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Clin Invest Arterioscl. 2008;20(2):48-54
Introducción.
La vía de señalización del ácido
retinoico (AR) media la transcripción inducida por
ligando de genes del metabolismo lipídico a través
de los receptores nucleares, receptor X de retinoico
y receptor de AR, y del coactivador proteína de
unión al AR tipo II. Se ha establecido una
asociación entre esta vía de señalización y las
alteraciones lipídicas en trastornos como la
hiperlipemia familar combinada y la hiperlipemia
inducida por el tratamiento con inhibidores de la
proteasa (IP) en pacientes con infección por el
virus de la inmunodeficiencia humana (VIH).
Nuestro objetivo ha sido comprobar la hipótesis
según la cual el gen
CRABP2
estaría involucrado en
la modulación de la dislipemia.
Sujetos y métodos.
Se ha realizado un estudio de
asociación del polimorfismo –394T>C del
promotor de
CRABP2
en 3 poblaciones
independientes (299 individuos sanos, 182
pacientes con infección por el VIH y 151 pacientes
con hipercolesterolemia familiar [HF]). Todas las
analíticas se determinaron en ausencia de
tratamiento hipolipemiante. Se realizó ANOVA
ajustando por edad, índice de masa corporal, sexo,
y uso de IP cuando fue necesario.
Resultados.
La frecuencia del alelo C fue del 0,03
en los 3 grupos estudiados. Entre los individuos
sanos, los portadores del alelo C presentaban un
aumento en la concentración de colesterol total del
9% (p = 0,027) y de colesterol unido a lipoproteínas
de baja densidad (cLDL) del 13% (p = 0,020). En
los pacientes infectados por el VIH, se realizó un
análisis multivariante de 4 medidas tomadas
durante 1 año, y se observó que los valores de
cLDL eran significativamente más elevados en los
portadores del alelo C (p = 0,001), y que éstos
oscilaban entre el 10 y el 31%. Asimismo, los
pacientes HF portadores del alelo C presentaban
un aumento significativo en la concentración de
cLDL del 16% (p = 0,038). El alelo C estaba
sobrerrepresentado en individuos
hipercolesterolémicos (p = 0,001).
Conclusiones.
Nuestros resultados muestran
que el gen
CRABP2
, involucrado en la vía de
señalización del ácido retinoico, está asociado
con elevadas concentraciones de cLDL en plasma.
Palabras clave:
CRABP-II (proteína de unión al ácido retinoico tipo II).
CRABP2
(gen de la proteína de unión al ácido retinoico tipo 2).
Polimorfismo. Hiperlipemia.
Este trabajo ha recibido una de las 30 menciones especiales a
las mejores comunicaciones presentadas en las distintas áreas
del XIX Congreso Nacional de la Sociedad Española de Arte-
riosclerosis-Santander 2006.
Correspondencia: Dr. J. Ribalta.
Unitat de Recerca de Lípids i Arteriosclerosi.
Facultat de Medicina i Ciències de la Salut.
Universitat Rovira i Virgili.
Sant Llorenç, 21. 43201 Reus. Tarragona. España.
Correo electrónico: josep.ribalta@urv.cat
Recibido el 20-6-2007 y aceptado el 4-7-2007.
Asociación entre el gen de la
cellular retinoic acid
binding protein (CRABP2)
y valores elevados de
colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad
Juliana Salazar
a
, Montse Guardiola
a
, Raimon Ferré
a
, Blai Coll
a
, Carlos Alonso-Villaverde
a
,
Brigitte M. Winklhofer-Roob
b
, Edmond Rock
c
, Joan D. Fernández-Ballart
a
, Fernando Civeira
d
,
Miguel Pocoví
e
, Lluís Masana
a
y Josep Ribalta
a
a
Institut de Recerca en Ciències de la Salut. Hospital Universitari Sant Joan. Universitat Rovira i Virgili. Reus. Tarragona. España.
b
Human Nutrition & Metabolism Research and Training Center. Institute of Molecular Biosciences. Karl-Franzens University.
Graz. Austria.
c
UMMM. INRA-Theix. St. Genes Champanelle. Francia.
d
Laboratorio de Investigación Molecular. Hospital Universitario Miguel Servet. Zaragoza. España.
e
Departamento de Bioquímica. Biología Molecular y Celular. Universidad de Zaragoza. España.
