Utilización de diferentes técnicas de biología molecular integradas en un algoritmo de identificación de micobacterias no tuberculosas

Resumen

Introducción

El objetivo del presente trabajo fue demostrar la utilidad de un algoritmo de identificación de micobacterias no tuberculosas (MNT) que integra diferentes técnicas de biología molecular y características fenotípicas básicas. Además se ha realizado una actualización del algoritmo de interpretación del análisis del patrón de restrición de hsp65 (PRA hsp65).

Métodos

La manera elegida de trabajar consistió en la identificación mediante hibridación con sondas de ADN seguido de PRA hsp65 en aquellos aislados que no pudieron ser identificados mediante hibridación con sondas de ADN. En caso necesario se realizó secuenciación del 16S rDNA y hsp65.

Resultados

Se aislaron 236 MNT. De ellos, 102 (43,2%) aislados fueron identificados mediante hibridación con sondas de ADN y 76 (32,2%) mediante PRA hsp65. En los 58 (24,5%) aislados restantes se secuenció 16S rDNA, lo cual permitió la identificación de 53 (22,4%). Para 5 (2,1%) aislados se secuenció hsp65 y permitió la identificación de un aislado más. Cuatro (1,7%) aislados no pudieron ser identificados. Tres nuevos patrones de PRA hsp65 fueron encontrados. Siete aislamientos hibridaron con la sonda AccuProbe Mycobacterium avium complex Identification pero no lo hicieron con las sondas específicas de especie incluidas en el MAC. Cinco y 2 aislados fueron identificados como M. intracellulare y Mycobacterium colombiense, respectivamente.

Conclusión

Este esquema de trabajo nos permitió la identificación de casi todas las MNT encontradas en este estudio, incluyendo especies recientemente descritas.

Abstract

Introduction

The aim of the present work was to demonstrate the utility of a non-tuberculous mycobacteria (NTM) identification algorithm, which integrates different PCR-based techniques and basic phenotypic features. Moreover, the algorithm for pattern restriction analysis of hsp65 (hsp65 PRA) interpretation has been updated.

Methods

The workflow chosen consisted of the identification by a DNA hybridization probe method, followed by PCR-restriction enzyme analysis of hsp65 (hsp65 PRA) in those isolates that cannot be identified by hybridization probes. If necessary, 16S rRNA gene and hsp65 gene sequencing were used for speciation.

Results

A total of 236 NTM were collected, in which 102 (43.2%) isolates were identified by DNA specific probes and 76 (32.2%) isolates were identified with hsp65 PRA. Partial sequencing of the 16S rRNA gene was used for species identification of the remaining 58 (24.5%) isolates. Fifty-three (22.4%) were identified using this method. Five isolates (2.1%) were submitted for partial sequencing of hsp65 gene and one isolate was identified with this method. Four strains (1.7%) could not be identified at species level. Three new PRA patterns were found. Seven isolates tested positive with the AccuProbe Mycobacterium avium complex identification test but did not test positive with the M. avium or Mycobacterium intracellulare specific probes. Five and two of these isolates were identified as M. intracellulare and Mycobacterium colombiense, respectively.

Conclusion

This approach allowed us to identify almost all NTM isolates found in this study, including some recently described species.

Introducción

Las micobacterias no tuberculosas (MNT) cada vez son más reconocidas como patógenas en seres humanos¹. Los métodos fenotípicos para su identificación están bien establecidos y son económicos, pero tienen el inconveniente de que son tediosos y requieren personal especializado². La introducción, en las 2 últimas décadas, de distintas herramientas moleculares ha revolucionado el proceso de identificación al reducirse el tiempo necesario para llevarlo a cabo, además de ser imprescindibles para la caracterización de nuevas especies³. Los tests basados en la hibridación con sondas de ADN (AccuProbe, Gen-Probe) son rápidos, sensibles y fáciles de realizar pero cubren solo pocas especies. En 1989, Hance et al. propusieron un test basado en la amplificación de un fragmento del gen que codifica para la proteína del shock térmico de 65 KDa (hsp65) para detectar e identificar micobacterias a partir de muestras clínicas⁴. Después de éste, Telenti et al. desarrollaron un método basado en este gen para diferenciar micobacterias mediante el análisis del patrón de restricción (PRA)⁵. Desde entonces, este método ha sido utilizado por distintos autores^6,7, conduciendo a un algoritmo de identificación para 54 especies². Recientemente han sido descritos patrones adicionales^8,9. Los esquemas de trabajo basados en la secuenciación para detectar polimorfismos en el gen que codifica para el ARN ribosomal 16S (16S rDNA) han sido útiles para la identificación de MNT. De cualquier forma, hay poca variabilidad en el 16S rDNA en Mycobacterium spp., lo que hace a esta diana un pobre discriminador para especies muy relacionadas genéticamente como Mycobacterium abcessus y Mycobacterium chelonae¹⁰. El hsp65 es más polimórfico que el 16S rDNA. Kapur et al. fueron los primeros en secuenciar hsp65 para identificar micobacterias¹¹. Otros autores han demostrado la utilidad de la secuenciación parcial de hsp65 para identificar MNT¹².

