En la actualidad asistimos a un progresivo aumento de aislamientos de microorganismos con patrones de multirresistencia y aun de panresistencia. Fosfomicina (FO) es un antimicrobiano activo frente a una gran variedad de microorganismos, incluyendo cepas de Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), que es susceptible de actuar sinérgicamente con otras moléculas.
MétodosEl objetivo de este estudio consiste en evaluar la actividad in-vitro de FO frente a 120 cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos, utilizando un método de dilución en agar y otro de difusión en gradiente y, además, explorar, mediante el método de E-test y curvas de muerte, la posible sinergia de FO/amikacina y FO/ciprofloxacino, asociaciones potencialmente eficaces frente a P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos.
ResultadosPara FO, partiendo de los valores de corte epidemiológicos (ECOFF) que publica European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), más de las 3 cuartas partes de las cepas serían susceptibles de poder ser tratadas con este antimicrobiano, especialmente en combinación con otro agente. La asociación FO/ciprofloxacino presentó un efecto sinérgico en casi la mitad de los aislamientos (40%), mientras que la asociación FO/amikacina solo alcanzó este efecto sinérgico en el 12% de los casos.
ConclusiónLa aparición de cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos hace necesaria la valoración de tratamientos combinados. Este trabajo sugiere que la combinación FO/ciprofloxacino puede ser útil, presentando un efecto sinérgico en el 40% de los aislamientos estudiados.
The increase in microorganisms showing patterns of multi-drug resistance or even pan-drug resistance is of growing concern. Fosfomycin (FO) is well known to be active against a wide variety of microorganisms, including highly resistant strains of Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), and can also synergistically act with other molecules.
MethodsThis study examines the in vitro activity shown by FO against 120 strains of carbapenem-resistant P. aeruginosa using an agar dilution and a gradient diffusion test. Possible synergistic effects of the combinations of FO/amikacin and FO/ciprofloxacin were also examined using E-test and time-kill techniques.
ResultsAccording to the epidemiological cut-off value (ECOFF) issued by the European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST), our results indicate that over three-quarters of the strains tested would be susceptible to FO treatment, especially if combined with another antimicrobial. The FO/ciprofloxacin combination had a synergistic effect on 40% of the clinical isolates, while for FO/amikacin this effect was only observed in 12% of the isolates.
ConclusionThe appearance of carbapenem-resistant P. aeruginosa strains requires the evaluation by combination therapy. This report suggests that the FO/ciprofloxacin combination can be useful, showing a synergistic effect in 40% of the isolates.
Desde hace, al menos, una década venimos asistiendo a un progresivo y preocupante aumento de aislamientos de microorganismos con patrones de multirresistencia, y aun de panresistencia, especialmente en algunos bacilos gramnegativos no fermentadores tan estrechamente relacionados con enfermedades infecciosas en el hombre como Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa)1.
La rápida diseminación de estas bacterias, y su implantación en determinadas áreas del hospital o en instituciones de cuidados de larga duración, no se ha correspondido con el desarrollo de nuevas moléculas activas frente a estos microorganismos por lo que el «redescubrimiento» de antiguas, y en ocasiones, relegados fármacos, tanto individualmente como formando parte de distintas asociaciones, constituye un capítulo de exploración de plena vigencia2,3.
En esta línea, la fosfomicina (FO), un antibacteriano que inhibe la formación del peptidoglicano bacteriano, resulta un antimicrobiano activo frente a una gran variedad de microorganismos, incluyendo cepas de P. aeruginosa, sin mostrar resistencia cruzada con otros antibacterianos y siendo susceptible de actuar sinérgicamente con otras moléculas4. Sin embargo, la principal limitación para el uso de FO en el tratamiento de infecciones sistémicas por P. aeruginosa es la aparición de resistencia durante la terapia, relacionada con la alta frecuencia de mutaciones observada en diferentes estudios «in-vitro»5,6, aunque se ha demostrado que esta limitación puede ser evitada utilizando FO en combinación con otras moléculas, consiguiendo, por otra parte, una actividad antibacteriana sinérgica7.