Originales
RELATIONSHIP BETWEEN CELLULAR
RETINOIC ACID BINDING PROTEIN II GENE
(CRABP2)
AND INCREASED LDL CHOLESTEROL
Introduction.
The retinoic acid (RA) signaling
pathway regulates the transcription of target genes
which control lipid metabolism mediated by the
ligand of the nuclear receptors, retinoic X receptor
and RA receptor, and the cofactor cellular RA
binding protein-II. Interestingly, this signaling
pathway has been associated with disorders of
lipid metabolism such as familial combined
hyperlipidemia (FCHL) and the hyperlipidemia
secondary to antiretroviral HIV treatment with
protease inhibitors (PI). We sought evidence for the
hypothesis that the
CRABP2
gene is involved in the
regulation of lipid metabolism.
Subjects and methods.
We performed association
studies using the promoter –394T>C
polymorphism of the
CRABP2
gene in 3 different
cohorts (299 healthy males, 182 HIV-infected
patients and 151 patients with familial
hypercholesterolemia [FH]). All cholesterol
measurements were in the absence of any lipid
lowering agents. ANOVA was performed on the
data adjusted for age, BMI, gender and PI use.
Results.
The frequency of the C allele was 0.03 in
the 3 groups. Among healthy males, carriers of the
C allele had 9% higher total plasma cholesterol (p =
0.027) and 13% higher LDLc concentrations (p =
0.020). In HIV-infected patients, a multivariate
analysis of 4 measurements over a one year period
showed that carriers of the C allele had
significantly higher LDLc of between 10 and 31%
(p = 0.001) compared with non-carriers of the
allele. FH patients who were carriers of the C allele
had a 16% increase in LDLc (p = 0.038). The C
allele was significantly over-represented among
hypercholesterolemic patients (p = 0.001).
Conclusions.
Our results show that the
CRABP2
gene, a member of the retinoid signaling pathway,
is associated with increased plasma LDLc
concentrations.
Key words:
CRABP-II (cellular retinoic acid binding protein-II ).
CRABP2
(cellular retinoic acid binding protein-II gene). Polymorphism.
Hyperlipidemia.
Introducción
La hiperlipemia es un factor de riesgo cardiovas-
cular para la población general y constituye la
principal causa de mortalidad en las sociedades oc-
cidentales. La hiperlipemia puede tener su origen
en una combinación de factores ambientales, gené-
ticos y/o farmacológicos, asociados al estilo de
vida. La administración de determinados fárma-
cos, como son el ácido retinoico (AR) y sus deri-
vados utilizados en el tratamiento de afecciones
dermatológicas y ciertos tipos de cáncer
1
, o el tra-
tamiento antirretroviral con inhibidores de la pro-
teasa (IP) para la infección por el virus de la inmu-
nodeficiencia humana (VIH)
2
, causa hiperlipemia
como efecto secundario. El mecanismo común que
podría explicar esta alteración sería una afectación
de la vía de señalización del AR, que comportaría
una desregulación de genes implicados en el meta-
bolismo lipídico. Genes reguladores importantes
de esta vía son los receptores nucleares, receptor X
de retinoico (RXR) y receptor de AR (RAR), y la
proteína de unión al AR tipo II (CRABP-II)
3
. RXR y
RAR son factores de transcripción que actúan
como receptores intracelulares de ligandos deriva-
dos de colesterol, ácidos grasos, y vitaminas liposo-
lubles que regulan genes diana que median el
transporte y el metabolismo lipídico.
Pacientes con hiperlipemia familar combinada
(HFCL) y pacientes con hiperlipemia y lipodistrofia
secundaria al tratamiento antirretroviral con IP pre-
sentan valores bajos de retinol en plasma
4,5
. En pa-
cientes que reciben tratamiento con IP, la disminu-
ción en las concentraciones plasmáticas de retinol
es seguida por un aumento en la producción intra-
celular de AR
5
. La actividad biológica del AR consis-
te en la activación de receptores para retinoides que
actúan como factores de transcripción, dependien-
tes de ligando, en la regulación de la expresión de
genes diana. Por lo tanto, un control transcripcional
defectivo podría ser una de las causas de las altera-
ciones lipídicas observadas en estos pacientes.
