce la biosíntesis15,41.
Es importante considerar que estos estudios están orientados a la producción de bacteriocinas y que no existen reportes sobre producción de lipopéptidos. Tomando en cuenta estos antecedentes y nuestros resultados, la sustancia inductora podría ser una sola proteína o una estructura de envoltura celular que incluye componentes proteicos. Se deben realizar más estudios para mejorar la biosíntesis de lipopéptidos con actividad biológica con células inactivas como factor inductor.
En un estudio previo, se evaluó el desempeño de B. amyloliquefaciens como biocontrolador de P. capsici en plantas de tomate y chile; en ese estudio se observó un biocontrol efectivo y el efecto pudo deberse a los lipopéptidos sintetizados por la bacteria antagonista29. Estos lipopéptidos juegan un papel importante en el control biológico de hongos y oomicetos fitopatógenos.
En este estudio, el extracto con lipopéptidos producidos por B. amyloliquefaciens KX953161.1 inhibió la germinación de zoosporas de P. capsici. En tal sentido, se ha reportado que los lipopéptidos antimicrobianos producidos por B. amyloliquefaciens inhiben el crecimiento micelial de P. capsiciin vitro39. Sin embargo, la inhibición de la germinación de las zoosporas producidas por este fitopatógeno no ha sido evaluada antes. Diversos estudios sugieren que las zoosporas, gracias a su motilidad, localizan a los huéspedes y se agregan a los sitios de infección al detectar un gradiente de señales químicas específicas liberadas por el huésped19,20,25. En esta investigación se constató que el extracto con los lipopéptidos obstaculizó la motilidad de zoosporas, su germinación (fig. 2) y enquistamiento (fig. 3C), y llevó a malformaciones en el tubo germinal (fig. 3) y a degradación celular (fig. 2E).
Hasta el momento, no se conoce bien el modo de acción del lipopéptido fengicina, aunque se cree que este tiende a interactuar con las capas lipídicas y que puede generar cambios dependientes de la dosis en la estructura y permeabilidad de la membrana celular9. De igual forma, el lipopéptido surfactina actúa sobre la membrana lipídica solubilizando los fosfolípidos8. Deleu et al.9 sugieren que la actividad biológica de la fengicina está relacionada con sus efectos sobre las propiedades estructurales de la membrana y proponen dos mecanismos de acción en función de la concentración: a baja concentración, la fengicina se agregaría para formar poros que conducen a cambios de permeabilidad de la membrana; a concentraciones elevadas, actuaría como detergente, solubilizando la membrana, como se ha informado en relación con la surfactina.
De acuerdo con lo anterior, y teniendo en cuenta que la composición de la pared celular del oomiceto está formada por celulosa y por β-1,3 y β-1,6 glucanos43, es probable que estos lipopéptidos estén interactuando con la pared celular del oomiceto, volviéndola más permeable; sin embargo, este mecanismo aún no se comprende del todo.
En función de nuestros hallazgos, podemos afirmar que el extracto obtenido de la bacteria B. amyloliquefaciens KX953161.1 es eficaz contra zoosporas de P. capsici siempre y cuando exista contacto directo con los metabolitos producidos por la bacteria y presentes en el extracto.
Es necesario realizar más estudios que involucren la separación de cada uno de los lipopéptidos presentes en el extracto y evaluar por separado la interacción con la pared celular de las células de los oomicetos, con el fin de encontrar la concentración óptima de cada lipopéptido para que ejerza su acción inhibitoria sobre P. capsici. Aún falta información para entender mejor los mecanismos implicados en estos fenómenos.
ConclusionesEn el presente estudio se demostró un aumento en la producción de proteínas totales por la bacteria antagonista Bacillus amyloliquefaciens KX953161.1 tras añadir en el medio de cultivo células del hongo Colletotrichum spp. inactivadas por calor. Los lipopéptidos identificados en el extracto obtenido fueron fengicina y surfactina. Estos lipopéptidos influyeron negativamente en la germinación, la motilidad y el enquistamiento de P. capsici y aceleraron la degradación de sus zoosporas, también produjeron deformaciones en el tubo germinal y en las hifas de este hongo fitopatógeno.
FinanciamientoEsta investigación no recibió ninguna subvención específica de agencias de financiamiento en los sectores público, comercial o sin fines de lucro.
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de interés.
