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¿Qué puede ofrecer actualmente el laboratorio de micobacterias en la formación profesional del microbiólogo clínico?
What can the microbiology laboratory currently offer in the professional training of clinical microbiologists?
Vicente Ausinaa
a Servicio de Microbiología. Hospital Universitario Germans Trias i Pujol. Badalona (Barcelona). Departamento de Genética y Microbiología. Facultad de Medicina. Universidad Autónoma de Barcelona. España.
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por las razones que se comentan a continuaci&#243;n&#44; un error conceptual importante&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Hay muchas razones que justifican la necesidad de una formaci&#243;n m&#225;s prolongada&#44; espec&#237;fica y reglada de los residentes en micobacteriolog&#237;a cl&#237;nica&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Contenidos espec&#237;ficos te&#243;ricos<span class="elsevierStyleSup">2-7</span></p><p class="elsevierStylePara">1&#46; A nivel estructural y biol&#243;gico las micobacterias poseen rasgos diferenciales suficientemente caracter&#237;sticos como para considerarlas de forma independiente a otros microorganismos&#46;</p><p class="elsevierStylePara">2&#46; La epidemiolog&#237;a y patogenia de las infecciones micobacterianas es suficientemente importante y singular como para considerarlas de forma muy individualizada en los programas de formaci&#243;n&#46;</p><p class="elsevierStylePara">3&#46; Los principios en los que descansa el tratamiento de las enfermedades micobacterianas y los mecanismos de prevenci&#243;n y control de &#233;stas requieren conocimientos te&#243;ricos espec&#237;ficos&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Contenidos espec&#237;ficos pr&#225;cticos<span class="elsevierStyleSup">7-11</span></p><p class="elsevierStylePara">1&#46; El laboratorio de micobacterias utiliza t&#233;cnicas y procedimientos suficientemente singulares como para que sean aprendidos individualizadamente&#46;</p><p class="elsevierStylePara">2&#46; Esta singularidad alcanza tambi&#233;n a las t&#233;cnicas de estudio de sensibilidad in vitro&#44; que son esencialmente diferentes a las utilizadas para otras bacterias&#46;</p><p class="elsevierStylePara">3&#46; Finalmente&#44; el laboratorio de micobacterias constituye un excelente modelo para estudiar el impacto y realizar un an&#225;lisis cr&#237;tico del valor y las limitaciones de las nuevas t&#233;cnicas diagn&#243;sticas &#40;t&#233;cnicas de amplificaci&#243;n gen&#233;tica&#44; sondas gen&#233;ticas y otras t&#233;cnicas alternativas de identificaci&#243;n microbiana&#44; an&#225;lisis molecular de resistencias&#44; t&#233;cnicas de epidemiolog&#237;a molecular&#44; etc&#46;&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Posiblemente no hay otro lugar en los laboratorios cl&#237;nicos actuales&#44; excepto tal vez las secciones de virolog&#237;a cl&#237;nica&#44; donde pueda seguirse de forma m&#225;s adecuada ni con mayor rigor la evoluci&#243;n de las nuevas tecnolog&#237;as&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Contenidos culturales</p><p class="elsevierStylePara">En cuanto a contenidos de tipo cultural profesional que trascienden el &#225;mbito de las micobacterias&#46; Esta secci&#243;n del laboratorio es un lugar id&#243;neo para que los residentes se planteen y reflexionen sobre&#58;</p><p class="elsevierStylePara">1&#46; El control de calidad y su trascendencia&#46;</p><p class="elsevierStylePara">2&#46; Normativas de seguridad biol&#243;gica&#46;</p><p class="elsevierStylePara">3&#46; Relaciones con los servicios cl&#237;nicos y con las autoridades sanitarias en temas