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El VPH-16 es el genotipo de alto riesgo oncogénico más comúnmente detectado y junto con el VPH-18 es causante de ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>70% de los casos de CC globalmente<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0155"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>. Existen tres vacunas profilácticas que protegen contra la infección de estos genotipos: Cervarix®, Gardasil® y Gardasil®9<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a>. Estas vacunas se basan en partículas semejantes a virus (PSV) de la proteína mayoritaria L1 de la cápsida del VPH, obtenidas en sistemas eucariontes. A pesar de su elevada eficacia, los altos precios de las vacunas limitan su empleo en poblaciones de países de bajos ingresos, donde la incidencia del CC es mayor Por esta razón, nuevos candidatos vacunales se desarrollan a partir de sistemas de expresión más baratos, basados en PSV y capsómeros<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0160"><span class="elsevierStyleSup">3,4</span></a>.</p><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las subunidades pentaméricas o capsómeros de la proteína L1 son particularmente atractivos dado que, en contraste con las PSV que están compuestas de 360 copias de L1, solo contienen cinco monómeros de L1 y presentan los epítopos neutralizantes esenciales, capaces de inducir una respuesta inmune protectora<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">5,6</span></a>. Los capsómeros son producidos fácilmente en <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span>, pueden ser liofilizados y consecuentemente almacenados sin refrigeración<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0180"><span class="elsevierStyleSup">7</span></a>, lo que podría mejorar significativamente la disponibilidad de vacunas en los países en desarrollo. <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> se ha utilizado ampliamente para obtener <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> PSV<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0185"><span class="elsevierStyleSup">8-10</span></a> y capsómeros<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0200"><span class="elsevierStyleSup">11-13</span></a> del VPH-16 tras la expresión y purificación de la proteína L1 del VPH-16.</p><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En Cuba, el CC constituye la cuarta causa de muerte por cáncer en mujeres de todas las edades y la segunda en mujeres entre 15 y 44<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>años<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0215"><span class="elsevierStyleSup">14</span></a>. La vacunación contra el VPH no se ha podido implementar en Cuba, aunque se ha identificado una elevada prevalencia de los genotipos oncogénicos del VPH, siendo el VPH-16 el más frecuente en mujeres y hombres<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0220"><span class="elsevierStyleSup">15,16</span></a>. Por ello se requiere desarrollar alternativas más asequibles para inmunizar a la población en riesgo. Con este propósito, la proteína L1 del VPH-16 fusionada a una cola de histidinas (L1-His), codificada por un gen L1 del VPH-16 clonado de una muestra de cáncer cervical de una paciente cubana, se produjo en <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7 por nuestro grupo de trabajo<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a>, teniendo en cuenta que esta cepa ha permitido producir exitosamente proteínas con enlaces disulfuros y biológicamente activas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0235"><span class="elsevierStyleSup">18,19</span></a>. Establecer un proceso de purificación de la proteína L1-His a partir de <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7 es fundamental para poder realizar estudios de inmunogenicidad de la proteína para su posible utilización en el desarrollo de un candidato vacunal contra el VPH-16. Teniendo en cuenta estos antecedentes, el objetivo del presente estudio fue purificar la proteína L1-His del VPH-16, codificada por un gen L1 clonado de muestra de cáncer cervical de una paciente cubana, a partir de <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7, útil para el desarrollo futuro de un candidato vacunal cubano contra el VPH-16.</p></span><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0075">Materiales y métodos</span><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0080">Cepa bacteriana, plásmidos y medios de cultivo</span><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La cepa <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7 (New England Biolabs, Reino Unido) transformada con el plásmido pETHPV16L1myc-His17 (SHuffle® T7/pETHPV16L1myc-His), se empleó para producir la proteína L1-His del VPH-16. Este plásmido se obtuvo por nuestro grupo de trabajo y contiene un gen L1 del VPH-16 clonado de una muestra de cáncer de paciente cubana que codifica para una proteína L1 del VPH-16 fusionada por el extremo carboxilo a un fragmento de 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>aminoácidos, incluidas seis histidinas, bajo el promotor inducible T7lac.</p><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El caldo LB se empleó para el cultivo de las bacterias a pequeña escala, durante la inducción de la expresión del gen L1 con el inductor isopropilo-h-D-tiogalactopiranosido (IPTG). El medio de autoinducción ZYM-505221 enriquecido (32<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>g/L triptona, 24<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>g/L de extracto de levadura) se empleó como medio de cultivo para la producción de L1 y su posterior purificación. Los reactivos utilizados para la preparación de los medios de cultivo se adquirieron de Thermo Fisher Scientific, Oxoid. El resto de los reactivos químicos o bioquímicos empleados se adquirieron de Applichem.</p></span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0085">Evaluación de la solubilidad de la proteína L1-His del VPH-16 en SHuffle® T7/pETHPV16L1myc-His</span><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las bacterias cultivadas en LB e inducidas con 0,4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM de IPTG a 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C durante 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h se lisaron por tratamiento con lisozima (20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg/ml) seguido de tres pasos sucesivos de congelación-descongelación<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0245"><span class="elsevierStyleSup">20</span></a>. Las fracciones solubles e insolubles obtenidas tras centrifugación se conservaron a −20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C hasta su análisis mediante electroforesis desnaturalizantes en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) y Western Blotting (WB).