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Efecto de la interleucina 1ß sobre la expresión de la molécula de adhesión ICAM-1 soluble tras una agresión endotóxica experimental
Effect of interleukin 1- on expression of the adhesion molecule ICMs-1 following experimental endotoxic shock
A. Mansilla Rosellóa, L. Téllez Gila, A. Collado Torresa, JA. Ferrón Orihuelaa
a Unidad de Cirugía Experimental. Servicio de Cirugía General y del Aparato Digestivo (Dr. J.A. Ferrón Orihuela). Hospital Universitario Virgen de las Nieves. Granada.
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entre los que destacan los macr&#243;fagos&#44; las c&#233;lulas de la serie blanca y el sistema de citocinas<span class="elsevierStyleSup">2</span>&#46; El resultado final de la actuaci&#243;n de estos mediadores es una lesi&#243;n endotelial provocada&#44; entre otros&#44; por el fen&#243;meno de marginaci&#243;n leucocitaria&#46; Este fen&#243;meno se debe a la s&#237;ntesis en el endotelio de mol&#233;culas de adhesi&#243;n&#44; las cuales comienzan a expresarse a las pocas horas de provocada la agresi&#243;n&#44; sobre las que se adhieren los leucocitos polimorfonucleares neutr&#243;filos &#40;PMN&#41; y linfocitos<span class="elsevierStyleSup">3</span>&#46; En estudios previos hemos observado c&#243;mo el pretratamiento experimental con dosis subletales de interleucina 1&#223; &#40;IL-1&#223;&#41; 24 h antes de provocar una agresi&#243;n con lipopolisac&#225;rido de membrana bacteriana &#40;LPS&#41; provoca&#44; entre otros efectos&#44; un aumento tanto del n&#250;mero de leucocitos circulantes como del &#237;ndice CD4&#47;CD8<span class="elsevierStyleSup">4</span>&#44; fen&#243;meno que podr&#237;a estar mediado por una disminuci&#243;n de la marginaci&#243;n de estas c&#233;lulas hacia el endotelio&#44; consecuencia de la menor expresi&#243;n de mol&#233;culas de adhesi&#243;n inducida por el tratamiento&#46; El objeto de este estudio es comprobar si&#44; efectivamente&#44; la administraci&#243;n de IL-1&#223; en las condiciones citadas provoca una disminuci&#243;n de la expresi&#243;n de la mol&#233;cula de adhesi&#243;n intercelular &#40;ICAM-1&#41; soluble&#46; </p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Material y m&#233;todos</span></p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Material biol&#243;gico </span></p><p class="elsevierStylePara"> Se han utilizado ratones endog&#225;micos hembras de la cepa CBA&#47;H con una edad comprendida entre 10 y 12 semanas y peso entre 19 y 21 g&#46; Los animales se criaron en el animalario de la Unidad de Cirug&#237;a Experimental del Hospital Virgen de las Nieves de Granada&#44; donde permanecieron en un medioambiente controlado con un ciclo luz-oscuridad de 12 h y una temperatura media de 20 &#176;C&#44; teniendo libre acceso a la comida y al agua hasta finalizada la experiencia&#46; </p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Modelo experimental de shock endot&#243;xico</span></p><p class="elsevierStylePara"> El shock endot&#243;xico se provoc&#243; mediante la inyecci&#243;n intraperitoneal de lipopolisac&#225;rido de membrana bacteriana &#40;LPS&#41; de <span class="elsevierStyleItalic">Escherichia coli</span> serotipo 055&#58;B5 &#40;Sigma Chemical Company&#41;&#44; a dosis de 125 mg&#47;kg de peso&#46; Esta dosis se administr&#243; disuelta en 0&#44;1 ml de tamp&#243;n fosfato salino con un pH de 7&#44;4&#46;  </p><p class="elsevierStylePara"> IL-1<span