relativos a Salud P&#250;blica&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Probablemente no hay ninguna otra &#225;rea en los laboratorios cl&#237;nicos actuales donde las competencias t&#233;cnicas y profesionales de los microbi&#243;logos est&#233;n tan bien definidas y delimitadas&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Evoluci&#243;n de las t&#233;cnicas diagn&#243;sticas en micobacteriolog&#237;a cl&#237;nica a lo largo del pasado siglo y or&#237;genes del presente</p><p class="elsevierStylePara">La evoluci&#243;n de las t&#233;cnicas diagn&#243;sticas ha seguido&#44; por razones diversas&#44; diferentes etapas bien diferenciadas en las que los progresos han sido heterog&#233;neos&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Una primera etapa&#44; muy prolongada&#44; se extendi&#243; hasta la mitad de la d&#233;cada de 1970 y se caracteriz&#243; porque no se produjeron progresos tecnol&#243;gicos realmente relevantes en las t&#233;cnicas de diagn&#243;stico<span class="elsevierStyleSup">12</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Durante todo este dilatado per&#237;odo de tiempo los laboratorios utilizaron una tecnolog&#237;a convencional con evidentes limitaciones de cara a las necesidades de la pr&#225;ctica cl&#237;nica &#40;baja sensibilidad de las t&#233;cnicas de examen microsc&#243;pico directo y excesiva lentitud de las t&#233;cnicas de cultivo&#44; identificaci&#243;n y antibiograma&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Estas t&#233;cnicas tradicionales son&#44; con algunas modificaciones relevantes en los procedimientos de cultivo e identificaci&#243;n&#44; plenamente vigentes en la actualidad&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Los procedimientos de digesti&#243;n-descontaminaci&#243;n de las muestras que contienen flora comensal utilizados en la actualidad han variado muy poco a lo largo de los a&#241;os&#46; El hecho de que las micobacterias&#44; por sus constituyentes de pared celular&#44; sean m&#225;s resistentes que otros microorganismos a los &#225;cidos y bases fuertes&#44; permite utilizar estas sustancias para eliminar bacterias y otros microorganismos comensales presentes en las muestras cl&#237;nicas y evitar que interfieran en el crecimiento de las micobacterias<span class="elsevierStyleSup">13&#44;14</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">La soltura en el manejo y evaluaci&#243;n de estas t&#233;cnicas es importante en la formaci&#243;n del residente&#44; que debe conocer que la utilizaci&#243;n inapropiada de &#233;stas puede afectar la viabilidad de las micobacterias y producir falsos cultivos negativos &#40;por exceso de descontaminaci&#243;n&#41; o a un n&#250;mero elevado de contaminaciones &#40;por defecto de descontaminaci&#243;n&#41;<span class="elsevierStyleSup">12</span>&#46; Un porcentaje aceptable de contaminaciones en los medios s&#243;lidos se estima en el 3-5&#37;&#44; dependiendo del tipo de muestras cl&#237;nicas&#46; Un &#237;ndice de contaminaci&#243;n inferior al 3&#37; es preocupante por exceso y cuando &#233;ste es superior al 5&#37; sugiere un proceso de descontaminaci&#243;n demasiado suave o de digesti&#243;n incompleta&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Otra etapa bien diferenciada abarc&#243; la segunda mitad de la d&#233;cada de 1970 y se caracteriz&#243; por la introducci&#243;n de una tecnolog&#237;a de cultivo a&#250;n no superada&#58; los sistemas radiom&#233;tricos de detecci&#243;n del crecimiento &#40;Bactec 460 TB&#174;&#44; Becton Dickinson Lab&#46; Systems&#41;<span class="elsevierStyleSup">11&#44;12</span>&#46; Con esta nueva tecnolog&#237;a se consigui&#243;<span