En condiciones normales, el retinol se cede a la
célula como ésteres de retinol por los quilomicro-
nes remanentes, o como retinol unido a la proteína
transportadora de retinol (RBP). En la célula, el re-
tinol se oxida a retinal y a AR mediante la acción
de deshidrogenasas (RDHs, SDHs, RALDHs). Estos
metabolitos son transportados por las proteínas
transportadoras de retinol (CRBP-I, CRBP-II) y de
AR (CRABP-I, CRABP-II)
6
. CRABP-II transporta el
AR del citosol al núcleo donde forma un complejo
con el heterodímero RAR:RXR, que permite la
unión de AR a los receptores y contribuye a au-
mentar la actividad transcripcional
7,8
.
Por otro lado, decir que estudios de ligamiento
para la HFCL y la lipodistrofia parcial han descrito
un
locus
común en la región del genoma 1q21-23,
en la que los genes
CRABP-II
y
RXR

son claros
SALAZAR J ET AL. ASOCIACIÓN ENTRE EL GEN DE LA
CELLULAR RETINOIC ACID BINDING PROTEIN (CRABP2)
Y VALORES ELEVADOS DE COLESTEROL
UNIDO A LIPOPROTEÍNAS DE BAJA DENSIDAD
Clin Invest Arterioscl. 2008;20(2):48-54
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candidatos como moduladores de la dislipemia
9,10
.
En un trabajo anterior, nuestro grupo identificó
una nueva variante en la región promotora del gen
CRABP2
, el polimorfismo –394T>C
11
. En el presen-
te estudio, mediante el uso de este marcador, mos-
tramos una relación entre el gen
CRABP2
y la disli-
pemia en individuos sanos y en individuos con
diferentes condiciones hiperlipémicas. Nuestros re-
sultados muestran que el alelo C está asociado con
concentraciones de cLDL significativamente eleva-
das en individuos sanos, en pacientes con infección
por el VIH y en pacientes con hipercolesterolemia
familiar (FH), y que el alelo C está sobrerrepresen-
tado en individuos con hipercolesterolemia.
Sujetos y métodos
Sujetos y diseño del estudio
El polimorfismo –394T>C del gen
CRABP2
y su influencia en
la dislipemia se ha estudiado en 3 poblaciones independientes:
varones sanos, pacientes infectados por el VIH y pacientes FH.
Varones sanos: 299 varones sanos, con edades comprendi-
das entre los 20 y los 75 años, participantes del estudio eu-
ropeo VITAGE
12
. Los criterios de exclusión aplicados son los
descritos en el protocolo SENIEUR
13
.
Pacientes con infección por el VIH: 182 pacientes infectados
por el VIH, varones y mujeres, mayores de 18 años, sin enfer-
medades oportunistas asociadas al sida al inicio del estudio
14,15
.
Pacientes HF: 151 individuos con diagnóstico clínico (MEDPED)
y genético de HF. En el diagnóstico genético se utilizó el Lipo-
chip
®
, que permite caracterizar las mutaciones en el gen
LDLR
16
.
Ninguno de los pacientes FH eran portadores de mutaciones en
el gen
apo B
causantes de la apo B defectuosa familiar.
El Comité de Ética e Investigación del Hospital Sant Joan
de Reus aprobó el estudio. Todos los participantes dieron su
consentimiento informado.
Determinaciones lipídicas
Las medidas se realizaron en estado basal, y en los pacientes
con infección por el VIH de forma cuatrimestral durante 1 año
de seguimiento. Los valores lipídicos utilizados en este estudio
son los registrados antes de iniciar tratamiento hipolipemiante.
La extracción de sangre se realizó tras ayuno de 12 h. El co-
lesterol total y los triglicéridos en plasma y en la fracciones li-
poproteicas se midieron mediante equipos enzimáticos (Boeh-
ringer Mannheim, Alemania) adaptados para un analizador
Cobas Mira Centrifugal (Roche Pharmaceuticals, Suiza) con
Precilip EL
®
y Precinorm
®
(Boehringer Mannheim, Alemania)
como controles de calidad. Las apolipoproteínas (apo) se mi-
dieron por inmunoturbidimetría, utilizando antisuero para
apo AI y apo B (Boehringer Mannheim, Alemania), para apo E
y apo CIII (Daiichi Chemicals, Japón) y para lipoproteína (a)
(Lp[a]) (Incstar Corporation, EE.UU.).