El esquema de trabajo elegido en nuestro laboratorio consiste en la identificación de Mycobacterium sp. mediante hibridación con sondas de ADN (AccuProbe), seguido de PRA hsp65 en aquellos aislados que no pueden ser identificados mediante hibridación. Si el patrón obtenido no es concluyente utilizamos la secuenciación parcial de 16S rDNA y hsp65 para llegar a una identificación definitiva.

El motivo del presente trabajo es describir los resultados obtenidos utilizando este algoritmo de identificación durante un periodo de 5 años. También hemos actualizado el algoritmo de identificación mediante hsp65 PRA basado en su secuencia nucleotídica.

Métodos

Aislados de micobacterias no tuberculosas

En el Laboratorio de Microbiología Clínica del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona fueron recuperados 236 aislados clínicos de MNT durante el periodo 2002-2006. Solo se consideró un aislamiento por paciente. Los aislados fueron examinados al microscopio y subcultivados en medio de Löwenstein-Jensen para realizar los tests de velocidad de crecimiento, producción de pigmento y capacidad para crecer a diferentes temperaturas. La identificación mediante hibridación con sondas AccuProbe (Gen-Probe, San Diego, CA, EE. UU.) de Mycobacterium avium complex (MAC), M. avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium kansasii y Mycobacterium gordonae se realizó de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La sonda AccuProbe (MAC, M. kansasii y M. gordonae) fue elegida en función de las características fenotípicas. En caso de positividad para la sonda específica de MAC se procedió a la hibridación con las sondas específicas de M. avium y M. intracellulare. Este estudio no requirió aprobación por el comité ético del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau.

Extracción de ADN

El ADN genómico fue extraído mediante Instagene matrix siguiendo las instrucciones del fabricante (Bio-Rad, Glattbrugg, Suiza).

Análisis del patrón de restricción de hsp65 (hsp65 PRA)

Un fragmento de hsp65 fue amplificado y posteriormente digerido con BstEII y HaeIII (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) como describió Telenti et al.⁵ con las siguientes modificaciones: 15 μl de la reacción de amplificación fue añadida a una mezcla que contenía 1 μl (10 U/μl) de enzima, 3 μl de tampón de restricción específico (10X) y 11 μl de agua destilada. Las mezclas fueron incubadas durante 120 min a 60 °C para la digestión con BstEII y a 37 °C para la digestión con HaeIII. Los fragmentos obtenidos en la restricción fueron sometidos a electroforesis y los pesos de las bandas obtenidas fueron analizados con Bio Image System (Millipore, EE. UU.), con Marker VIII (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) y un marcador de 25 pares de bases (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) como estándares de peso molecular. En la digestión de HaeIII no se tuvieron en cuenta los fragmentos menores de 50 pb. Los patrones de PRA obtenidos fueron interpretados según el algoritmo publicado por Brunello et al.². Hemos utilizado este algoritmo debido a que los patrones de PRA obtenidos fueron validados mediante secuenciación.

Amplificación de 16S rDNA

La amplificación de 16S rDNA fue realizada utilizando iniciadores universales.

Secuenciación parcial de 16S rDNA (primeros 500 pares de bases) y hsp65

Los productos de PCR amplificados fueron purificados con High Pure PCR Product Purification Kit^® (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) según las instrucciones del fabricante. La secuenciación fue llevada a cabo en ambos sentidos con el método dideóxido con iniciadores fluorescentes (fmol DNA Cycle Sequencing System, Promega, Madison, EE. UU.) utilizando para ello un secuenciador de ADN (ALF, Pharmacia, Upsala, Suecia).

Análisis de las secuencias

Las secuencias nucleotídicas obtenidas fueron analizadas mediante el programa BLAST (www.ncbi.nlm.nhi.gov). Además, las secuencias nucleotídicas de 16S rDNA fueron analizadas con la base de datos de Ribosomal Differentiation of Medical Microorganisms (RIDOM) (http://www.ridom.de). Para los análisis de 16S rDNA y hsp65, la identificación de especie fue confirmada si la secuencia nucleotídica obtenida presentaba una homología ≥ 99,5%¹³ y ≥ 97%¹², respectivamente, con una secuencia depositada en las bases de datos públicas y publicada. El nuevo algoritmo basado en la secuenciación para interpretación del PRA hsp65 fue realizado de la siguiente manera. Los patrones de PRA que no estaban incluidos en el algoritmo publicado por Brunello et al.² fueron calculados in silico a partir de secuencias de hsp65 depositadas en GenBank con el programa LaserGene (DNASTAR 4.0, Madison, WI, EE. UU.). Los patrones de PRA estimados, basados en datos de la electroforesis, han sido incluidos cuando ninguna secuencia que correspondiera a ese patrón estaba depositada en GenBank. Algunos errores menores y cambios taxonómicos detectados en el algoritmo de Brunello et al.² fueron corregidos.

Números de acceso de las secuencias depositadas en GenBank

Las secuencias de hsp65 únicas determinadas en el presente trabajo han sido depositadas en GenBank con los números de acceso EU732652, EU732653 y EU732654.