class="elsevierStyleSup">15</span>&#58;</p><p class="elsevierStylePara">1&#46; Un ahorro considerable de tiempo &#40;de aproximadamente 15-20 d&#237;as&#41; en la detecci&#243;n del crecimiento de las micobacterias&#46;</p><p class="elsevierStylePara">2&#46; La posibilidad de realizar antibiogramas de Mycobacterium tuberculosis a los f&#225;rmacos de primera elecci&#243;n en 5-10 d&#237;as aproximadamente&#46;</p><p class="elsevierStylePara">La limitaci&#243;n m&#225;s importante de este nuevo sistema era la necesidad de trabajar con is&#243;topos radiactivos &#40;C<span class="elsevierStyleSup">14</span>&#41;&#59; esto supon&#237;a una limitaci&#243;n importante para muchos laboratorios peque&#241;os que no pod&#237;an disponer de las licencias necesarias para almacenar y trabajar con estos compuestos&#46;</p><p class="elsevierStylePara">La tercera etapa se desarroll&#243; a lo largo de la d&#233;cada de 1980 y se caracteriz&#243; por dos hechos importantes que condicionaron mucho la evoluci&#243;n de las t&#233;cnicas diagn&#243;sticas&#58; la aparici&#243;n epid&#233;mica del SIDA y el acelerado desarrollo de nuevas tecnolog&#237;as<span class="elsevierStyleSup">11</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">La evoluci&#243;n de las t&#233;cnicas diagn&#243;sticas en esta &#233;poca se caracteriz&#243;&#58;</p><p class="elsevierStylePara">1&#46; Por el desarrollo de t&#233;cnicas r&#225;pidas de cultivo no radiom&#233;tricas<span class="elsevierStyleSup">8</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">2&#46; La estandarizaci&#243;n de t&#233;cnicas eficaces de hemocultivo para micobacterias<span class="elsevierStyleSup">16</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">3&#46; El desarrollo de t&#233;cnicas r&#225;pidas de identificaci&#243;n alternativas &#40;t&#233;cnicas cromatogr&#225;ficas y sondas gen&#233;ticas&#41;<span class="elsevierStyleSup">17-20</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">En la tabla 1 figuran los principales medios de cultivo l&#237;quidos o bif&#225;sicos no radiom&#233;tricos comercializados de lectura autom&#225;tica o visual y sus principales caracter&#237;sticas<span class="elsevierStyleSup">7</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><img src="28v21nSupl.2-13059084tab01.gif"></img></p><p class="elsevierStylePara">Aunque ninguno de estos sistemas supera en rapidez y sensibilidad al BACTEC 460 TB&#174;&#44; la utilizaci&#243;n combinada de un medio s&#243;lido y de uno de estos medios l&#237;quidos se considera actualmente lo m&#225;s id&#243;neo&#44; buscando una sensibilidad &#243;ptima y rapidez en la detecci&#243;n del crecimiento&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Los estudios de sensibilidad in vitro que utilizan estos nuevos medios l&#237;quidos no radiom&#233;tricos no han sido a&#250;n aprobados por la Food and Drug Administration &#40;FDA&#41; con este fin&#44; aunque cada vez se publican m&#225;s art&#237;culos en los que son evaluados en comparaci&#243;n con las t&#233;cnicas de referencia&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Las t&#233;cnicas de identificaci&#243;n alternativas se introdujeron para incrementar la rapidez y solucionar los problemas de imprecisi&#243;n de las t&#233;cnicas de identificaci&#243;n convencional&#46; Algunas de estas t&#233;cnicas contin&#250;an teniendo plena vigencia en la actualidad<span class="elsevierStyleSup">8&#44;9</span>&#58;</p><p class="elsevierStylePara">1&#46; Las sondas gen&#233;ticas para identificar micobacterias aisladas en medios s&#243;lidos o l&#237;quidos&#46; Actualmente est&#225;n disponibles sondas gen&#233;ticas fr&#237;as para la identificaci&#243;n de