class="elsevierStyleItalic">&#223;</span> recombinante murina </p><p class="elsevierStylePara"> La IL-1&#223; recombinante murina &#40;Genzyme Immunobiologicals&#41; fue administrada por v&#237;a intraperitoneal a dosis de 80 ng por rat&#243;n&#44; disuelta en 0&#44;1 ml de tamp&#243;n fosfato salino con un pH de 7&#44;4 a las 24 h previas a la inyecci&#243;n del LPS&#46; </p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Protocolo experimental</span></p><p class="elsevierStylePara"> Se distribuyeron 72 ratones de manera aleatoria en tres grupos de 24 cada uno&#46; </p><p class="elsevierStylePara"> &#160; </p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">1&#46;</span> Grupo 1&#58; grupo simulado al que se administraron 2 dosis de 0&#44;1 ml de tamp&#243;n fosfato salino con un pH de 7&#44;4 &#40;c&#243;digo P-3818&#44; Sigma Chemical Company&#41; por v&#237;a intraperitoneal&#59; la segunda dosis se administr&#243; 24 h despu&#233;s de la primera&#46;  </p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">2&#46;</span> Grupo 2&#58; grupo control&#44; en el que se provoc&#243; un shock endot&#243;xico mediante la administraci&#243;n de 125 mg&#47;kg de LPS de <span class="elsevierStyleItalic">Escherichia coli</span> serotipo 055&#58;B5 por v&#237;a intraperitoneal&#46; De igual modo se inyectaron 0&#44;1 ml de tamp&#243;n fosfato salino con un pH de 7&#44;4 por la misma v&#237;a 24 h antes del LPS&#46; </p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">3&#46;</span> Grupo 3&#58; grupo tratado con IL-1&#223; recombinante murina&#44; la cual se administr&#243; por v&#237;a intraperitoneal a dosis de 80 ng por rat&#243;n 24 h antes de inyectar el LPS&#46; </p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Determinaci&#243;n de ICAM-1 soluble</span></p><p class="elsevierStylePara"> En 6 ratones de cada grupo se determinaron&#44; a las 1&#44; 2&#44; 4 y 24 h de inyectado el LPS&#44; las concentraciones s&#233;ricas de ICAM-1 soluble&#46; Las muestras de sangre se obtuvieron mediante laparotom&#237;a&#44; previa anestesia del animal con 50 mg&#47;kg de peso de pentobarbital s&#243;dico y 5 mg&#47;kg de peso de ketamina&#44; ambos por v&#237;a intraperitoneal&#46; Se puncion&#243; la vena cava con jeringa de insulina&#44; obteni&#233;ndose sangre venosa hasta la muerte del animal por exanguinaci&#243;n&#46; Las muestras se recolectaron en tubos est&#233;riles con separadores del suero modelo Vacutainer Brand SST &#40;referencia 367784&#44; Becton Dickinson&#41;&#44; centrifug&#225;ndose a 3&#46;000 rpm durante 15 min a una temperatura de 4 &#176;C en una centr&#237;fuga refrigerada&#46; Se alicuotaron 100 &#181;l del suero obtenido en tubos Eppendorff&#44; que se congelaron inmediatamente a &#173;80 &#176;C y se almacenaron en estas condiciones hasta su posterior an&#225;lisis&#46; Las concentraciones de ICAM-1 soluble en suero de rat&#243;n&#44; a las distintas horas de inducido el shock endot&#243;xico experimental&#44; se midieron mediante la t&#233;cnica de ELISA utilizando el paquete comercial Mouse ELISA ICAM-1 &#40;CD54&#41; &#40;c&#243;digo EM-ICAM1 Endogen&#41;&#44; previa diluci&#243;n de las muestras a una proporci&#243;n de 1&#58;100&#46; La lectura se efectu&#243; en un lector de ELISA autom&#225;tico y programable &#40;SLT Lab Instruments A-5082&#41; con filtro de 450 nm&#44; siendo las absorbancias resultantes directamente proporcionales a las concentraciones en &#181;g&#47;ml de ICAM-1 soluble presentes en las