Resultados

Durante el periodo de estudio se aislaron 236 MNT. Fenotípicamente, 134 (56,7%) aislados correspondieron a crecedores lentos pigmentados (PSG), 54 (22,8%) a crecedores lentos no pigmentados y 48 (20,3%) a crecedores rápidos. Dentro del grupo de PSG, 100 (74,6%) aislados fueron escotocromógenos y 34 (25,4%) fueron fotocromógenos.

Los resultados obtenidos con nuestro algoritmo de identificación se muestran en la figura 1. Un total de 102 (43,2%) aislados fueron identificados mediante hibridación con sondas de ADN (AccuProbe). En 134 aislados (56.8%) se realizó PRA hsp65. Fueron identificados mediante esta técnica 76 (32,2%) aislados. La secuenciación de 16S rDNA se realizó para la identificación de especie de los 58 (24,5%) aislados restantes. Un total de 53 (22,4%) fueron identificados con este método. En los 5 aislados no identificados mediante secuenciación de 16S rDNA, se realizó secuenciación de hsp65, identificándose un aislado como M. mucogenicum. Finalmente, 4 aislados no pudieron ser identificados y, en función de sus secuencias únicas de 16S rDNA y hsp65, probablemente correspondan a taxones no descritos. No se realizaron pruebas bioquímicas o de HPLC para estos 4 aislados no identificados.

Figura 1.

Resultados obtenidos con nuestro algoritmo de identificación de micobacterias no tuberculosas.

^aNúmero de aislados.

^bM. wolinskyi (1), M. alvei (1), M. lentiflavum (1), M. terrae (1), M. peregrinum (1), M. nonchromogenicum (1), M. celatum (1), M. kumamotonense (1) y M. sherrisii (1).

Un total de 7 aislados presentaban un resultado positivo para AccuProbe M. avium complex Identification Test pero no presentaban un resultado positivo con las sondas AccuProbe específicas de M. avium y M. intracellulare. Cinco de estos aislados fueron identificados mediante PRA como M. intracellulare pero los otros 2 aislados no presentaban un patrón de PRA incluido en el algoritmo de Brunello et al.². Estos 2 aislados fueron identificados mediante secuenciación de 16S rDNA como Mycobacterium colombiense.

Entre los 58 aislados que no pudieron ser identificados mediante hsp65 PRA, 48 presentaban patrones que no estaban incluidos en el algoritmo propuesto por Brunello et al.². Estos aislados fueron identificados mediante secuenciación de 16S rDNA como M. parascrofulaceum (n = 20), M. fortuitum (n = 13), M. mageritense (n = 2), M. colombiense (n = 2), M. arupense (n = 2), M. wolinskyi (n = 1), M. alvei (n = 1), M. lentiflavum (n = 1), M. terrae (n = 1), M. peregrinum (n = 1), M. nonchromogenicum (n = 1), M. celatum (n = 1), M. kumamotonense (n = 1) y M. sherrisii (n = 1). Cinco aislados presentaron un patrón de PRA específico de M. porcinum y M. septicum. Esta última especie no está incluida en el algoritmo de Brunello et al. pero es conocido que comparte el patrón de hsp65 PRA con M. porcinum^14,15. Tres de estos 5 aislados fueron identificados con secuenciación de 16S rDNA como M. porcinum y 2 aislados como M. septicum.

Los 5 aislados restantes no pudieron ser identificados mediante secuenciación del 16S rDNA. Cuatro aislados presentaban menos de un 99,5% de homología con alguna secuencia depositada en las bases de datos públicas y un aislado presentó un 100% de homología con la secuencias correspondientes a M. mucogenicum (GenBank accession number AF480586) y M. phocaicum (GenBank accession number AY859682).

Desarrollo del nuevo algoritmo para interpretación de PRA hsp65 basado en la secuencia

Tres nuevos patrones de PRA hsp65 se encontraron en este estudio y fueron confirmados mediante secuenciación de hsp65. Las secuencias obtenidas fueron alineadas con la secuencia de hsp65 de M. tuberculosis (GenBank accession number M15467).

Una secuencia correspondió a un nuevo patrón (tipo II) de M. alvei (GenBank accession number EU732653), diferente del tipo I (CIP103464) debido a cambios en los lugares de restricción de HaeIII (T₆₁₈→C y G₇₉₈→C). La secuenciacíon de hsp65 demostró que M. alvei tipo II difería de M. alvei tipo I en 13 de 441 nucleótidos (96,9% de homología).

La segunda secuencia correspondió a un nuevo patrón (tipo VIII) de M. terrae (GenBank accesion number EU732654), diferente del tipo I (ATCC15755) por cambios en los lugares de restricción de BstEII (T₆₃₁→A) y HaeIII (G₅₂₂→C, C₅₉₃→G, C₅₉₄→T y G₇₄₁→C). La secuenciación del amplicón demostró que M. terrae tipo VIII difería de M. terrae tipo I en 25 de 441 nucleótidos (94,3% de homología), de M. terrae tipo II en 32 nucleótidos (92,7% de homología), de M. terrae tipo III en 18 nucleótidos (95,9% de homología) y de M. terrae tipo IV en 24 nucleótidos (94,5% en homología).