M&#46; tuberculosis&#44; M&#46; kansasii&#44; M&#46; avium&#44; M&#46; intracellulare y M&#46; gordonae &#40;Accu Probe&#174;&#44; Gen Probe&#41;<span class="elsevierStyleSup">17</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">2&#46; Las t&#233;cnicas de identificaci&#243;n cromatogr&#225;fica &#40;cromatograf&#237;a de capa fina&#44; gas-l&#237;quido y HPLC&#41; permiten poner en evidencia los perfiles lip&#237;dicos espec&#237;ficos de la pared micobacteriana e identificar de forma y r&#225;pida y reproducible las micobacterias<span class="elsevierStyleSup">18-20</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Llegamos as&#237; a una cuarta etapa&#44; la actual&#44; caracterizada por el desarrollo y aplicaci&#243;n de las nuevas t&#233;cnicas de amplificaci&#243;n gen&#233;tica a los siguientes &#225;mbitos<span class="elsevierStyleSup">8-10</span>&#58;</p><p class="elsevierStylePara">1&#46; Diagn&#243;stico r&#225;pido de la tuberculosis<span class="elsevierStyleSup">10</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">2&#46; Desarrollo de nuevas t&#233;cnicas de identificaci&#243;n<span class="elsevierStyleSup">21&#44;22</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">3&#46; Detecci&#243;n de las mutaciones responsables de los genotipos de resistencia<span class="elsevierStyleSup">37</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">4&#46; Estudios de epidemiolog&#237;a molecular<span class="elsevierStyleSup">24&#44;25</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Durante la &#250;ltima d&#233;cada se han desarrollado una serie de t&#233;cnicas de biolog&#237;a molecular que permiten la amplificaci&#243;n de secuencias de ADN y ARN espec&#237;ficas de M&#46; tuberculosis&#46; Las t&#233;cnicas de amplificaci&#243;n gen&#233;tica permiten generar a partir de una &#250;nica copia de ADN o ARN&#44; y mediante un proceso enzim&#225;tico&#44; millones de copias de &#225;cido nucleico diana&#44; facilitando de esta forma la detecci&#243;n directa de M&#46; tuberculosis en las muestras cl&#237;nicas&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Esta tecnolog&#237;a ha logrado solventar&#44; al menos en parte&#44; los principales problemas inherentes a las t&#233;cnicas microbiol&#243;gicas convencionales&#44; permitiendo establecer diagn&#243;sticos r&#225;pidos &#40;entre 2 y 8 h&#41; y mejorar la sensibilidad de las t&#233;cnicas cl&#225;sicas<span class="elsevierStyleSup">8-10</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">El inter&#233;s de diferentes compa&#241;&#237;as multinacionales en el desarrollo de estas t&#233;cnicas de amplificaci&#243;n ha conducido a la aparici&#243;n de reactivos y equipos m&#225;s o menos sofisticados que estandarizan&#44; simplifican y en algunos casos automatizan las reacciones de amplificaci&#243;n&#46; Esto ha sido determinante para que esta tecnolog&#237;a haya podido ser aplicada&#44; con las debidas garant&#237;as&#44; en el diagn&#243;stico de la tuberculosis&#46;</p><p class="elsevierStylePara">En la actualidad se dispone en el mercado de una gran variedad de sistemas de amplificaci&#243;n&#44; que proveen los reactivos necesarios y que permiten trabajar en condiciones estandarizadas&#44; ofreciendo amplias posibilidades en el diagn&#243;stico actual de la tuberculosis &#40;tabla 2&#41;<span class="elsevierStyleSup">11</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><img src="28v21nSupl.2-13059084tab02.gif"></img></p><p class="elsevierStylePara">Los retos planteados de cara al futuro en este campo son los siguientes<span class="elsevierStyleSup">11</span>&#58;</p><p class="elsevierStylePara">1&#46; Incrementar la sensibilidad de las t&#233;cnicas de amplificaci&#243;n en muestras Ziehl-Neelsen