Ultracentrifugación secuencial
Las lipoproteínas plasmáticas se separaron mediante ultra-
centrifugación secuencial utilizando un rotor de ángulo fijo
45,6 Kontron y una Centrikon 75 (Kontron Instruments, Ita-
lia). Las fracciones lipoproteicas separadas fueron lipoproteí-
nas de muy baja densidad (densidad [d] < 1.006 g/ml), lipopro-
teínas de densidad intermedia (d = 1.006-1.019 g/ml) y
lipoproteínas de muy baja densidad (LDL) (d = 1.019-1.063
g/ml). El colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad
(cHDL) se midió tras la precipitación de las lipoproteínas ricas
en apo B con polietilenglicol (Immuno AG, Austria). El coles-
terol unido a LDL (cLDL) se calculó mediante la fórmula de
Friedewald.
Genotipado
El ácido desoxirribonucleico (ADN) se aisló de 10 ml de
sangre recogida en un tubo con EDTA por método estándar.
El polimorfismo –394T>C del gen
CRABP2
se determinó
mediante una nueva variante de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) introducida por Hamajima et al
17
, la PCR-
CTPP (del inglés
polymerase chain reaction with confronting
two pair primers
). La técnica permite la detección de un poli-
morfismo mediante 2 parejas de
primers
sin otro paso poste-
rior, como la restricción enzimática. Tras la amplificación se
obtienen bandas de ADN específicas de cada alelo con tama-
ños diferentes, que permite el genotipado por electroforesis.
El ADN se amplificó mediante la enzima AmpliTaq Gold
TM
(Applied Biosystems, California, EE.UU.) en un volumen de re-
acción final de 10 μl que contenía 0,2 mM de dNTPs, 0,5 μM de
cada
primer
, 5% de dimetilsulfóxido y 1 mM de cloruro de mag-
nesio. Los
primers
para el alelo T fueron: F1: 5’-CCGTT GCCT-
CACTTAGATCC-3’ y R1: 5’-CGGACACCTGGCGACCCCA-3’ am-
plificando una banda de 164 pb; y para el alelo C fueron: F2:
5’-GGGGT CCGCCTGCGGGC-3’ y R2: 5’-GCCTTCTCCTGC
GCTAGTAA-3’ amplificando una banda de 237 pb. Una banda no
específica de 366 pb se amplifica con los
primers
F1 y R2. La
reacción se llevó a cabo en un termociclador Perkin Elmer, y las
condiciones fueron: desnaturalización a 94 ºC durante 5 min,
9 ciclos de 94 ºC durante 30 s, hibridación durante 30 s (la tempe-
ratura disminuye 1 ºC cada ciclo, de 63 a 55 ºC), 72 ºC durante
30 s, seguido de 31 ciclos de 94 ºC durante 30 s, 55 ºC durante 30 s,
72 ºC durante 30 s y una extensión final a 72 ºC durante 7 min.
Los fragmentos se separaron por electroforesis en poliacrilamida
al 12%. Como controles positivos, se utilizaron un homocigoto
para el alelo C y un heterocigoto analizados por secuenciación
en un ABI PRISM 310 (Applied Biosystems, California, EE.UU.).
Análisis estadístico
El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el paquete es-
tadístico SPSS versión 13.0 para Windows. Las variables cuan-
titativas se presentan como medias con las desviaciones están-
dar entre paréntesis, o como porcentajes. El efecto del genotipo
sobre la variación de los lípidos y lipoproteínas se analizó me-
diante ANOVA, ajustando por sexo, edad, índice de masa corpo-
ral (IMC) y uso de IP (en pacientes con infección por el VIH).
Con el test

2
se comprobó que las frecuencias alélicas observa-
das fueran las esperadas según la ley de equilibrio de Hardy
Weinberg. El efecto del genotipo en los valores de colesterol du-
rante el año de seguimiento en los pacientes con infección por
el VIH se analizó utilizando ANOVA de medidas repetidas. Se
estableció un nivel de significación estadística de p < 0,05.
Resultados
Varones sanos
La frecuencia genotípica fue del 6% y la alélica,
del 0,03. Ningún individuo era homocigoto para el
alelo C. Tras ajustar por edad e IMC, los portadores
del alelo C presentaban un 9% más de colesterol to-
tal (p = 0,027) y un 13% más de cLDL (p = 0,020)
SALAZAR J ET AL. ASOCIACIÓN ENTRE EL GEN DE LA
CELLULAR RETINOIC ACID BINDING PROTEIN (CRABP2)
Y VALORES ELEVADOS DE COLESTEROL
UNIDO A LIPOPROTEÍNAS DE BAJA DENSIDAD
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