Finalmente, la tercera secuencia correspondió a un nuevo patrón (tipo III) de M. mageritense (GenBank accesion number EU732652) que difería de M. mageritense tipo I (CIP104973) debido a cambios en los sitios de restricción de HaeIII (T₅₃₇→C y C₅₈₈→T). La secuenciación de hsp65 mostró una diferencia de 11 de 441 nucleótidos (97,5% de homología) con M. mageritense tipo I y de 12 de 441 nucleótidos (97,2% de homología) con M. mageritense tipo II.

Todos los resultados obtenidos en este estudio junto con una actualización de observaciones previamente publicadas y el algoritmo publicado por Brunello et al.² han sido integradas en el algoritmo ilustrado en la tabla 1.

Tabla 1.

Algoritmo de patrones de hsp65 PRA basados en el análisis in silico del fragmento de Telenti de hsp65

Longitud de los fragmentos digeridos con BstEII (pb)	Longitud de los fragmentos digeridos con HaeIII (pb)^a,b	Especie^b	Referencia
No digestión	197, 87, 58	M. confluentis	AJ310228
No digestión	184, 107	M. gilvum	AJ310236
No digestión	175, 87, 59	M. gadium CIP105388	AJ310233
No digestión	171, 87	M. tusciae	AJ307660
No digestión	168, 127	M. triviale DSM44153	AJ307659
No digestión	161, 87, 59, 58	M. vaccae CIP105934	AF547889
No digestión	(160), (85), (55)	M. flavescens Type III	22
No digestión	(145), (130)	M. simiae Type V	22
No digestión	145, 127	M. florentinum DSM44852	DQ350162
No digestión	145, 127	M. lentiflavum Type I CIP105465	AF547851
No digestión	145, 87, 59, 58, 52	M. komossense CIP105293	AY438649
No digestión	145, 87, 59, 58	M. parafortuitum CIP106802	AF547864
No digestión	145, 69, 58, 54	M. brumae	AJ310224
No digestión	139, 98, 58, 51	M. holsaticum DSM44478	AJ310469
No digestión	139, 87, 58	M. flavescens Type II	DQ986499
No digestión	139, 58, 51	M. flavescens CIP104533	AF547831
No digestión	139, 58, 51	M. novocastrense CIP105546	AF547862
No digestión	134, 127, 65	M. duvalii CIP104539	AJ310229
No digestión	127, 114, 70, 58	M. aurum Type II CIP 104465	AY438081
No digestión	127, 103, 69	M. szulgai CIP104532	AF547878
No digestión	127, 103, 59	M. nebraskense ATCCBAA-837	AY368457
325, 116	196, 69, 58, 54	M. aichiense	AJ310218
325, 116	185, 145	M. fallax CIP81.39	AF547829
325, 116	181, 127	M. terrae Type I CIP104321	AF547879
325, 116	161, 123, 58	M. rhodesiae CIP106806	AF547870
325, 116	(145), (130)	M. lentiflavum Type II	22
325, 116	(145), (130)	M. simiae Type IV	22
325, 116	145, 127, 59	M. montefiorense ATCCBAA-256	AY027785
325, 116	145, 127, 51	M. triplex CIP106108	AF547882
325, 116	(145), (115), (70)	M. terrae Type V	8
325, 116	145, 65, 59, 58	M. mucogenicum Type IV	23
325, 116	145, 65, 59, 58	M. phocaicum Type III	23
325, 116	145, 58	M. arupense Type I ATCCBAA-1242	DQ168662
325, 116	145	M. cookii CIP105396	AF547824
325, 116	(140), (85), (60)	M. terrae Type VII	24
325, 116	139, 94, 58	M. nonchromogenicum Type II	AJ307639
325, 116	139, 87, 58	M. chitae	AJ310227
325, 116	139, 65, 58	M. mucogenicum Type V	24
325, 116	139, 58	M. terrae Type III	AY550212
325, 116	(130), (110), (70), (60)	M. gordonae Type VIII	22
325, 116	(130), (95), (75), (60)	M. kansasii Type V	22
325, 116	127, 112, 70, 59	M. gordonae Type IV	AJ310239
325, 116	127, 112, 69	M. kumamotonense	AB239920
325, 116	127, 103	M. genavense	AJ310235
310, 131	197, 60, 58, 54	M. chelonae	AJ310226
310, 131	197, 60, 58, 54	M. salmoniphilum ATCC13758	DQ866777
310, 131	175, 87, 58	M. sphagni DSM44076	AJ307665
310, 131	161, 123, 58	M. madagascariense CIP104538	AF547852
310, 131	160, 112, 111	M. haemophilum	AJ307630
310, 131	145, 69, 58, 54	M. immunogenum CIP106684	AY458081
310, 131	139, 134, 51	M. elephantis Type I CIP106831	AF547828
310, 131	139, 134, 51	M. pulveris	AF547869