negativas&#46;</p><p class="elsevierStylePara">2&#46; Idear procedimientos para neutralizar las sustancias inhibidoras de las reacciones de amplificaci&#243;n&#44; especialmente en muestras extrarrespiratorias&#46;</p><p class="elsevierStylePara">3&#46; Automatizar tanto el proceso de preparaci&#243;n de la muestra como las de amplificaci&#243;n y detecci&#243;n del producto amplificado&#44; con el fin de facilitar el trabajo y minimizar el riesgo de contaminaci&#243;n por amplicones durante el procesamiento manual de las muestras&#46; Actualmente s&#243;lo el sistema Cobas Amplicor nos ofrece un equipo que permite trabajar de forma totalmente automatizada&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Las t&#233;cnicas de identificaci&#243;n basadas en amplificaci&#243;n gen&#233;tica tambi&#233;n han abierto nuevos caminos en los &#250;ltimos a&#241;os&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Polimorfismo de los fragmentos de restricci&#243;n &#40;PRA&#41;<span class="elsevierStyleSup">21</span></p><p class="elsevierStylePara">Es una de las m&#225;s utilizadas&#46; Se basa en la amplificaci&#243;n de un fragmento de ADN com&#250;n a todas las especies de micobacterias &#40;que codifica la prote&#237;na 65 K&#41;&#44; seguida de una digesti&#243;n posterior con 2 enzimas de restricci&#243;n &#40;Hae III y Bst E II&#41; y visualizaci&#243;n posterior de los fragmentos obtenidos en un gel de agarosa tras tinci&#243;n con bromuro de etidio&#46; Los patrones de restricci&#243;n obtenidos son espec&#237;ficos de las distintas especies de micobacterias&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Entre las principales ventajas de esta t&#233;cnica est&#225;n las siguientes&#58; necesidad de poco in&#243;culo&#44; rapidez y capacidad de identificar la mayor&#237;a de especies descritas&#46; Entre sus inconvenientes cabe destacar la necesidad de disponer de los materiales necesarios para la amplificaci&#243;n y electroforesis de geles de agarosa&#44; as&#237; como el adiestramiento en la lectura e interpretaci&#243;n de resultados&#46;</p><p class="elsevierStylePara"> Secuenciaci&#243;n de &#225;cidos nucleicos<span class="elsevierStyleSup">22</span></p><p class="elsevierStylePara">Se basa en la amplificaci&#243;n y posterior secuenciaci&#243;n de un fragmento del gen RNAr 16s&#44; de secuencia conocida en las distintas especies de micobacterias&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Este gen est&#225; bastante conservado&#44; pero tiene zonas variables con secuencias de nucle&#243;tidos espec&#237;ficas de g&#233;nero y especie&#44; que son las que se amplifican&#46; Con esta metodolog&#237;a se han podido identificar y describir recientemente nuevas especies del g&#233;nero Mycobacterium&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Las t&#233;cnicas gen&#233;ticas actuales tambi&#233;n permiten dar a conocer las mutaciones cromos&#243;micas que causan la resistencia de las micobacterias a los quimioter&#225;picos y abren una nueva v&#237;a para conocer las resistencias a los f&#225;rmacos antituberculosos<span class="elsevierStyleSup">15</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">La gen&#233;tica molecular es tambi&#233;n la herramienta actual m&#225;s &#250;til como marcador epidemiol&#243;gico&#46; La mayor&#237;a de aplicaciones epidemiol&#243;gicas del an&#225;lisis con enzimas de restricci&#243;n &#40;RFLP&#41; han utilizado la secuencia de inserci&#243;n IS 6110&#44; que est&#225; presente en 1 a 20 copias en el genoma de M&#46; tuberculosis&#46; Algunas cepas con escaso n&#250;mero de copias de IS 6110 deben ser tipificadas con otro sistema de estudio como el  spoligotyping &#40;spacer oligonucleotoide