El objetivo de este estudio consistió, en primer lugar, en valorar la actividad in-vitro de FO frente a 120 cepas procedentes de aislamientos clínicos de cepas de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos utilizando un método de dilución en agar, considerado el método de referencia, comparándolo con la difusión en gradiente (E-Test, BioMerieux, Francia) para evaluar la correlación entre los 2 procedimientos, y, en segundo lugar, explorar la posible sinergia de fosfomicina/amikacina (FO/AK) y fosfomicina/ciprofloxacino (FO/CIP), asociaciones potencialmente eficaces frente a P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos.
Material y métodosSe estudiaron un total de 120 cepas no duplicadas de P. aeruginosa procedentes de diferentes aislamientos clínicos, presumiblemente no relacionados clonalmente (secreciones respiratorias, abscesos y úlceras cutáneas, etc.) de otros tantos pacientes, enviados al laboratorio de Microbiología de nuestro hospital durante 2012-2013, cuyas concentraciones mínimas inhibitorias (CMI) de imipenem y meropenem obtenidas por microdilución eran, para ambos antimicrobianos, ≥8mg/L. Los mecanismos de resistencia (mutaciones en porinas, hiperexpresión de bombas de expulsión, hiperproducción de otras enzimas) probablemente múltiples, no incluyeron la producción de carbapenemasas en ninguna cepa, al menos detectables, utilizando métodos fenotípicos. Los microorganismos fueron identificados mediante pruebas convencionales y posteriormente refrendados mediante espectrometría (MALDI-TOF, BioMerieux, Francia) y conservados en leche descremada a −70°C hasta el inicio del estudio.
La sensibilidad frente a FO, AK y CIP se llevó a cabo mediante difusión en gradiente (E-Test, BioMerieux, Francia) y mediante dilución en agar siguiendo los procedimientos y criterios descritos por el Clinical and Laboratory Standards Institute8.
La categorización de sensibilidad para FO se estableció a partir del punto de corte epidemiológico ECOFF que establece el European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST)9.
Para los experimentos con combinaciones de antimicrobianos se escogieron aleatoriamente 25 cepas de la serie, procedentes todas ellas de secreciones respiratorias, obtenidas de pacientes con ventilación mecánica o bronquiectasias y en ningún caso pacientes con fibrosis quística. Estas cepas fueron seleccionadas por presentar un patrón de resistencia más elevado frente a los antipseudomónicos más empleados en el tratamiento.
Las pruebas de sinergia antimicrobiana fueron realizadas empleando el método E-test a partir de las CMI obtenidas para FO, AK y CIP10. Las combinaciones probadas fueron: FO más AK y FO más CIP. Las CMI para cada combinación se interpretaron: a) valorando las diferencias de los valores obtenidos para cada antimicrobiano comparándolos con los de la combinación de ambos, sugiriendo un efecto sinérgico cuando la CMI de la combinación era 2 o más diluciones más baja que la CMI del antimicrobiano más activo individualmente, y b) mediante el cálculo del índice fraccional de concentración inhibitoria (IFCI)=(CMI de FO en combinación/CMI de FO sola)+(CMI del otro antibiótico en combinación/CMI del otro antibiótico solo). Se interpretó como efecto sinérgico cuando el IFCI era≤0,5; se consideró como efecto aditivo si los resultados del IFCI oscilaban entre>0,5-1; valores entre >1 y ≤4 indicaron indiferencia y valores>4 denotaban antagonismo entre los antimicrobianos probados. Los estudios se realizaron por triplicado y se eligieron los valores medios obtenidos en las 3 lecturas.
En aquellas cepas en las que los resultados por E-test sugerían sinergia para alguna de las 2 combinaciones se determinaron las curvas de tiempo-muerte correspondientes. Estos últimos experimentos se llevaron a cabo a partir de concentraciones iguales a las CMI correspondientes a cada antimicrobiano. Brevemente, los cultivos en caldo Mueller-Hinton se inocularon con 5×105 de cada microorganismo estudiado, realizándose las lecturas a las 0, 4, 6, 8 y 24h. El recuento bacteriano se realizó transfiriendo 100μl de cada dilución para conocer las unidades formadoras de colonias (UFC) en cada uno de los tiempos establecidos. Estos subcultivos se incubaron 18-24h a 35°C. Un efecto sinérgico se definió como una disminución en, al menos, 2log10 UFC/ml sobre el fármaco más activo. Un efecto indiferente se consideró con+−1log10 UFC/ml comparado con el más activo y un efecto antagónico cuando el crecimiento fue>1log10 UFC/ml en relación con el agente menos activo.