310, 131	(140), (100), (60)	M. elephantis Type II	25
310, 131	139, 94, 78	M. canariasense CIP 107998	AY255477
310, 131	139, 94, 78	M. cosmeticum ATCC BAA-878	AY449731
310, 131	139, 65, 58	M. mucogenicum TypeI ATCC49650	14
310, 131	127, 114, 58	M. botniense DSM44537	AF547812
310, 131	127, 94, 78	M. lacus DSM44577	AY438090
310, 116	244, 139	M. fluoranthenivorans DSM44556	DQ350157
310, 116	181, 161	M. fredericksbergense DSM44346	AF547834
310, 116	181, 139	M. terrae Type II	AY550211
310, 116	172, 139	M. neoaurum CIP105387	AF547860
310, 116	146, 139, 58	M. diernhoferi CIP105384	AF547825
310, 116	145, 78, 58	M. augbanense CIP 108543	AY859677
310, 116	145, 65, 58	M. phocaicum CIP108542 Type I	AY859676
310, 116	145, 65, 58	M. mucogenicum TypeII CIP105223	24
310, 116	139, 87, 58	M. mucogenicum Type III	23
310, 116	139, 87, 58	M. phocaicum Type II	23
310, 116	139, 65, 58	M. phocaicum Type IV	23
231, 210	223, 106	M. shottsii ATCC700981	AY550225
231, 210	197, 87, 58	M. moriokaense CIP105393	AF547857
231, 210	197, 69, 58	M. bolletii CIP 108541	AY859675
231, 210	197, 69, 58	M. massiliense CCUG 48898	AY596465
231, 210	(190), (105), (80)	M. ulcerans Type II	7
231, 210	188, 126	M. simiae Type I	AJ307652
231, 210	(185), (130)	M. genavense Type II ATCC51233	22
231, 210	178, 134, 72, 51	M. thermoresistibile CIP105390	AF547880
231, 210	178, 98, 51	M. hassiacum CIP105218	AF547842
231, 210	162, 94, 51	M. poriferae	AJ307645
231, 210	161, 58, 51	M. austroafricanum CIP 105395	AF547807
231, 210	161, 58, 51	M. vanbaalenii DSM7251	AY438091
231, 210	(155), (140)	M. simiae Type II	7
231, 210	146, 139, 98, 52	M. peregrinum Type I CIP105382	AF547865
231, 210	145, 139, 75	M. parascrofulaceum Type V	AY337278
231, 210	(145), (130), (60)	M. parmense CIP107385	22
231, 210	(145), (130)	M. seoulense DSM44998	22
231, 210	(145), (130)	M. intracellulare Type III	22
231, 210	145, 129, 127	M. intermedium CIP104542	AF547847
231, 210	145, 127, 95	M. scrofulaceum Type I	AJ307648
231, 210	145, 127	M. saskatchewanense ATCCBAA-544	AY208859
231, 210	145, 127	M. simiae Type VI	AY550224
231, 210	145, 127	M. avium Type III	AF126033
231, 210	145, 127	M. interjectum Type I	AJ307632
231, 210	145, 106, 78	M. ulcerans CIP105425	AF547888
231, 210	145, 106, 78	M. pseudoshottsii ATCCBAA-883	AY550226
231, 210	145, 106, 78	M. marinum	AJ307636
231, 210	145, 106	M. bohemicum CIP 105811	AF547811
231, 210	(145), (105), (80)	M. malmoense Type II	22
231, 210	145, 69, 58, 52	M. abscessus	AJ310215
231, 210	(140), (125), (60), (50)	M. senegalense Type III ATCC35796	22
231, 210	(140), (105), (80)	M. intracellulare Type II	22
231, 210	140, 81, 58, 51	M. phlei CIP105389	AF547866
231, 210	139, 123, 98, 52	M. peregrinum Type II	AY379072
231, 210	139, 123, 98, 52	M. septicum ATCC700731	15
231, 210	139, 123, 98, 52	M. porcinum ATCC33776	15
231, 210	139, 123, 58, 52	M. boenickei CIP107829	AY943175
231, 210	139, 112, 69	M. terrae Type IV	19
231, 210	139, 103, 58	M. kubicae CIP106428	AF547850
231, 210	139, 103	M. conspicuum CIP105165	AF547823
231, 210	139, 87, 59, 58	M. chubense CIP106810	AF547821
231, 210	139, 87, 58	M. chlorophenolicum CIP104189	AF547820
231, 210	139, 87, 58	M. obuense	AJ307640
231, 210	127, 112, 95	M. intracellulare Type V	26
231, 210	127, 112	M. gordonae Type V	27
231, 210	127, 112	M. interjectum Type II	AY550236
231, 210	127, 112	M. heidelbergense CIP105424	AF547844
231, 210	127, 103, 78	M. kansasii Type I CIP104589	AF547849
231, 210	127, 103, 78	M. branderi CIP104592	AJ310223
231, 210	127, 103, 59	M. avium Type II	AF126032
231, 210	127, 103	M. avium Type I ATCC25291	DQ284768
231, 210	127, 103	M. colombiense CIP108962	AM062765
231, 210	127, 94, 81, 78	M. parascrofulaceum Type III	AY337276