</p></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0090">Detección de cuerpos de inclusión mediante microscopia electrónica de trasmisión</span><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para evaluar la presencia de CI en la cepa <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7/pETHPV16L1myc-His, las bacterias, tras inducirse la expresión del gen L1 con IPTG (0,4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM) durante 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h a 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C, se fijaron e incluyeron en resina Spur y se seccionaron en ultracortes finos, los que se observaron en microscopio electrónico de trasmisión Jeol JEM 1011 (JEOL, Japan) a 20.000×<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0245"><span class="elsevierStyleSup">20</span></a>.</p></span><span id="sec0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0095">Condiciones de cultivo de SHuffle® T7/pETHPV16L1myc-His, procedimiento de ruptura celular y procesamiento de los cuerpos de inclusión</span><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Una alícuota del banco de células de trabajo de <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle T7/pETHPV16L1myc-His se inoculó en 200<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de medio de autoinducción ZYM-5052<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0250"><span class="elsevierStyleSup">21</span></a> enriquecido (32<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>g/L de triptona, 24<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>g/L de extracto de levadura) y se incubó a 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C y 220<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>rpm durante 16<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h. Las bacterias se cosecharon mediante centrifugación a 12.000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>rpm por 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min (Eppendorf, Alemania). El precipitado celular se lavó dos veces con 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de tampón fosfato de sodio (PBS; NaCl<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,137<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM; Na<span class="elsevierStyleInf">2</span>HPO<span class="elsevierStyleInf">4</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,9,58<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM; KCl<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,2,68<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM; KH<span class="elsevierStyleInf">2</span>PO<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,1,47<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM; pH<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>2,7) y se resuspendió en una proporción de 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>g peso húmedo/10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml tampón de lisis (ácido 4-(2-hidroxietil)-piperazina-etano sulfónico (Hepes) 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM pH 8; NaCl, 300<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM; PMSF, 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM; EDTA, 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM; dithiothreitol (DTT), 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM).</p><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La lisis celular se realizó en un homogeneizador de alta presión (Avestin, Canadá), realizando tres pases sucesivos a una presión entre 15.000-17.000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>psi. El lisado celular se centrifugó a 12.000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>rpm a 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C durante 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min y el precipitado se lavó mediante resuspensión en tampón de lavado (TLav), a razón de 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg peso húmedo/ml TLav, durante 15<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min con agitación en zaranda (Heidolph, Alemania). Se evaluaron cuatro soluciones de lavados: TLav-1 (Hepes 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM, pH<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>8; NaCl 500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM); TLav-2 (TLav-1 con urea 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M); TLav-3 (TLav-2 con Tritón X-100 1%) y TLav-4 (TLav-1 con Tritón X-100 1%). Las fracciones solubles e insolubles obtenidas tras centrifugación se analizaron mediante SDS-PAGE y WB. La presencia de ADN en las fracciones insolubles se determinó mediante electroforesis en geles de agarosa al 0,8%.</p><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La extracción de la proteína L1-His de los cuerpos de inclusión (CI) lavados se evaluó a la hora y tres horas de incubación, así como con diferentes relaciones de peso húmedo (mg)/ml de tampón de extracción (Hepes 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM pH<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>8, NaCl, 500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM; Tween<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>80, 0,01%; urea, 8<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M). Las muestras se resuspendieron a razón de 10, 50, 100 y 200<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg/ml y se incubaron durante 3<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h a TA en zaranda (Heidolph, Alemania). Las fracciones solubles e insolubles obtenidas tras centrifugación se analizaron mediante SDS-PAGE y WB.