ResultadosEn la tabla 1 se recogen los intervalos, las CMI50 y las CMI90 de FO y del resto de los antipseudomónicos estudiados frente a los 120 aislamientos de P. aeruginosa resistentes a carbapenémicos obtenidos. Estos resultados se expresan tanto para el método de difusión en gradiente como para la dilución en agar.
| E-test | Dilución en agar | |||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Intervalo | CMI50 | CMI90 | % de resistencia | Intervalo | CMI50 | CMI90 | % de resistencia | |
| Imipenem | 16-≥64 | ≥64 | ≥64 | 100 | 8-≥64 | ≥64 | ≥64 | 100 |
| Meropenem | 8-≥64 | ≥64 | ≥64 | 100 | 8-≥64 | ≥64 | ≥64 | 100 |
| Amikacina | 8-≥512 | 16 | 64 | 21,6 | 4-≥512 | 16 | 64 | 12,5 |
| Ciprofloxacina | 0,5-≥64 | ≥64 | ≥64 | 65 | 0,2-≥64 | 32 | ≥64 | 65 |
| Fosfomicina | ≤2-≥1024 | 32 | ≥512 | 22,5 | ≤2-≥512 | 16 | ≥512 | 22,5 |
Aplicando el valor ECOFF sugerido por EUCAST para FO, el porcentaje de resistencia obtenido con los 2 métodos probados fue del 22,5%. Asimismo de las 120 cepas estudiadas por dilución en agar, un 65% fueron resistentes a CIP y un 12,5% a AK (fig. 1).
Entre ambos métodos existió desacuerdo en la categorización con los resultados obtenidos para AK, ya que mediante el método de dilución en agar se consideraron resistentes el 12,5% de las cepas, mientras que con el método de difusión esta cifra ascendía hasta el 21,6%. No existieron diferencias en la categorización ni para FO ni para CIP.
En la tabla 2 se exponen los resultados referidos a los experimentos con combinaciones de antimicrobianos mediante E-test de las 25 cepas seleccionadas aleatoriamente. En 12 de las cepas estudiadas se advirtió un efecto sinérgico para alguna de las 2 combinaciones ensayadas y en una de ellas se observó sinergia para las 2 combinaciones probadas. El efecto sinérgico fue más frecuente entre FO/CIP (40%) que entre FO/AK (12%). Las curvas de muerte corroboraron estos mismos resultados tal y como se exponen en la citada tabla.
Estudio de sinergia para 25 cepas de Pseudomonas aeruginosa resistentes a carbapenémicos procedentes de secreciones respiratorias mediante E-test y curvas de muerte
| Combinaciones | Sinergia | Efecto aditivo | Indiferencia |
|---|---|---|---|
| Ciprofloxacino+fosfomicina | 10 (40%) | 2 (8%) | 13 (52%) |
| Amikacina+fosfomicina | 3 (12%) | - | 22 (88%) |
Entre las cepas en las que se observó sinergia para la combinación FO+CIP, las CMI de cada uno de los antibióticos oscilaron entre 2 y ≥1.024 para FO, considerándose por encima del ECOFF 3 de las 12 cepas estudiadas (25%), de forma similar al conjunto de la colección (22,5%), mientras que para CIP el 70% fueron resistentes versus el 65% de la colección. Para AK las 3 cepas con sinergia observada eran resistentes al mismo (100%).
DiscusiónEn nuestra serie, y considerando el ECOFF de EUCAST para FO, más de las 3 cuartas partes de las cepas (77,5%) presentan un fenotipo salvaje, y pudieran ser susceptibles de tratamiento con FO, preferiblemente en combinación con otro agente, para evitar la posible aparición de resistencias durante el tratamiento sistémico.
En cuanto a la categorización de la sensibilidad con los 2 métodos probados, observamos discrepancias para AK, obteniéndose porcentajes de resistencia del 12,5% para dilución en agar y del 21,6% para E-test. Sin embargo, y a diferencia de otros autores10, estas discrepancias en la categorización no se objetivaron en nuestra serie para CIP y para FO, aunque para este último es necesario precisar desde qué punto de corte establecemos la citada categorización, al no existir límites de resistencia bien definidos, teniendo que acudir, por ejemplo, a los valores ECOFF que publica EUCAST11.