231, 210	127, 94	M. palustre DSM44572	AY943200
231, 210	127, 78, 58	M. celatum Type I CIP106109	AF547817
231, 210	(120), (115), (110)	M. intracellulare Type IV	22
231, 210	112, 106	M. asiaticum DSM44297	AF547806
231, 131, 79	181, 161	M. doricum DSM44852	AF547826
231, 131, 79	(175), (80)	M. aurum Type I	7
231, 131, 79	161, 145, 59	M. agri	AJ310217
231, 131, 79	161, 87, 58	M. monacense	DQ381730
231. 131, 79	146, 145, 98, 52	M. alvei CIP103464	AF547805
231, 131, 79	146, 139, 98, 58	M. peregrinum Type III	DQ986500
231, 131, 79	145, 127	M. simiae Type III	AF247569
231, 131, 79	145, 123, 58, 52	M. mageritense Type I CIP104973	AF547853
231, 131, 79	145, 123, 58, 52	M. alvei Type II	Our study
231, 131, 79	145, 123, 58	M. smegmatis CIP104444	AF547876
231, 131, 79	145, 123, 58	M. goodii ATCC700504	AY458071
231, 131, 79	145, 123, 58	M. mageritense Type II	DQ184958
231, 131, 79	145, 81, 58	M. murale CIP105980	AF547859
231, 131, 79	139, 81, 58	M. tokaiense CIP106807	AF547881
231, 131, 79	(140), (85)	M. wolinskyi Type II	28
231, 131, 79	(140), (120), (95)	M. gordonae Type VI	7
231, 131, 79	139, 103, 69	M. shimoidei DSM44152	AJ307650
231, 131, 79	139, 123, 98, 52	M. senegalense Type II	AY684049
231, 131, 79	139, 123, 59	M. fortuitum Type II ATCC19542	AJ310232
231, 131, 79	139, 123, 58	M. wolinskyi Type I ATCC700010	AY458064
231, 131, 79	139, 87, 58	M. mageritense Type III	Our study
231, 131, 79	139, 81, 58	M. hodleri CIP104909	AF547845
231, 131, 79	(130), (105), (80)	M. celatum Type II ATCC51130	22
231, 131, 79	(130), (95), (70)	M. kansasii Type III	22
231, 131, 79	127, 103, 101	M. kansasii Type II	AY438086
231, 131, 79	127, 103, 69	M. gastri	AJ310234
231, 131, 79	127, 103, 69	M. kansasii Type VI	AY550233
231, 131, 79	127, 94	M. parascrofulaceum Type IV	AY337277
231, 116, 94	161, 112, 59	M. gordonae Type IX	AM398452
231, 116, 94	161, 103, 59	M. heckeshornense DSM44428	AF547843
231, 116, 94	(155), (110)	M. gordonae Type VII	6
231, 116, 94	(145), (130)	M. lentiflavum Type III	24
231, 116, 94	145, 127, 59	M. chimaera CIP107892	AY943198
231, 116, 94	145, 127, 57	M. intracellulare Type I	AJ307633
231, 116, 94	145, 127	M. scrofulaceum Type III	9
231, 116, 94	145, 105, 78	M. malmoense	AJ307635
231, 116, 94	(145), (70), (60)	M. terrae Type VI	8
231, 116, 94	(140), (125), (100)	M. brisbanense CIP107830	29
231, 116, 94	139, 123, 58	M. terrae Type VIII	Our study
231, 116, 94	139, 58	M. hiberniae	AJ307631
231, 116, 94	127, 112, 95	M. gordonae Type X	19
231, 116, 94	127, 112	M. gordonae tipo III	AJ310238
231, 116, 94	127, 94, 59, 51	M. intracellulare Type VI	AY536637
231, 116, 79	210, 115	M. gordonae Type II	2
231, 116, 79	181, 139, 52	M. senegalense Type IV ATCC35796	AY684045
231, 116, 79	161, 112, 57	M. gordonae Type I	AJ310237
231, 116, 79	161, 104, 59	M. xenopi	AJ307661
231, 116, 79	152, 127, 69	M. tuberculosis complex	2
231, 116, 79	145, 123, 58, 52	M. fortuitum Type I ATCC6841	AY458072
231, 116, 79	145, 127	M. sherrisii ATCCBAA-832	DQ523524
231, 116, 79	145, 58, 54	M. nonchromogenicum Type I DSM44164	24
231, 116, 79	141, 123, 58, 52	M. farcinogenes	AJ310231
231, 116, 79	139, 123, 58, 52	M. conceptionense CIP108544	AY859678
231, 116, 79	139, 123, 58, 52	M. houstonense ATCC49403	AY458077
231, 116, 79	139, 123, 58, 52	M. neworleansense ATCC49404	AY496143
231, 116, 79	139, 123, 58, 52	M. senegalense Type I CIP104971	AF547872
231, 116, 79	139, 94	M. parascrofulaceum Type I	AY337275
231, 116, 79	(135), (90), (85)	M. fortuitm type III	6
231, 116, 79	(130), (115), (75), (60)	M. kansasii Type IV	30
231, 116, 79	(130), (95)	M. lentiflavum Type IV	22
231, 116, 79	127, 94	M. parascrofulaceum Type II ATCCBAA-614	AY337274
231, 116, 79	(125), (95)	M. scrofulaceum Type II	8