</p></span><span id="sec0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0100">Procedimientos para la purificación y renaturalización de la proteína L1-His del VPH-16</span><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La proteína L1-His extraída de los CI se aplicó en una columna de 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml, con la matriz Chelating Sepharose Fast Flow (Amershan Biosciences, Suiza) cargada con iones Ni<span class="elsevierStyleSup">2+</span>, previamente equilibrada con tampón de equilibrio (TE, Hepes 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM pH-8, NaCl 500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM, urea 8<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M, tween 80<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,01%). La columna se lavó con TE y seguidamente con TE suplementado con 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM de imidazol. La elución se realizó con TE suplementado con 500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM de imidazol. La velocidad de flujo fue de 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml/min, excepto en la aplicación de la muestra, que fue de 0,5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml/min. La corrida se siguió mediante la medición de la absorbancia a 280<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm en un equipo ÄKTA-pure (GE, EE.UU.).</p><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La proteína purificada se renaturalizó por dilución inversa. Se diluyó hasta una concentración final de 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>μg/ml en tampón de renaturalización (Hepes 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM pH-8, NaCl 500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM, Tween 80 0,01%) para promover la formación de pentámeros. Se dejó reposar durante 6<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h a 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C y se centrifugó a 12.000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>rpm durante 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min. Posteriormente se concentró en centrisart (Sartorius, Alemania) y se almacenó a −20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>°C hasta su posterior análisis por cromatografía de exclusión molecular.</p><p id="par0090" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La concentración de proteínas en cada fracción se determinó mediante el método de Bradford modificado<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0255"><span class="elsevierStyleSup">22</span></a>. El rendimiento y la pureza del proceso de purificación se evaluaron mediante el análisis densitométrico del perfil electroforético de las fracciones en SDS-PAGE, a través del programa bioinformático Gelanalyzer 2010a<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0260"><span class="elsevierStyleSup">23</span></a>.</p></span><span id="sec0045" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0105">Análisis por SDS-PAGE y Western Blotting</span><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La producción y el peso molecular de la proteína L1-His del VPH-16 se estimaron mediante SDS-PAGE<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0245"><span class="elsevierStyleSup">20</span></a>. Las proteínas se separaron en geles al 10% de acrilamida y se detectaron con la tinción de Comassie G-250. Para los análisis de WB las proteínas se electrotransfirieron a una membrana de nitrocelulosa (Protran Whatman GmbH, Alemania) y la proteína L1-His del VPH-16 se inmunodetectó usando como anticuerpo primario los monoclonales CamVir-1 (MAB885, Merck, EE.UU), anti-histidina (anti-His) (A7058, Sigma, EE.UU.) y anti-HPV (MAB837, Merck, EE.UU). Como anticuerpo secundario se empleó el anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón conjugado con peroxidasa (CIGB, Sancti Spíritus, Cuba). Las membranas se revelaron con el sustrato 3,3’-diaminobenzidina (Sigma, EE.UU.).</p></span><span id="sec0050" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0110">Determinación del tamaño y del estado oligomérico de la proteína L1-His renaturalizada</span><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La proteína L1-His renaturalizada y concentrada se analizó mediante electroforesis nativa al 8% de acrilamida y cromatografía de exclusión molecular. Para esto último se aplicó en una columna C16/100 (Pharmacia, EE.UU.), empaquetada con Sephacryl S-500 HR en el tampón Tris 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM, NaCl 150<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM, pH<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>8. La columna se calibró con los patrones de calibración aldolasa (158<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa), Catalasa (232<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa), Ferritina (440<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa) y tiroglobulina (669<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa) (GE healtcare, EE.UU). La corrida se siguió mediante la medición de la absorbancia a 280<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm en equipo ÄKTA-pure (GE, EE.UU.). Se realizaron tres inyecciones de la muestra. Los valores del volumen de elución (Ve) se promediaron y se calculó el coeficiente de distribución (Kaν), según la siguiente ecuación:</p><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Kav=ve−vovt−vo, donde vo: volumen muerto y vt: volumen total</p><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El valor del peso molecular se determinó por interpolación del valor de Kaν de la muestra en la ecuación obtenida de la curva de calibración con los patrones utilizados. Todos los datos representan los valores promedios de al menos tres experimentos independientes.</p></span></span><span id="sec0055" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0115">Resultados</span><span id="sec0060" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0120">Solubilidad de la proteína L1-His del VPH-16 en <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7</span><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La proteína L1-His se detectó en la fracción insoluble de las células de SHuffle® T7/pETHPV16L1myc-His como una banda mayoritaria de una talla cercana a la esperada de L1-His (∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>60<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa) (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig. 1</a>A, carril 2), la que fue reconocida con el anticuerpo anti-His (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig. 1</a>A, carril 2b). El análisis de las bacterias mediante microscopia electrónica de trasmisión mostró zonas electrodensas hacia sus polos, características de los CI (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">fig. 1</a>B). Los resultados indicaron que la proteína L1-His del VPH-16 en <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7 se encontraba insoluble, en CI, los cuales se emplearon como material para su purificación.