muestras&#46; </p><p class="elsevierStylePara"> El principio del ensayo de la t&#233;cnica de ELISA empleada en este estudio es un enzimoinmunoan&#225;lisis de fase s&#243;lida en el que se emplea el principio del s&#225;ndwich de m&#250;ltiple anticuerpo&#46; Este m&#233;todo usa anticuerpos monoclonales anti-CD54 al tamente purificados &#40;anticuerpos de captura&#41;&#44; absorbidos de manera no covalente sobre los pocillos de la placa de microtitulaci&#243;n&#46; Los anticuerpos inmovilizados capturan espec&#237;ficamente las mol&#233;culas ICAM-1 soluble presentes en las muestras colocadas en cada pocillo&#46; Despu&#233;s de lavar la placa para eliminar el material no ligado&#44; la mol&#233;cula ICAM-1 soluble capturada es detectada por un anticuerpo anti-CD54 biotinilado &#40;anticuerpo de detecci&#243;n&#41;&#44; que se liga a la ICAM-1 soluble capturada&#46; Seguidamente&#44; se a&#241;ade una enzima &#40;peroxidasa&#41; conjugada con avidina o estreptoavidina&#44; que se liga con biotina a los inmunocomplejos capturados en la placa&#46; La adici&#243;n de una soluci&#243;n que contiene un sustrato crom&#243;geno inicia un cambio de coloraci&#243;n catalizado por la enzima&#44; el cual se detiene por acidificaci&#243;n&#46; El grado de color resultante es medido por espectrofotometr&#237;a utilizando un lector de placa de ELISA y a una densidad &#243;ptica apropiada&#46; </p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">An&#225;lisis estad&#237;stico</span></p><p class="elsevierStylePara"> Las concentraciones s&#233;ricas de ICAM-1 soluble se presentan como media &#177; desviaci&#243;n est&#225;ndar de la media&#44; y aplicamos un an&#225;lisis de la variancia de una v&#237;a usando la prueba de Newman-Keuls para comparar estos valores entre los distintos grupos y a las distintas horas&#44; considerando significativa una p &#60; 0&#44;05&#46; </p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Resultados</span></p><p class="elsevierStylePara"> En la primera hora posterior a la agresi&#243;n endot&#243;xica se observ&#243; un aumento en las concentraciones s&#233;ricas de ICAM-1 soluble en el grupo tratado con IL-1&#223; con respecto a los grupos simulado y control&#46; En la segunda hora&#44; &#233;stas siguieron aumentando en el grupo control en comparaci&#243;n con el grupo simulado&#44; sin que se apreciaran diferencias entre estos dos &#250;ltimos con el grupo tratado&#46; En la cuarta hora los valores de ICAM-1 soluble se elevaron todav&#237;a m&#225;s en el grupo LPS&#44; siendo este aumento significativamente mayor que en los otros dos grupos&#46; A su vez&#44; en el grupo tratado con IL-1&#223; las concentraciones de ICAM-1 soluble fueron mayores que en el grupo simulado&#46; Por &#250;ltimo&#44; a las 24 h se observ&#243; c&#243;mo en el grupo LPS continuaron aumentando los valores de ICAM-1 soluble&#44; siendo significativamente mayores con respecto a los grupos simulado y tratado con IL-1&#223;&#46; Entre estos dos &#250;ltimos grupos tambi&#233;n se apreci&#243; que las concentraciones s&#233;ricas de ICAM-1 soluble fueron mayores en el grupo tratado en comparaci&#243;n con el grupo simulado &#40;tabla 1 y fig&#46; 1&#41;&#46;  <img src="366899A.JPG" width="229" height="88" alt="366899a"></img><img src="3668991.JPG" width="229" height="252"></img></p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Discusi&#243;n</span></p><p class="elsevierStylePara"> El MODS es la consecuencia cl&#237;nica de un proceso sist&#233;mico