a

Los patrones en paréntesis son estimados ya que ninguna secuencia correspondiente a ese patrón ha sido publicada.

b

Las especies y patrones en gris presentan patrones compartidos o diferencias de menos de 5 pares de bases. Los patrones en negrita son nuevos patrones encontrados en este estudio.

Discusión

Clásicamente, Mycobacterium spp. han sido identificadas con métodos fenotípicos. En las últimas 2 décadas, el desarrollo de herramientas basadas en la biología molecular ha llevado a profundas modificaciones en los métodos de identificación y en la clasificación taxonómica de este grupo. La introducción del sistema AccuProbe (Gen-Probe, San Diego, CA) ha acelerado enormemente la identificación de algunas especies de Mycobacterium. Desarrollado para la identificación de M. tuberculosis complex, MAC, M. avium, M. intracellulare, M. kansasii y M. gordonae, es un ensayo simple y rápido. Consiste en una sonda única cuya elección puede ser orientada en función de la morfología al microscopio o las características de la colonia. En nuestro estudio, AccuProbe fue capaz de identificar 102 de 236 (43,2%) aislados de MNT, resultados similares a los publicados por otros autores¹².

Siete aislados presentaron un resultado positivo con AccuProbe MAC Identification Test pero negativa para las sondas específicas de M. avium y M. intracellulare. Estudios recientes han llamado la atención acerca de la amplia diversidad de los aislados que pueden ser detectados dentro del MAC¹⁶.

La especie M. colombiense fue descrita en 2006 como un crecedor lento incluido en el MAC¹⁷ y ha sido asociaao a enfermedad humana. En nuestro estudio encontramos 2 aislados de esta especie. Otras especies como M. palustre y M. saskatchewanense pueden ser confundidas con MAC debido a su positividad con AccuProbe MAC Identification Test aunque genéticamente están distantes del MAC¹⁶.

La identificación de micobacterias mediante PRA hsp65 fue desarrollada por Telenti et al.⁵ y ha sido una práctica establecida desde 1993. Fueron identificados originalmente por Telenti et al. 33 patrones de PRA; después de esto, otros autores introdujeron patrones adicionales en el algoritmo publicado por estos autores^7,18. En 2001, Brunello et al. publicaron un algoritmo para la identificación mediante PRA hsp65, el cual incluyó 50 especies de micobacterias². Dado que se han descrito más de 130 especies y subespecies de micobacterias (J.P. Euzéby, List of Prokaryotic Names with Standing in Nomenclature [http://www.bacterio.citc.fr]) hemos considerado necesaria una actualización de este procedimiento. Chimara et al.¹⁹ recientemente han publicado un nuevo algoritmo de identificación mediante PRA hsp65.

En nuestro estudio, nosotros identificamos 76 de 134 (56,7%) aislados con esta técnica. En varios estudios^6,9,19 PRA hsp65 identificaba cerca del 90% de las cepas evaluadas, aunque en ellos se incluían especies que pueden ser identificadas mediante sondas AccuProbe. Si se tiene como referencia el algoritmo publicado por Chimara et al.¹⁹ el número de aislados no identificados mediante PRA hsp65 sería de 32 aislados, en vez de los 58 aislados para los que fue necesario realizar la secuenciación del 16S rDNA. Un total de 26 aislados sí presentaron un PRA hsp65 incluido en el algoritmo publicado por Chimara et al.¹⁹. Estos aislados son M. parascrofulaceum (n = 7), M. fortuitum (n = 13), M. wolinskyi (n = 1), M. nonchromogenicum (n = 1), M. celatum (n = 1), M. sherrisii (n = 1), M. kumamotonense (n = 1) y M. mucogenicum (n = 1). No obstante, en el caso de M. wolinskyi (n = 1) según el algoritmo presentado en nuestro estudio comparte PRA hsp65 con M. fortuitum ATCC19542². Una diferencia importante de nuestro algoritmo de hsp65 PRA con el algoritmo propuesto por Chimara et al.¹⁹ es que el nuestro incluye los fragmentos 325/116 y 310/116, obtenidos tras digestión con BstEII, que separamos por ser claramente diferentes (15 nt).

Distintos factores críticos deben ser considerados cuando se usa PRA hsp65 como método de identificación de MNT. Uno es la pérdida de estandarización debido a las diferentes condiciones de electroforesis que son utilizadas. Esto causa diferencias en los patrones comunicados en la literatura científica. Además, esta metodología está afectada por la interpretación subjetiva si no se utiliza software para reconocer el patrón. Para evitar estas dificultades, nosotros utilizamos estrictas condiciones de electroforesis y software apropiado. Reconociendo las limitaciones del PRA hsp65, Kapur et al.¹¹ fueron los primeros en secuenciar el amplicón de hsp65 generado con los iniciadores de Telenti como método de identificación de MNT. Desde entonces, otros autores han demostrado la utilidad de esta aproximación diagnóstica¹². La secuenciación de 441 pares de bases del hsp65 permite la construcción de algoritmos basados en la secuencia. De cualquier forma, los patrones de bandas deducidos de la secuencia no reflejan exactamente los patrones de bandas observados en los geles de electroforesis. Además, algunas especies de Mycobacterium pueden compartir patrón de PRA o tienen diferencias de menos de 5 pb (tabla 1). Finalmente, nuevos patrones para nuevas especies o especies conocidas son descritos con frecuencia. Aunque tales patrones nuevos, si son fácilmente reconocidos², no deberían ser un inconveniente para esta metodología, sí que es verdad que requiere una actualización constante. En nuestro trabajo, 3 aislados presentaban patrones de PRA hsp65 que no coincidían con alguno previamente descrito. Esta circunstancia también ha pasado en otros estudios^6,8,9.