</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0065" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0125">Producción de la proteína L1-His del VPH-16 en <span class="elsevierStyleItalic">E. coli</span> SHuffle® T7, aislamiento de los CI y extracción de L1-His</span><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los cultivos de SHuffle® T7/pETHPV16L1myc-His en condiciones de autoinducción alcanzaron una densidad óptica a 600<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm de 13,9<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>±<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>1. El análisis de la producción de L1-His en los lisados de células completas evidenció una banda mayoritaria con el tamaño esperado de L1-His (∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>60<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa) en SDS-PAGE (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig. 2</a>A, carriles 2-4), que fue reconocida con el anticuerpo anti-His (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">fig. 2</a>B, carriles 2-4) y representó el 12<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>±<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,6% de las proteínas totales.</p><elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia><p id="par0125" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Una vez verificada la producción de la proteína L1-His en los cultivos se procedió a su lisis. El lavado de la fracción insoluble obtenida tras la lisis (constituida por los CI de L1-His y otros contaminantes celulares), con cuatro tampones suplementados con diferentes aditivos, no mostró diferencias evidentes en la remoción de las proteínas contaminantes (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3</a>A). Todos los lavados permitieron eliminar una proteína mayoritaria de ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>70<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3</a>A, carriles 5-8). Respecto al ADN contaminante, se observaron bandas de ADN de mayor intensidad y talla en los lavados con los tampones<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>1 y<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>2, respecto a los lavados con los tampones que contenían Tritón X-100 (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0015">fig. 3</a>B, carriles 1 y 2 vs carriles 3 y 4). De acuerdo con estos resultados, para lavar los CI se seleccionó la solución de lavado que solo contenía Tritón X-100 al 1%.</p><elsevierMultimedia ident="fig0015"></elsevierMultimedia><p id="par0130" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La extracción de la proteína L1-His del VPH-16 en presencia de urea 8<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M y diferentes proporciones de CI en tampón de extracción (10, 50, 100 y 200<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg/ml) evidenció que la extracción fue total solo en la proporción de 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg/ml (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0020">fig. 4</a>, carriles 2 y 4), por lo que se seleccionó esta condición para la solubilización de los CI.</p><elsevierMultimedia ident="fig0020"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0070" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0130">Purificación cromatográfica de la proteína L1-His del VPH-16</span><p id="par0135" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La fusión de una secuencia codificadora de seis histidinas consecutivas al extremo 3’ del gen L1 del VPH-16 durante su clonación<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a> permitió la purificación de la proteína L1-His mediante la cromatografía de afinidad de quelatos de iones Ni<span class="elsevierStyleSup">2+</span> (Ni<span class="elsevierStyleSup">2+</span>-<span class="elsevierStyleItalic">immobilized metal affinity chromatography</span> [IMAC]) en condiciones desnaturalizantes. Luego de la aplicación de la muestra, dos picos principales se observaron en el perfil cromatográfico (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">fig. 5</a>A). El primero se correspondió con la eliminación de proteínas contaminantes durante el lavado con 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM de imidazol (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">fig. 5</a>B, carril 4) y el segundo con la elución de la proteína L1-His en presencia de 500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM de imidazol, el que presentó una banda mayoritaria de ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>58<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">fig. 5</a>B, carril 5), talla cercana a la teórica de la proteína L1-His (60<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa) y que fue reconocida por anticuerpos específicos contra la L1 del VPH (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">fig. 5</a>C,D, carril 2), confirmándose la identidad de la proteína eluida como la L1-His del VPH-16. La pureza de la proteína L1-His purificada fue de ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>90%, según análisis mediante SDS-PAGE. Este parámetro se afectó debido a la coelución de una banda de menor talla (∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>43<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa), inmunorreactiva con los anticuerpos anti-L1 del VPH (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">fig. 5</a>C,D, carril 2). El rendimiento del proceso de purificación fue del 40% y se relacionó con una unión incompleta de la proteína L1-His a la matriz (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0025">fig. 5</a>B, carril 2). El rendimiento total fue de 42,31<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>±<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>5,4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg de L1-His/L de cultivo.