candidatos como moduladores de la dislipemia
9,10
.
En un trabajo anterior, nuestro grupo identificó
una nueva variante en la región promotora del gen
CRABP2
, el polimorfismo –394T>C
11
. En el presen-
te estudio, mediante el uso de este marcador, mos-
tramos una relación entre el gen
CRABP2
y la disli-
pemia en individuos sanos y en individuos con
diferentes condiciones hiperlipémicas. Nuestros re-
sultados muestran que el alelo C está asociado con
concentraciones de cLDL significativamente eleva-
das en individuos sanos, en pacientes con infección
por el VIH y en pacientes con hipercolesterolemia
familiar (FH), y que el alelo C está sobrerrepresen-
tado en individuos con hipercolesterolemia.
Sujetos y métodos
Sujetos y diseño del estudio
El polimorfismo –394T>C del gen
CRABP2
y su influencia en
la dislipemia se ha estudiado en 3 poblaciones independientes:
varones sanos, pacientes infectados por el VIH y pacientes FH.
Varones sanos: 299 varones sanos, con edades comprendi-
das entre los 20 y los 75 años, participantes del estudio eu-
ropeo VITAGE
12
. Los criterios de exclusión aplicados son los
descritos en el protocolo SENIEUR
13
.
Pacientes con infección por el VIH: 182 pacientes infectados
por el VIH, varones y mujeres, mayores de 18 años, sin enfer-
medades oportunistas asociadas al sida al inicio del estudio
14,15
.
Pacientes HF: 151 individuos con diagnóstico clínico (MEDPED)
y genético de HF. En el diagnóstico genético se utilizó el Lipo-
chip
®
, que permite caracterizar las mutaciones en el gen
LDLR
16
.
Ninguno de los pacientes FH eran portadores de mutaciones en
el gen
apo B
causantes de la apo B defectuosa familiar.
El Comité de Ética e Investigación del Hospital Sant Joan
de Reus aprobó el estudio. Todos los participantes dieron su
consentimiento informado.
Determinaciones lipídicas
Las medidas se realizaron en estado basal, y en los pacientes
con infección por el VIH de forma cuatrimestral durante 1 año
de seguimiento. Los valores lipídicos utilizados en este estudio
son los registrados antes de iniciar tratamiento hipolipemiante.
La extracción de sangre se realizó tras ayuno de 12 h. El co-
lesterol total y los triglicéridos en plasma y en la fracciones li-
poproteicas se midieron mediante equipos enzimáticos (Boeh-
ringer Mannheim, Alemania) adaptados para un analizador
Cobas Mira Centrifugal (Roche Pharmaceuticals, Suiza) con
Precilip EL
®
y Precinorm
®
(Boehringer Mannheim, Alemania)
como controles de calidad. Las apolipoproteínas (apo) se mi-
dieron por inmunoturbidimetría, utilizando antisuero para
apo AI y apo B (Boehringer Mannheim, Alemania), para apo E
y apo CIII (Daiichi Chemicals, Japón) y para lipoproteína (a)
(Lp[a]) (Incstar Corporation, EE.UU.).
Ultracentrifugación secuencial
Las lipoproteínas plasmáticas se separaron mediante ultra-
centrifugación secuencial utilizando un rotor de ángulo fijo
45,6 Kontron y una Centrikon 75 (Kontron Instruments, Ita-
lia). Las fracciones lipoproteicas separadas fueron lipoproteí-
nas de muy baja densidad (densidad [d] < 1.006 g/ml), lipopro-
teínas de densidad intermedia (d = 1.006-1.019 g/ml) y
lipoproteínas de muy baja densidad (LDL) (d = 1.019-1.063
g/ml). El colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad
(cHDL) se midió tras la precipitación de las lipoproteínas ricas
en apo B con polietilenglicol (Immuno AG, Austria). El coles-
terol unido a LDL (cLDL) se calculó mediante la fórmula de
Friedewald.