El algoritmo de patrones de cepas de referencia calculados in silico a partir de las secuencias depositadas en las bases de datos creemos que es útil porque refleja la realidad mejor que los algoritmos comunicados con patrones estimados, aunque el PRA hsp65 es una estimación, no una secuenciación.

El gen más ampliamente utilizado en identificación bacteriana es el 16S rDNA y es considerado el gold standard¹⁰. Su utilización ha contribuido a la descripción de nuevas especies de MNT en los últimos años¹⁰. Sin embargo, como existe poca variabilidad dentro del 16S rDNA del género Mycobacterium, no permite diferenciar especies cercanamente relacionadas como M. chelonae o M. abcessus¹⁰.

La secuenciación parcial de 16S rDNA nos ha permitido identificar un total de 53 (22,4%) aislados, incluyendo algunas especies recientemente descritas como M. sherrisii, M. kumamotonense y M. arupense. Destaca la elevada frecuencia con la que aislamos M. parascrofulaceum. Esta especie fue descrita en 2004²⁰ como un crecedor lento escotocromógeno relacionado con M. simiae. Trece aislados fueron identificados como M. fortuitum mediante secuenciación del 16S rDNA. Todos presentaron un patrón de PRA hsp65 que corresponde a M. fortuitum tipo I. Este patrón no está incluido en el algoritmo publicado por Brunello et al.².

Nosotros encontramos 5 de 58 aislados (8,6%) que no pudieron ser identificados mediante secuenciación de 16S rDNA. Uno de ellos fue identificado como M. mucogenicum mediante secuenciación de hsp65. Finalmente, 4 aislados (1,7%) no pudieron ser identificados y podrían corresponder a nuevos taxones, en función de sus secuencias únicas de 16S rDNA y hsp65. Otros autores²¹ han comunicado resultados similares.

Actualmente ninguna técnica de biología molecular es capaz de identificar el 100% de los aislados de Mycobacterium sp. La técnica de HPLC se encuentra en laboratorios de referencia y requiere personal muy especializado. La secuenciación parcial del 16S rDNA se ha convertido en la actual prueba de referencia «práctica» para la identificación de especie (la prueba de referencia real para la identificación de especie es el estudio de reasociación de ADN o hibridación ADN-ADN). El problema de este gen para Mycobacterium sp. es que presenta poca variabilidad para este género (el punto de corte para el diagnóstico de especie está fijado en 99,5% de homología, frente al 99% general para otras especies bacterianas), de ahí que se utilicen otros genes como hsp65 o rpoB, los cuales presentan más variabilidad que el 16S rDNA. Las inmunocromatografías de membrana, como GenoType^® CM/AS (Hain Lifescience GmbH, Nehren, Alemania), si bien son fáciles y rápidas de realizar, sólo identifican 30 especies (o complejos, como M. tuberculosis complex). Además, en ocasiones, son necesarias 2 hibridaciones, ya que GenoType CM identifica 12 especies, un complejo (M. tuberculosis complex) y M. marinum/ulcerans; GenoType AS permite la identificación de 16 especies. En nuestro estudio un total de 42 cepas no hubieran podido ser identificadas mediante esta técnica y necesitarían otra técnica de identificación. Estas especies serían M. triviale (n = 1), M. thermoresistibile (n = 1), M. parasrofulaceum (n = 20), M. porcinum (n = 3), M. mageritense (n = 2), M. colombiense (n = 2), M. septicum (n = 2), M. arupense (n = 2), M. alvei (n = 1), M. terrae (n = 1), M. nonchromogenicum (n = 1), M. kumamotonense (n = 1), M. sherrisii (n = 1) y Mycobacterium sp. (probables taxones no descritos) (n = 4).

La identificación correcta de MNT clínicamente relevantes es esencial para establecer un sistema taxonómico detallado y su rápida identificación está llegando a ser cada vez más importante para el buen cuidado del paciente. Nosotros integramos diferentes técnicas de biología molecular como AccuProbe, PRA hsp65 y secuenciación de 16S rDNA y hsp65, junto a características fenotípicas básicas en un algoritmo de identificación de MNT. Este algoritmo nos permitió identificar casi todas las MNT aisladas en este estudio, incluyendo algunas especies recientemente descritas. En el presente trabajo hemos actualizado el algoritmo para interpretación del PRA hsp65.

Conflicto de intereses

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.

Agradecimientos

Este estudio ha sido parcialmente financiado por el Ministerio de Sanidad y Consumo, el Instituto de Salud Carlos III-Feder y la Red Española de Investigación en Patología Infecciosa (REIPI C03/14 y RD06/0008/0013).