</p><elsevierMultimedia ident="fig0025"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0075" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0135">Obtención de pentámeros de la proteína L1-His del VPH-16 tras renaturalización de proteína purificada</span><p id="par0140" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El rendimiento del proceso de renaturalización de la proteína L1-His purificada en Hepes 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM pH 8, NaCl 500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM, Tween 80<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>0,01% mediante dilución inversa fue del 62%, correspondiente a 9<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>±<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>3,1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg de pentámeros/L de cultivo. La proteína renaturalizada migró como una banda con una talla superior a 220<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa en electroforesis nativa (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0030">fig. 6</a>A), lo que sugirió su asociación en oligómeros. El análisis mediante cromatografía de exclusión molecular evidenció un pico homogéneo (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0030">fig. 6</a>B), con una talla de 287<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa, cercana al valor teórico de 300<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa del pentámero de L1-His<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0200"><span class="elsevierStyleSup">11</span></a>, lo cual indicó que la proteína renaturalizada se encontraba asociada en pentámeros.</p><elsevierMultimedia ident="fig0030"></elsevierMultimedia></span></span><span id="sec0080" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0140">Discusión</span><p id="par0145" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La producción local de vacunas basadas en PSV o capsómeros en sistemas alternativos más baratos es una estrategia que podría ayudar a lograr una implementación efectiva de la vacunación contra el VPH<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0265"><span class="elsevierStyleSup">24</span></a>. <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> se ha empleado exitosamente para obtener capsómeros del VPH-16 <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span><a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0200"><span class="elsevierStyleSup">11-13</span></a>. La mayoría de estos estudios se basan en la producción soluble de la proteína L1 a través de su fusión a potenciadores de la solubilidad como la glutatión-S-transferasa, purificación de la proteína fusionada por afinidad y obtención <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> de capsómeros de L1, tras digestión con proteasas específicas para remover la fusión. Este proceso es complejo, con varios pasos cromatográficos, relativamente costoso y con limitaciones para su escalado<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0270"><span class="elsevierStyleSup">25</span></a>. En el presente estudio se describe la obtención <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> de pentámeros de la proteína L1-His del VPH-16, luego de la extracción en 8<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M de urea de la proteína L1-His, purificación en condiciones desnaturalizantes y renaturalización en condiciones permisivas de la formación de pentámeros.</p><p id="par0150" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Teniendo en cuenta que la proteína L1-His del VPH-16 posee 12 cisteínas en su secuencia primaria, la cepa <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7 se seleccionó como huésped<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a>, dada su capacidad para promover la producción de proteínas con puentes disulfuro<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0235"><span class="elsevierStyleSup">18,19</span></a>. La proteína L1-His del VPH-16 se produjo en <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7 tras inducción con IPTG<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a> y en el presente estudio se encontró en correspondencia con informes previos sobre la producción de una variante de la proteína L1 del VPH-16 en la cepa de <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> HMS174 (DE3) transformada con el plásmido pET16L1, tras crecimiento en el medio 2YS e inducción con IPTG a 0,4<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0195"><span class="elsevierStyleSup">10</span></a> y 1,0<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0275"><span class="elsevierStyleSup">26</span></a>.</p><p id="par0155" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En el presente estudio se emplearon condiciones de autoinducción, en las que se logran elevadas densidades celulares, con el consiguiente aumento de la productividad volumétrica<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0250"><span class="elsevierStyleSup">21,27</span></a>. En estas condiciones, la proteína L1-His fue insoluble y representó ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>12% de las proteínas totales, en correspondencia con resultados previos en inducción con IPTG<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a> y la producción de otra variante de la proteína L1-His del VPH-16 en <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> HMS174<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0200"><span class="elsevierStyleSup">11</span></a>.</p><p id="par0160" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La acumulación de la proteína L1-His en los CI facilitó su purificación, dado que estos agregados se aislaron tras un paso de centrifugación simple luego de la lisis celular y su lavado con Tritón X-100 permitió aumentar la pureza de la proteína L1-His hasta un 23% de las proteínas totales, en correspondencia con la capacidad del Tritón X-100 de remover fragmentos de membranas contaminantes y otros lípidos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0285"><span class="elsevierStyleSup">28</span></a>. La proteína L1-His se extrajo completamente en ausencia de agentes reductores, en contraste con estudios previos, en los que se requirió DTT<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0195"><span class="elsevierStyleSup">10,26</span></a>. La mayor solubilidad de la L1-His del VPH-16 producida en los CI en el presente estudio pudiera relacionarse con su obtención en la cepa <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7, reconocida por su potencialidad para producir proteínas con puentes disulfuro.