mediado por factores circulantes end&#243;genos que desencadenan una reacci&#243;n inflamatoria generalizada&#44; conocida como SIRS&#44; como respuesta del propio hu&#233;sped ante distintos tipos de agresiones&#44; durante la cual se produce la activaci&#243;n de m&#250;ltiples c&#233;lulas inflamatorias efectoras como macr&#243;fagos&#44; leucocitos y linfocitos<span class="elsevierStyleSup">2</span>&#46; Merece especial atenci&#243;n el papel que ejercen las c&#233;lulas endoteliales en la fisiopatolog&#237;a de la respuesta inflamatoria&#46; El endotelio vascular es el primer blanco de distintos mediadores inflamatorios&#44; y uno de los pasos m&#225;s importantes en el desarrollo del MODS est&#225; representado por la adherencia sobre el mismo de las c&#233;lulas blancas sangu&#237;neas<span class="elsevierStyleSup">1&#44;3</span>&#46; </p><p class="elsevierStylePara"> En las fases iniciales del SIRS&#44; el macr&#243;fago estimulado libera grandes cantidades de citocinas&#44; como la interleucina 1 &#40;IL-1&#41;&#44; el factor de necrosis tumoral &#40;TNF&#41; y la interleucina 6 &#40;IL-6&#41;<span class="elsevierStyleSup">2&#44;3</span>&#46; Entre otros efectos sist&#233;micos&#44; estos mediadores ac t&#250;an sobre la c&#233;lula endotelial&#44; provocando un cambio en su fenotipo a trav&#233;s de la expresi&#243;n en la misma de mol&#233;culas de adhesi&#243;n&#44; como la mol&#233;cula de adhesi&#243;n intercelular &#40;ICAM-1&#41;<span class="elsevierStyleSup">3</span>&#46; La ICAM-1 media la adherencia sostenida de neutr&#243;filos a las c&#233;lulas endoteliales<span class="elsevierStyleSup">5</span>&#44; fen&#243;meno conocido como marginaci&#243;n leucocitaria&#44; disminuyendo por tanto el n&#250;mero total de PMN circulantes en el torrente circulatorio&#46; Los PMN adheridos provocan una lesi&#243;n del endotelio a trav&#233;s de la liberaci&#243;n de enzimas proteol&#237;ticas y radicales libres de ox&#237;geno&#44; cuya consecuencia biol&#243;gica final es la disfunci&#243;n y el fracaso del &#243;rgano afectado<span class="elsevierStyleSup">3</span>&#46; En estudios experimentales previos se ha comprobado que el pretratamiento con IL-1&#223; 24 h antes de provocar una agresi&#243;n endot&#243;xica causa una modulaci&#243;n de la respuesta del hu&#233;sped ante la agresi&#243;n&#46; As&#237;&#44; este tratamiento evita la elevaci&#243;n durante las primeras horas posteriores a la inyecci&#243;n de LPS&#44; de las concentraciones s&#233;ricas de IL-1&#44; TNF e IL-6<span class="elsevierStyleSup">6&#44;7</span>&#46; Igualmente&#44; hemos observado c&#243;mo la IL-1&#223; causa&#44; a las 24 h de producido el shock s&#233;ptico&#44; un aumento en el n&#250;mero de leucocitos circulantes en sangre total al compararlo con el grupo no tratado<span class="elsevierStyleSup">4</span>&#46; Creemos que dicho efecto pudiera deberse a una disminuci&#243;n de la expresi&#243;n&#44; entre otras mol&#233;culas de adhesi&#243;n&#44; de la ICAM-1&#46; Esta mol&#233;cula comienza a ser detectada a las 2 h&#44; y alcanza su m&#225;xima expresi&#243;n a las 4 h de provo cado el estado s&#233;ptico con LPS<span class="elsevierStyleSup">8</span>&#46; La s&#237;ntesis y expresi&#243;n de ICAM-1 contin&#250;a aumentando&#44; consiguiendo concentraciones estables de expresi&#243;n cerca de las 24 h posteriores a la agresi&#243;n<span class="elsevierStyleSup">9</span>&#46; La expresi&#243;n sobre las membranas de las c&#233;lulas endoteliales