typing&#41;&#59; este m&#233;todo detecta la presencia o ausencia de secuencias de uni&#243;n variables dentro de la regi&#243;n DR &#40;direct repeat region&#41;<span class="elsevierStyleSup">24&#44;25</span>&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Algunas aplicaciones en las que puede ser de utilidad el estudio de la huella gen&#233;tica con IS 6110 son las siguientes&#58;</p><p class="elsevierStylePara">1&#46; Estudio epidemiol&#243;gico de la tuberculosis comunitaria&#46;</p><p class="elsevierStylePara">2&#46; Detecci&#243;n de transmisi&#243;n no sospechada de M&#46; tuberculosis&#46;</p><p class="elsevierStylePara">3&#46; Investigaci&#243;n de transmisi&#243;n de tuberculosis nosocomial&#46;</p><p class="elsevierStylePara">4&#46; Estudios de patog&#233;nesis &#40;diferenciaci&#243;n entre reinfecci&#243;n y reactivaci&#243;n&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara">5&#46; Identificaci&#243;n de contaminaciones cruzadas en el laboratorio&#46;</p><p class="elsevierStylePara">El laboratorio actual de micobacterias&#46; An&#225;lisis coste-beneficio&#46; Criterios de selecci&#243;n de las t&#233;cnicas<span class="elsevierStyleSup">8-10&#44;26</span></p><p class="elsevierStylePara">Los laboratorios de microbiolog&#237;a pueden ofrecer hoy d&#237;a prestaciones muy diversas para el diagn&#243;stico y el control de las infecciones micobacterianas &#40;tabla 3&#41;&#46;</p><p class="elsevierStylePara"><img src="28v21nSupl.2-13059084tab03.gif"></img></p><p class="elsevierStylePara">El laboratorio actual de micobacterias es inconcebible sin una s&#243;lida colaboraci&#243;n de su personal con los cl&#237;nicos y los epidemi&#243;logos&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Algunas de las sofisticadas t&#233;cnicas actuales &#40;amplificaci&#243;n gen&#233;tica&#44; estudios de susceptibilidad in vitro&#44; t&#233;cnicas de epidemiolog&#237;a molecular&#44; etc&#46;&#41; son de coste realmente elevado y no est&#225; justificado su uso indiscriminado&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Se han de fijar de forma conjunta las indicaciones y las t&#233;cnicas que es necesario utilizar en casos concretos o especiales&#46; El establecimiento de reuniones frecuentes entre el personal implicado en la toma de decisiones es&#44; por tanto&#44; fundamental para la discusi&#243;n de los casos cl&#237;nicos y para crear la cultura necesaria que facilite la utilizaci&#243;n m&#225;s adecuada de los recursos t&#233;cnicos disponibles en beneficio del enfermo y la comunidad&#46;</p><p class="elsevierStylePara">S&#243;lo en este escenario de colaboraci&#243;n donde la tecnolog&#237;a est&#225; abierta y es receptiva a la resoluci&#243;n de problemas cl&#237;nicos pueden formarse nuestros especialistas en el futuro&#46;</p><p class="elsevierStylePara">El microbi&#243;logo cl&#237;nico ha de ser un profesional que combine un conocimiento profundo de la microbiolog&#237;a con la capacidad de comprender los problemas cl&#237;nicos&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Ha de estar habituado a plantear los aspectos sintom&#225;ticos y sindr&#243;micos de las enfermedades infecciosas&#46; Ha de pasar del laboratorio a la pr&#225;ctica cl&#237;nica y a la inversa&#44; seg&#250;n lo considere necesario&#44; sin sentir que pasa a trav&#233;s de una barrera que delimita su actividad profesional&#46;</p><p class="elsevierStylePara">Para conseguir este tipo de profesional&#44; el laboratorio actual de micobacterias puede ser una buena escuela&#46;</p>"
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Información del artículo
ISSN: 0213005X
Idioma original: Español
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