</p><p id="par0165" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La cromatografía de afinidad de quelatos metálicos fue empleada por Lai y Middelberg<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0275"><span class="elsevierStyleSup">26</span></a> y Choe et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0290"><span class="elsevierStyleSup">29</span></a> para purificar una variante de la proteína L1 del VPH-16 fusionada a una cola de histidinas por su extremo carboxilo. En el presente estudio la extracción de L1-His en ausencia de agentes reductores permitió su purificación directa mediante IMAC-Ni<span class="elsevierStyleSup">2+</span>, con una pureza de un ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>90%, similar a la obtenida por Lai y Middelberg<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0275"><span class="elsevierStyleSup">26</span></a>, y estuvo influenciada mayormente por la copurificación de un fragmento de ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>43<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa de la proteína L1-His. El rendimiento del proceso de purificación se estimó en ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>40%, inferior a los rendimientos obtenidos por Choe et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0290"><span class="elsevierStyleSup">29</span></a> (∼58%) y Lai y Middelberg<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0275"><span class="elsevierStyleSup">26</span></a> (70%), lo cual puede estar relacionado con una menor unión de la proteína L1-His a la matriz empleada.</p><p id="par0170" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Con el propósito de promover el replegamiento de la L1-His purificada a su conformación nativa, se disminuyó la concentración de urea en condiciones que promovieran la formación de pentámeros mediante dilución inversa, considerando que el método de dilución es superior al de diálisis<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0275"><span class="elsevierStyleSup">26</span></a>. Se ha informado que la dilución directa del desnaturalizante en un tampón adecuado generó productos que poseían epítopos conformacionales neutralizantes<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0275"><span class="elsevierStyleSup">26</span></a>. El rendimiento total del proceso de purificación, incluyendo el paso de renaturalización, se estimó en ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>9<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg de pentámeros de L1-His/L de cultivo, superior al de Chen et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0200"><span class="elsevierStyleSup">11</span></a> (3-5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg/L), Schädlich et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210"><span class="elsevierStyleSup">13</span></a> (1,6<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg/L) y Pan et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0205"><span class="elsevierStyleSup">12</span></a> (4,84<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg/L), quienes evaluaron la formación de capsómeros a partir de la proteína L1 fusionada a la glutatión-S-transferasa. Sin embargo, cuando la L1 se produjo junto con las chaperonas GroEL/ES, los rendimientos aumentaron cinco veces (25,98<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg/L)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0205"><span class="elsevierStyleSup">12</span></a>, aunque la aplicabilidad de esta estrategia a gran escala pudiera ser problemática por la posible influencia de pequeñas cantidades de GroEL/ES como contaminante<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210"><span class="elsevierStyleSup">13</span></a>.</p><p id="par0175" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El proceso de purificación desarrollado en el presente estudio permitió obtener los capsómeros de L1-His directamente, mediante el procesamiento de los CI, un único paso cromatográfico y un proceso de renaturalización simple. Se ha demostrado que las formulaciones vacunales contra el VPH-16 basadas en capsómeros purificados de <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> inducen la producción de anticuerpos neutralizantes<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0210"><span class="elsevierStyleSup">13,25</span></a>, protegen contra la infección del VPH-16 en estudios preclínicos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">5,6</span></a> y con adyuvantes adecuados son tan inmunogénicos como la vacuna Cervarix®. Además, las unidades capsoméricas son más estables que las vacunas profilácticas licenciadas contra el VPH disponibles, que requieren cadena de frío<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0180"><span class="elsevierStyleSup">7</span></a>. De tal manera, el empleo de un sistema de expresión basado en <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle, como se describe en este estudio, en el que se obtienen capsómeros directamente de los CI, podría ofrecer una solución más asequible para el desarrollo de candidatos vacunales contra el VPH. La purificación de la proteína L1-His mediante el método descrito en el presente estudio permite obtener pentámeros de la proteína L1-His para análisis estructurales adicionales y de inmunogenicidad, así como la posterior optimización del proceso para una escala mayor.</p></span><span id="sec0085" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0145">Conclusiones</span><p id="par0180" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En este trabajo se describió por primera vez la obtención de pentámeros de la proteína L1-His del VPH-16, codificada por un gen L1 clonado de una muestra de cáncer cervical de una paciente cubana a partir de los CI de <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7. La estrategia desarrollada podría ser una alternativa para la obtención de capsómeros de L1-His, para desarrollar un candidato vacunal contra el VPH-16.</p></span><span id="sec0090" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0150">Conflicto de intereses</span><p id="par0185" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.