de esta mol&#233;cula es estimulada directamente por el LPS&#44; as&#237; como por el TNF&#44; la IL-1 y la IL-6 producidas por c&#233;lulas inmunol&#243;gicas activadas durante las primeras horas tras la agresi&#243;n endot&#243;xica<span class="elsevierStyleSup">1</span>&#46; La acumulaci&#243;n de neutr&#243;filos y el edema que se observan en los tejidos durante la respuesta inflamatoria se atribuyen al efecto de la endotoxina sobre las c&#233;lulas endoteliales&#44; que inducen a su vez la producci&#243;n de citocinas y &#233;stas&#44; en consecuencia&#44; una sobreproducci&#243;n de mol&#233;culas de adhesi&#243;n<span class="elsevierStyleSup">1&#44;3&#44;10</span>&#46; Este proceso provoca la migraci&#243;n y redistribuci&#243;n de los leucocitos hacia los distintos &#243;rganos&#44; favoreciendo la acci&#243;n lesiva sobre los mismos y disminuyendo el n&#250;mero total de estas c&#233;lulas en sangre perif&#233;rica<span class="elsevierStyleSup">3&#44;8&#44;11</span>&#46; Estas observaciones apoyan el hecho de que la lesi&#243;n endotelial que se observa en el MODS est&#225; asociada con la s&#237;ntesis y expresi&#243;n de las mol&#233;culas de adhesi&#243;n&#44; y que la transmigraci&#243;n de neutr&#243;filos a trav&#233;s del endotelio desde la luz vascular al espacio extravascular depende de la existencia de &#233;stas<span class="elsevierStyleSup">3</span>&#46; Al mismo tiempo que la mol&#233;cula ICAM-1 se expresa en la membrana endotelial&#44; puede ser liberada al torrente circulatorio en respuesta a la activaci&#243;n celular por degradaci&#243;n proteol&#237;tica secundaria a la lesi&#243;n en el endotelio y&#44; por tanto&#44; el incremento de la fracci&#243;n soluble en sangre de esta mol&#233;cula &#40;ICAM-1 soluble&#41; se correlaciona proporcionalmente con el aumento de su expresi&#243;n en las membranas celulares<span class="elsevierStyleSup">12</span>&#46; Se sugiere que esta liberaci&#243;n de ICAM-1 por parte de los tejidos lesionados podr&#237;a tener un efecto de reclutamiento de otras c&#233;lulas hacia el foco de lesi&#243;n&#44; con lo que se potenciar&#237;a la respuesta inflamatoria<span class="elsevierStyleSup">12</span>&#46;  </p><p class="elsevierStylePara"> En este estudio hemos comprobado c&#243;mo el pretratamiento con IL-1&#223; produce una disminuci&#243;n de las concentraciones s&#233;ricas de ICAM-1 en las horas posteriores a la provocaci&#243;n de un estado s&#233;ptico experimental&#46; La disminuci&#243;n de la expresi&#243;n de esta mol&#233;cula explicar&#237;a el aumento del n&#250;mero de leucocitos circulantes en estas condiciones de sepsis experimental que hemos observado en experiencias previas<span class="elsevierStyleSup">4</span>&#46; Dicho efecto pare ce ser debido a la acci&#243;n protectora que las dosis subletales de IL-1&#223; ejercen durante las primeras horas posteriores a la inyecci&#243;n del LPS&#44; evitando el ascenso de IL-1&#44; TNF e IL-6<span class="elsevierStyleSup">6&#44;7</span>&#46; Con ello se suprimir&#237;a&#44; en parte&#44; el efecto estimulador que estas citocinas tienen sobre la c&#233;lula endotelial&#44; inhibiendo la expresi&#243;n sobre sus membranas de ICAM-1 y&#44; por tanto&#44; la adherencia sobre las mismas de los PMN&#46; De esta forma se evitar&#237;a el efecto lesivo de estas c&#233;lulas sobre el endotelio&#46; Hemos comprobado c&#243;mo este tratamiento disminuye las concentraciones de mieloperoxidasa &#40;enzima espec&#237;fica de los