Entre las asociaciones probadas previamente con referencia a FO, la combinación con CIP ha ofrecido uno de los valores de IFCI más bajos, relacionándose con una elevada actividad sinérgica entre ambos antimicrobianos12. Por otra parte y teniendo en cuenta el alto nivel de resistencia que presentaron las cepas seleccionadas a la mayoría de los antibióticos testados, AK es el antimicrobiano en el que observamos un menor grado de resistencia. Por ello las asociaciones elegidas en este estudio fueron FO-CIP y FO-AK.
En este sentido, nosotros encontramos que, empleando una técnica de gradiente de difusión, y valorando el IFCI, 10 de 25 cepas (40%) tenían valores para FO-CIP que oscilaban entre 0,25 y 0,5 indicativos de sinergia, mientras que en las 15 restantes se observaban valores compatibles con un efecto aditivo en 2 cepas, siendo el resto de los experimentos sugerentes de indiferencia para la asociación. No se produjo en ningún caso un efecto de antagonismo (tabla 2).
Entre estas mismas 25 cepas observamos sinergia con la combinación FO-AK para 3 de ellas (12%) en una de las cuales se observaba este efecto sinérgico para las 2 combinaciones ensayadas.
Finalmente, en los 13 casos (10 para FO/CIP y 3 para FO/AK) en los que la combinación de gradientes sugería un efecto sinérgico se llevaron a cabo curvas de muerte para asegurar los resultados, confirmándose los mismos en todos los casos, lo que incide en la adecuada valoración del método asociativo de difusión siempre que se realice cuidadosamente.
La combinación de FO con otros antimicrobianos es un dato frecuentemente citado en la literatura de los últimos años. Concretamente los resultados obtenidos frente a P. aeruginosa tienen especial protagonismo12,13. En una revisión relativamente reciente de las series publicadas14 se citan 13 estudios que hacen referencia a la posible sinergia entre FO y otros antibióticos frente a este microorganismo. De ellos se deduce la posibilidad de contemplar mecanismos sinérgicos desde el 27%15 hasta el 78,4%16 con la asociación con CIP. En nuestra serie obtuvimos un porcentaje intermedio en relación con los resultados de las diferentes series, considerando que en casi la mitad de los aislamientos (40%) podría establecerse este efecto para la combinación de ambos antimicrobianos.
En cuanto a AK, también los datos expuestos en la literatura ofrecen una amplia variedad de resultados, desde la imposibilidad de obtener ningún tipo de efecto sinérgico17 hasta el 66,7%18, dejando de lado otros resultados más puntuales12,19. Nuestros resultados también muestran un escaso número de cepas en las que se observe sinergia para esta combinación (12%), por lo que a la hora de trasladarlos a esquemas de tratamiento empírico en las infecciones ocasionadas por este tipo de microorganismos no parece una asociación prometedora. Naturalmente, lo heterogéneo de las metodologías empleadas en las diferentes series tanto en cuanto a los microorganismos estudiados (origen, perfil de resistencias u otro tipo de selección) como a las técnicas ensayadas (tablero de ajedrez, curvas de muerte, IFCI) e incluso la variabilidad de los puntos de corte elegidos para FO dificultan el establecimiento de conclusiones sólidas a este respecto.
Un último punto de gran importancia debe también ser tenido en cuenta, y es el referente a la dificultad de trasladar estos resultados obtenidos en el laboratorio a la práctica clínica ya que existen diferentes interpretaciones acerca del valor clínico de los mismos, siendo este punto objeto de controversia en la literatura20.
En cualquier caso, y no obstante todo lo anterior, la obtención de algunos de estos resultados obligan a continuar líneas de investigación al respecto, ensayando otras combinaciones distintas que incluyan colistina e incluso alguno de los propios carbapenémicos, sobre todo teniendo en cuenta algo en lo que sí existe un consenso unánime, esto es, la escasez de alternativas terapéuticas disponibles para el manejo de estos pacientes colonizados o infectados por este tipo de microorganismos.
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener conflictos de intereses.