Genotipado
El ácido desoxirribonucleico (ADN) se aisló de 10 ml de
sangre recogida en un tubo con EDTA por método estándar.
El polimorfismo –394T>C del gen
CRABP2
se determinó
mediante una nueva variante de la reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) introducida por Hamajima et al
17
, la PCR-
CTPP (del inglés
polymerase chain reaction with confronting
two pair primers
). La técnica permite la detección de un poli-
morfismo mediante 2 parejas de
primers
sin otro paso poste-
rior, como la restricción enzimática. Tras la amplificación se
obtienen bandas de ADN específicas de cada alelo con tama-
ños diferentes, que permite el genotipado por electroforesis.
El ADN se amplificó mediante la enzima AmpliTaq Gold
TM
(Applied Biosystems, California, EE.UU.) en un volumen de re-
acción final de 10 μl que contenía 0,2 mM de dNTPs, 0,5 μM de
cada
primer
, 5% de dimetilsulfóxido y 1 mM de cloruro de mag-
nesio. Los
primers
para el alelo T fueron: F1: 5’-CCGTT GCCT-
CACTTAGATCC-3’ y R1: 5’-CGGACACCTGGCGACCCCA-3’ am-
plificando una banda de 164 pb; y para el alelo C fueron: F2:
5’-GGGGT CCGCCTGCGGGC-3’ y R2: 5’-GCCTTCTCCTGC
GCTAGTAA-3’ amplificando una banda de 237 pb. Una banda no
específica de 366 pb se amplifica con los
primers
F1 y R2. La
reacción se llevó a cabo en un termociclador Perkin Elmer, y las
condiciones fueron: desnaturalización a 94 ºC durante 5 min,
9 ciclos de 94 ºC durante 30 s, hibridación durante 30 s (la tempe-
ratura disminuye 1 ºC cada ciclo, de 63 a 55 ºC), 72 ºC durante
30 s, seguido de 31 ciclos de 94 ºC durante 30 s, 55 ºC durante 30 s,
72 ºC durante 30 s y una extensión final a 72 ºC durante 7 min.
Los fragmentos se separaron por electroforesis en poliacrilamida
al 12%. Como controles positivos, se utilizaron un homocigoto
para el alelo C y un heterocigoto analizados por secuenciación
en un ABI PRISM 310 (Applied Biosystems, California, EE.UU.).
Análisis estadístico
El análisis estadístico se llevó a cabo utilizando el paquete es-
tadístico SPSS versión 13.0 para Windows. Las variables cuan-
titativas se presentan como medias con las desviaciones están-
dar entre paréntesis, o como porcentajes. El efecto del genotipo
sobre la variación de los lípidos y lipoproteínas se analizó me-
diante ANOVA, ajustando por sexo, edad, índice de masa corpo-
ral (IMC) y uso de IP (en pacientes con infección por el VIH).
Con el test
2
se comprobó que las frecuencias alélicas observa-
das fueran las esperadas según la ley de equilibrio de Hardy
Weinberg. El efecto del genotipo en los valores de colesterol du-
rante el año de seguimiento en los pacientes con infección por
el VIH se analizó utilizando ANOVA de medidas repetidas. Se
estableció un nivel de significación estadística de p < 0,05.
Resultados
Varones sanos
La frecuencia genotípica fue del 6% y la alélica,
del 0,03. Ningún individuo era homocigoto para el
alelo C. Tras ajustar por edad e IMC, los portadores
del alelo C presentaban un 9% más de colesterol to-
tal (p = 0,027) y un 13% más de cLDL (p = 0,020)
SALAZAR J ET AL. ASOCIACIÓN ENTRE EL GEN DE LA
CELLULAR RETINOIC ACID BINDING PROTEIN (CRABP2)
Y VALORES ELEVADOS DE COLESTEROL
UNIDO A LIPOPROTEÍNAS DE BAJA DENSIDAD
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Clin Invest Arterioscl. 2008;20(2):48-54