PMN&#41;<span class="elsevierStyleSup">13</span> y de productos derivados de la peroxidaci&#243;n lip&#237;dica &#40;malondialdeh&#237; do&#41;<span class="elsevierStyleSup">14</span> tisulares&#44; indicadores cuantitativos del grado de infiltraci&#243;n leucocitaria y de lesi&#243;n celular&#44; respectivamente&#44; tras una agresi&#243;n endot&#243;xica en distintos &#243;rganos de ratones posterior a la inyecci&#243;n de LPS&#46; Este hecho estar&#237;a en consonancia con una menor adhesi&#243;n de PMN sobre el endotelio al expresar &#233;ste menos ICAM-1&#44; con lo que se mitigar&#237;a el efecto lesivo de estas c&#233;lulas&#44; y todo ello inducido por la IL-1&#223; previamente inyectada&#46; </p><p class="elsevierStylePara"> En la pr&#225;ctica cl&#237;nica&#44; las mol&#233;culas de adhesi&#243;n solubles se han descrito como marcadores de la inflamaci&#243;n en alteraciones inflamatorias agudas y cr&#243;nicas<span class="elsevierStyleSup">15</span>&#44; as&#237; como indicadores de activaci&#243;n y da&#241;o endotelial<span class="elsevierStyleSup">16</span>&#44; y su determinaci&#243;n parece ser &#250;til en la cuantificaci&#243;n de la magnitud de la lesi&#243;n tisular en la respuesta inflamatoria<span class="elsevierStyleSup">12</span>&#46; En enfermos con sepsis severa y en aquellos con desarrollo de s&#237;ndrome de disfunci&#243;n org&#225;nica m&#250;ltiple&#44; las concentraciones de ICAM-1 soluble se elevan tempranamente&#46; Pueden incluso servir como marcadores para el diagn&#243;stico temprano del fracaso org&#225;nico y del pron&#243;stico en pacientes con s&#237;ndrome de disfunci&#243;n org&#225;nica m&#250;ltiple<span class="elsevierStyleSup">12&#44;16</span>&#44; as&#237; como indicador primario de sepsis cl&#237;nica o bacteremia en neonatos<span class="elsevierStyleSup">17</span>&#46; Se han estudiado las concentraciones en plasma de ICAM-1 en pacientes con sepsis&#44; sepsis severa y shock s&#233;ptico&#44; siendo marcadamente elevadas en pacientes con sepsis fatal &#40;1&#46;793 ng&#47;ml&#41;&#44; mientras que en aquellos que sobrevivieron fueron significativamente m&#225;s bajas &#40;786 ng&#47;ml&#41;&#46; Las concentraciones plasm&#225;ticas de ICAM-1 soluble superiores a 1&#46;000 ng&#47;ml se han asociado con una elevada tasa de mortalidad<span class="elsevierStyleSup">18</span>&#46; En pacientes con shock s&#233;ptico se han descrito concentraciones plasm&#225;ticas de ICAM-1 soluble muy aumentadas&#44; que se han incrementado significativamente durante los primeros 3-5 d&#237;as de la enfermedad<span class="elsevierStyleSup">19&#44;20</span>&#46;  </p><p class="elsevierStylePara"> A la vista de los resultados obtenidos en este estudio&#44; podemos afirmar que el tratamiento experimental con IL-1&#223; provoca una disminuci&#243;n en la expresi&#243;n de la mol&#233;cula de adhesi&#243;n ICAM-1 soluble tras una agresi&#243;n endot&#243;xica&#44; siendo probablemente &#233;ste uno de los mecanismos por los cuales este tratamiento ejerce su acci&#243;n protectora frente a una agresi&#243;n endot&#243;xica&#44; al evitar los efectos lesivos que tienen sobre el endotelio los PMN adheridos sobre el mismo&#44; disminuyendo de esta forma la lesi&#243;n celular y&#44; por generalizaci&#243;n&#44; la disfunci&#243;n org&#225;nica&#46; </p>"
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Información del artículo
ISSN: 0009739X
Idioma original: Español
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