</p></span></span>" "textoCompletoSecciones" => array:1 [ "secciones" => array:11 [ 0 => array:3 [ "identificador" => "xres1401690" "titulo" => "Resumen" "secciones" => array:4 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "abst0005" "titulo" => "Objetivo" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "abst0010" "titulo" => "Métodos" ] 2 => array:2 [ "identificador" => "abst0015" "titulo" => "Resultados" ] 3 => array:2 [ "identificador" => "abst0020" "titulo" => "Conclusiones" ] ] ] 1 => array:2 [ "identificador" => "xpalclavsec1283427" "titulo" => "Palabras clave" ] 2 => array:3 [ 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elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0015">Métodos</span><p id="spar0010" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">La cepa <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7 transformada con el plásmido pETHPV16L1myc-His se empleó para producir la proteína L1-His del VPH-16 cultivada en condiciones de autoinducción. La proteína L1-His se purificó mediante cromatografía de afinidad de quelatos de iones Ni<span class="elsevierStyleSup">2+</span> (IMAC-Ni<span class="elsevierStyleSup">2+</span>) tras extracción de los cuerpos de inclusión (CI) con urea 8<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M y posterior renaturalización por dilución inversa. La talla molecular de la proteína L1-His renaturalizada se evaluó mediante electroforesis nativa y cromatografía de exclusión molecular.</p></span> <span id="abst0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0020">Resultados</span><p id="spar0015" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">La proteína L1-His del VPH-16 se acumuló en CI en <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7, representando ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>12% de las proteínas totales. Se purificó mediante IMAC-Ni<span class="elsevierStyleSup">2+</span> en condiciones desnaturalizantes, con una pureza de ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>90% y un rendimiento de ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>40%. La renaturalización de la L1-His purificada permitió obtener ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>9<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg de pentámeros/L de cultivo, con un rendimiento final del proceso de ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>62%.</p></span> <span id="abst0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0025">Conclusiones</span><p id="spar0020" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">En este trabajo se describió por primera vez la purificación de pentámeros de la proteína L1-His del VPH-16, codificada por un gen L1 clonado de una muestra de cáncer cervical de una paciente cubana, a partir de los CI de <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7. La estrategia desarrollada podría ser una alternativa para la obtención de capsómeros de L1-His, para desarrollar un candidato vacunal contra el VPH-16.</p></span>" "secciones" => array:4 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "abst0005" "titulo" => "Objetivo" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "abst0010" "titulo" => "Métodos" ] 2 => array:2 [ "identificador" => "abst0015" "titulo" => "Resultados" ] 3 => array:2 [ "identificador" => "abst0020" "titulo" => "Conclusiones" ] ] ] "en" => array:3 [ "titulo" => "Abstract" "resumen" => "<span id="abst0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0035">Objective</span><p id="spar0025" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">To purify the human papillomavirus 16 (HPV-16) L1 protein encoded by a cloned L1 gene from a sample of cervical cancer from a Cuban patient and fused to a histidine tag at its carboxyl end (L1-His) from <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7.</p></span> <span id="abst0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0040">Methods</span><p id="spar0030" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">The strain <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7 with the plasmid pETHPV16L1myc-His was used to obtain the HPV-16 L1-His protein, grown under autoinduction conditions. L1-His protein was purified by Ni<span class="elsevierStyleSup">2+</span> ion-chelated affinity chromatography (Ni<span class="elsevierStyleSup">2+</span>-IMAC), after extraction of the inclusion bodies (IB) with 8<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M urea and subsequent refolding by an inverse dilution method. The molecular size of the refolded HPV-16 L1-His protein was analyzed by native polyacrilamide gel electrophoresis and molecular exclusion chromatography.</p></span> <span id="abst0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0045">Results</span><p id="spar0035" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">The HPV-16 L1-His protein accumulated in IB in <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7 and represented ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>12% of total proteins. After its extraction with 8<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M urea from IB was purified by Ni<span class="elsevierStyleSup">2+</span>-IMAC, with an ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>90% purity and an ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>40% yield. Renaturation of purified L1-His allowed obtaining ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>9<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg of pentamers/L of culture, with a final recovery of ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>62%.</p></span> <span id="abst0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0050">Conclusions</span><p id="spar0040" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">For the first time it was described the purification of pentamers of HPV-16 L1-His protein encoded by a cloned L1 gene from a Cuban patient from <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7's IB. The developed strategy could be an alternative for obtaining L1-His protein capsomers for developing a vaccine candidate against HPV-16.</p></span>" "secciones" => array:4 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "abst0025" "titulo" => "Objective" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "abst0030" "titulo" => "Methods" ] 2 => array:2 [ "identificador" => "abst0035" "titulo" => "Results" ] 3 => array:2 [ "identificador" => "abst0040" "titulo" => "Conclusions" ] ] ] ] "multimedia" => array:7 [ 0 => array:7 [ "identificador" => "fig0005" "etiqueta" => "Figura 1" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr1.jpeg" "Alto" => 761 "Ancho" => 1341 "Tamanyo" => 76955 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "<p id="spar0045" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">Solubilidad de la proteína L1-His del VPH-16. 