Las micobacterias atípicas o no tuberculosas (MNT) son microorganismos ubicuos en el medio ambiente y, aunque la mayoría no son patógenas, pueden comportarse como oportunistas asociándose a infecciones pulmonares, de piel y de tejidos blandos, e incluso diseminadas cuando existen condiciones predisponentes1,2. El número de especies descritas aumenta constantemente, si bien los aislamientos en muestras clínicas suelen corresponder a un número limitado de especies. Existen grupos de estudio que intentan aclarar la relevancia clínica de estos aislamientos1 y mejorar las técnicas de identificación y las pruebas de sensibilidad2–4. La identificación de las micobacterias a nivel de especie ha sido tradicionalmente un procedimiento lento y complicado, en especial para las MNT. Las pruebas bioquímicas convencionales y la cromatografía han dado paso en las últimas décadas a diferentes métodos de biología molecular que han facilitado el proceso de identificación. Entre los sistemas desarrollados en los últimos años, las tiras de nitrocelulosa con sondas de DNA que hibridan con un producto de PCR han permitido que la identificación de un determinado número de MNT esté actualmente al alcance de muchos laboratorios: INNO LiPA® Mycobacteria (Innogenetics, Ghent, Bélgica) permite identificar 16 especies y GenoType® Mycobacterium CM/AS (Hain Lifescience, Nehren, Alemania) 35 especies o complejos5,6. Con este mismo principio se ha comercializado recientemente un nuevo y sencillo test para identificar las especies más comunes aisladas en muestras clínicas: Speed-oligo® Mycobacteria (Vircell, Granada, España), evaluado recientemente por Montiel Quezel-Guerraz et al. (2010)7 y Hoffmann-Thiel et al. (2011)8.
El objetivo de este estudio es evaluar los resultados obtenidos en nuestro laboratorio en la identificación de MNT aisladas en muestras clínicas con la técnica de Speed-oligo Mycobacteria, comparándolos con la identificación realizada en los mismos cultivos en el Laboratorio de Referencia (Hospital Costa del Sol, Marbella) mediante la técnica Genotype Mycobacterium CM/AS (Common Mycobacteria/Aditional Species).
Las discrepancias obtenidas entre ambos métodos se resolvieron con la colaboración del Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra de Granada mediante la secuenciación de los segmentos ITS (cebadores SP1 5′-ACCTCCTTTCTAAGGAGCACC-3′ y SP2 5′-GATGCTCGCAACCACTATCCA-3′) y 16S rRNA (cebadores 5’-GCGTGCTTAACACATGCAAGTC-3’ y
5′-TCCTCCTGATATCTGCGCATTC-3′)9,10. El test Speed-oligo Mycobacteria es un método basado en una PCR múltiple acoplada a un sistema de hibridación doble y reversa en tira de nitrocelulosa usando sondas unidas a oro coloidal y a la membrana. Es una técnica rápida (menos de 2h en total, con un tiempo de hibridación de 5min) que permite detectar simultáneamente el género Mycobacterium y hasta 12 especies distintas, algunas de ellas en forma de complejo: complejo M. tuberculosis, complejo M. avium-intracellulare-scrofulaceum (MAIS), complejo M. chelonae-abscessus, M. fortuitum, M. kansasii y M. gordonae5. El método GenoType CM/AS realiza una amplificación múltiple con primers marcados con biotina y una hibridación reversa6,7.
Se han estudiado de forma prospectiva 60 aislamientos de MNT obtenidos en medio de cultivo Bactec® MGIT 960, Becton-Dickinson (New Jersey, EE.UU.) correspondientes a 51 pacientes y diversos tipos de muestra (53 esputos, 3 broncoaspirados, 2 biopsias y 2 orinas). De los 60 aislados estudiados, 54 mostraron un resultado inicialmente concordante entre ambas técnicas: 23 del complejo MAIS (13M. avium, 9M. intracellulare y una M. scrofulaceum con la técnica GenoType), 10 del complejo M. chelonae-abscessus (7M. chelonae y 3M. abscessus por GenoType), 8M. gordonae, 6M. fortuitum, 3M. kansasii y una identificada como género Mycobacterium. Tres cepas fueron identificadas como M. lentiflavum mediante GenoType y como género Mycobacterium por Speed-oligo, que no identifica esta especie, por lo que consideramos estos resultados también como concordantes. En 6 aislamientos obtuvimos un resultado discrepante entre ambos métodos, 4 identificados por GenoType como M. fortuitum y 2 como M. chelonae (ambas del mismo paciente) y todas como género Mycobacterium por Speed-oligo. En estos casos se repitió la técnica Speed-oligo con el doble de volumen de medio de cultivo MGIT positivo que el recomendado por el fabricante, con lo que se obtuvo un resultado válido y concordante con GenoType en 2 de ellas (M. fortuitum en ambos casos). La concordancia entre ambos métodos fue inicialmente del 90,0% (54/60) y del 93,3% (56/60) al repetir los test con mayor volumen de muestra. La secuenciación de los segmentos ITS 16-23 S rRNA y 16S rRNA9,10 de las cepas discrepantes proporcionó un resultado concordante con las identificaciones a nivel de género de Speed-oligo (tabla 1). M. mageritense fue identificado con un 100% de homología con la secuenciación 16S rRNA; la secuenciación de la región ITS dio como resultado M. fortuitum con una homología del 92%, probablemente por una reacción cruzada, ya que no está descrita su secuenciación por este método.
Comparación de cepas discrepantes entre Speed-oligo y Genotype
| Speed-oligo® | Genotype® | Secuenciación ITS | Secuenciación 16S rRNA |
| Mycobacterium sp. | M. fortuitum | M. lentiflavum | M. lentiflavum |
| AF318174.1 | GU142924.1 | ||
| Mycobacterium sp. | M. fortuitum | M. fortuitum | M. mageritense |
| AM709726.1 | HQ214129.1 | ||
| Mycobacterium sp. | M. chelonaea | M. lentiflavum | M. lentiflavum |
| AF318174.1 | GU142924.1 |
Aunque el número de cepas estudiado es pequeño, estos resultados parecen indicar que la técnica Speed-oligo Mycobacteria es capaz de identificar correctamente todas las micobacterias que incluye el test, si bien en ocasiones puede ser necesario aumentar el inóculo para obtener un resultado válido. Las principales ventajas de esta técnica es que permite una identificación rápida, válida y coste-efectiva de las especies más frecuentes de micobacterias aisladas en muestras clínicas. El test empleado tenía una menor capacidad discriminativa respecto a Genotype en determinados complejos como M. avium-intracellulare-scrofulaceum (MAIS) y M. chelonae-abscessus, pero debido a la importancia de identificar las especies asociadas con más frecuencia a patología como M. abscessus o M. scrofulaceum, recientemente se ha rediseñado el test, pudiendo ahora individualizarse las especies de dichos complejos, e incluso se han añadido nuevas especies para detectar (M. marinum, M. xenopi, M. malmoense, M. peregrinum), encontrándose actualmente pendiente de evaluación.
A la Dra. Natalia Montiel Quezel-Guerraz, del Centro de Referencia de Micobacterias, Servicio de Microbiología, Hospital Costa del Sol (Marbella, Málaga, España), por su colaboración. Al Servicio de secuenciación del Instituto de Parasitología y Biomedicina López-Neyra de Granada por la generación de los archivos de secuenciación que ayudaron a resolver las discrepancias en la identificación. Y a Laboratorios Vircell por el suministro gratuito de los reactivos.