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Lisados celulares de <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7 con: carril 1: pET-28a (C-); carriles 2-4: pETHPV16L1myc-His. PM, <span class="elsevierStyleItalic">Broad Range Protein Molecular Weight Marker</span> (Promega, EE.UU.). 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PM, <span class="elsevierStyleItalic">Broad Range Protein Molecular Weight Marker</span> (Promega, EE.UU.). Carriles 1, 2, 3 y 4: fracción insoluble de los lavados con TLav-1, -2, -3 y -4, respectivamente; carriles 5, 6, 7 y 8: fracción soluble de TLav-1, -2, -3 y -4, respectivamente. TLav-1: Hepes 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM pH 8, NaCl 500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>Mm; TLav-2: TLav-1 +<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>urea 4<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M; TLav-3: TLav-2+ tritón X-100 1%; TLav-4: TLav-1+ tritón X-100 1%.</p>" ] ] 3 => array:7 [ "identificador" => "fig0020" "etiqueta" => "Figura 4" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr4.jpeg" "Alto" => 621 "Ancho" => 2175 "Tamanyo" => 68656 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "<p id="spar0060" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">Extracción de la proteína L1-His del VPH-16 a partir de los cuerpos de inclusión de <span class="elsevierStyleItalic">E.</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">coli</span> SHuffle® T7/pETHPV16L1myc-His. Análisis mediante Western Blotting con el anticuerpo anti-His de las fracciones solubles (fs) e insolubles (fi), obtenidas tras extracción de la L1-His del VPH-16 en Hepes 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM, pH 8,0; NaCl 500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM, urea 8<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M, Tween 80 0,01%. 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Se empleó la matriz <span class="elsevierStyleItalic">Chelating Sepharose Fast Flow</span> y el tampón de equilibrio (TE) Hepes 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM pH 8, NaCl 500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM, Tween 80 0,01%, urea 8<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>M, en sistema de cromatografía líquida ÄKTA-pure (GE, EE.UU.). A)<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>Cromatograma de proceso de purificación, según densidad óptica a 280<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm. B)<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>Análisis de las fracciones obtenidas mediante SDS-PAGE al 10% de acrilamida. C,D)<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>Análisis de Western Blot con el anticuerpo CamVir 1 (MAB885, Merck) y anti-VPH (MAB837, Merck), respectivamente. En B, carril 1: muestra aplicada en la columna; carril 2: fracción no unida a la matriz; carril 3: lavado con TE; carril 4: lavado con TE +<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM imidazol; carril 5: elución con TE +<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM imidazol. PM, <span class="elsevierStyleItalic">Broad Range Protein Molecular Weight Marker</span> (Promega, EE.UU.). En C y D, carril 1: muestra aplicada en la columna; carril 2: elución L1-His del VPH-16 (TE +<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM imidazol).</p>" ] ] 5 => array:7 [ "identificador" => "fig0030" "etiqueta" => "Figura 6" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr6.jpeg" "Alto" => 956 "Ancho" => 2175 "Tamanyo" => 97127 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "<p id="spar0070" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">Análisis de la L1-His del VPH-16 renaturalizada mediante dilución inversa en Hepes 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM, NaCl 500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM, Tween 80 0,01%. A)<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>PAGE nativa al 8% de acrilamida. B)<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>Cromatograma de la proteína L1-His del VPH-16 renaturalizada, en cromatografía de exclusión molecular en Sephacryl S-500 HR. En el cuadro aparece la banda obtenida mediante SDS-PAGE de la proteína L1-His renaturalizada. Ferritina (patrón de calibración).</p>" ] ] 6 => array:5 [ "identificador" => "tb0005" "tipo" => "MULTIMEDIATEXTO" "mostrarFloat" => false "mostrarDisplay" => true "texto" => array:1 [ "textoCompleto" => "<span class="elsevierStyleSections"><span id="sec0005" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0065">Puntos clave</span><p id="par0010" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><ul class="elsevierStyleList" id="lis0005"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0005"><span class="elsevierStyleLabel">•</span><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La proteína L1-His del VPH-16 representó ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>12% de las proteínas totales.</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0010"><span class="elsevierStyleLabel">•</span><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se purificó con una pureza de ∼<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>90% mediante cromatografía de afinidad a iones Ni<span class="elsevierStyleSup">2+</span>.</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0015"><span class="elsevierStyleLabel">•</span><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se obtuvieron 9<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg de pentámeros de L1-His/L de cultivo, tras su renaturalización.</p></li></ul></p></span></span>" ] ] ] "bibliografia" => array:2 [ "titulo" => "Bibliografía" "seccion" => array:1 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "bibs0015" "bibliografiaReferencia" => array:29 [ 0 => array:3 [ "identificador" => "bib0150" "etiqueta" => "1" "referencia" => array:1 [ 0 => array:2 [ "contribucion" => array:1 [ 0 => array:2 [ "titulo" => "Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries" "autores" => array:1 [ 0 => array:2 [ "etal" => false "autores" => array:6 [ 0 => "F. 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Purificación de la proteína L1 del virus del papiloma humano tipo 16 a partir E.coli SHuffle® T7
Purification of the human papillomavirus 16 L1 protein from E.coli SHuffle® T7