Aplicación de un extractor automático de ácidos nucleicos para mejorar la detección de Chlamydia trachomatis
Application of an automatic nucleic acid extraction method to improve the detection of Chlamydia trachomatis
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Las ITS por <span class="elsevierStyleItalic">C. trachomatis</span> son prevenibles y de fácil tratamiento, aunque debido al alto porcentaje de pacientes asintomáticos (del 50 al 70%) requieren un diagnóstico clinicomicrobiológico preciso y rápido para evitar la propagación de la infección y la aparición de posibles secuelas<a href="#bib3" class="elsevierStyleCrossRefs"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a><span class="elsevierStyleSup">,</span><a href="#bib4" class="elsevierStyleCrossRefs"><span class="elsevierStyleSup">4</span></a>. Las técnicas de amplificación de ácidos nucleicos han aumentado la sensibilidad del diagnóstico de esta infección<a href="#bib5" class="elsevierStyleCrossRefs"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a>. Uno de los métodos comerciales más utilizados en Europa es el COBAS<span class="elsevierStyleSup">®</span> TaqMan (Roche), que incluye un equipo de preparación manual de la muestra mediante lisis para exponer los ácidos nucleicos. El objetivo de este trabajo fue comparar este procedimiento manual con una extracción automatizada de ácidos nucleicos.</p><p class="elsevierStylePara">Entre diciembre de 2007 y marzo de 2008 se analizaron prospectivamente 200 muestras de 177 pacientes (63 varones y 114 mujeres) con una edad media de 31 años (rango de 15 a 68; mediana de 30). Se emplearon en paralelo 2 métodos de obtención de ácidos nucleicos según las instrucciones de cada fabricante: a) preparación manual mediante lisis con el equipo Amplicor CT/NG Specimen Preparation (Roche) y b) método automatizado con el equipo NucliSens en el robot EasyMAG (BioMérieux). La detección de <span class="elsevierStyleItalic">C. trachomatis</span> se efectuó mediante una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real basada en la amplificación del plásmido críptico con cebadores y sondas específicas (COBAS<span class="elsevierStyleSup">®</span> TaqMan CT Test, Roche). La valoración se realizó con el analizador COBAS<span class="elsevierStyleSup">®</span> TaqMan 48, que aporta los resultados cualitativos por cada muestra junto con un análisis semicuantitativo mediante una gráfica que indica la intensidad de fluorescencia en cada ciclo de amplificación. Para el análisis de los resultados se empleó el test de McNemar para datos pareados.</p><p class="elsevierStylePara">De las 200 muestras analizadas, se detectó <span class="elsevierStyleItalic">C. trachomatis</span> en 24 (12%): 8 exudados cervicales de mujeres, y 10 uretrales y 6 rectales de 15 varones <span class="elsevierStyleBold">(</span><a href="#tbl1" class="elsevierStyleCrossRefs">tabla 1</a><span class="elsevierStyleBold">)</span>. Con el método de preparación manual fueron positivas 17 (8,5%) muestras y con el método de extracción automatizada fueron positivas las 24 (12%) muestras, un 30% más. Siete muestras (3 de cérvix, 3 rectales y una uretral) tuvieron un resultado discordante: fueron positivas cuando la extracción de ácido desoxirribonucleico (ADN) se hizo con el método automático y fueron negativas cuando se efectuó la preparación manual (p=0,004). Todas las muestras que fueron positivas con el método manual lo fueron también con el automático.</p><p class="elsevierStylePara">Tabla 1. Detección de <span class="elsevierStyleItalic">Chlamydia trachomatis</span> en muestras pareadas con 2 métodos de obtención de ácidos nucleicos</p><a name="tbl1" class="elsevierStyleCrossRefs"></a><p class="elsevierStylePara"></p><table><tr align="left"><td>Muestras</td><td rowspan="0" colspan="4">n positivos (%)</td></tr><tr align="left"><td> </td><td>Total</td><td>Extracción automática</td><td>Preparación manual</td><td>Discordantes</td><td> </td></tr><tr align="left"><td>Cérvix (n=113)</td><td>8 (7,1)</td><td>8 (7,1)</td><td>5 (4,4)</td><td>3 (2,7)</td><td>Z=1,732; p=0,042</td></tr><tr align="left"><td>Uretral (n=65)</td><td>10 (15,4)</td><td>10 (15,4)</td><td>9 (13,8)</td><td>1 (1,5)</td><td>Z=0,5; p=0,31</td></tr><tr align="left"><td>Rectal (n=17)</td><td>6 (35,3)</td><td>6 (35,3)</td><td>3 (17,6)</td><td>3 (17,6)</td><td>Z=1,732; p=0,042</td></tr><tr align="left"><td>Otros (n=5)</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>0</td><td>–</td></tr><tr align="left"><td>Total (n=200)</td><td>24 (12)</td><td>24 (12)</td><td>17 (8,5)</td><td>7 (3,5)</td><td>Z=2,65; p=0,004</td></tr></table><p class="elsevierStylePara">El análisis semicuantitativo mostró que en todas las muestras positivas por ambos métodos de obtención de ácidos nucleicos (manual y automático), la amplificación se inició siempre en uno o 2 ciclos anteriores en las muestras extraídas por el método automático, lo que indicó la obtención de un mayor número de copias de <span class="elsevierStyleItalic">C. trachomatis</span>. Asimismo, este análisis reveló que en las muestras con resultado discordante la carga bacteriana era baja, ya que en todas ellas la detección de la diana se produjo en los ciclos finales de amplificación. La confirmación mediante hibridación con sondas de los amplificados obtenidos que proporciona el sistema COBAS<span class="elsevierStyleSup">®</span> TaqMan CT Test asegura la especificidad de los resultados. Los mejores resultados encontrados en este trabajo para el método automático de extracción se pueden explicar por la mayor sensibilidad en detectar las cargas bacterianas bajas. Este método realiza una lisis celular, tras la que los ácidos nucleicos liberados se atrapan en una matriz inmunomagnética de sílice, posteriormente se purifican y se obtiene un producto final concentrado<a href="#bib6" class="elsevierStyleCrossRefs"><span class="elsevierStyleSup">6</span></a>. Sin embargo, el sistema de preparación manual se basa en una lisis celular química y posterior exposición del ADN. La preparación manual es sencilla y dura media hora, pero la extracción automática optimiza el rendimiento del trabajo y requiere menor manipulación, lo que disminuye el riesgo de contaminación cruzada y permite mayor reproducibilidad.</p><p class="elsevierStylePara">El presente estudio está basado en un número pequeño de muestras y los resultados deben interpretarse como preliminares. Sin embargo, indican que un sistema de extracción automatizada de ácidos nucleicos podría mejorar el rendimiento de la técnica manual empleada actualmente en el equipo COBAS<span class="elsevierStyleSup">®</span> TaqMan. Los resultados de otro estudio reciente apoyan esta misma hipótesis<a href="#bib7" class="elsevierStyleCrossRefs"><span class="elsevierStyleSup">7</span></a>. Si nuevos estudios reproducen los resultados de este trabajo, sería conveniente que el citado método de detección de <span class="elsevierStyleItalic">C. trachomatis</span> incorporara un sistema de extracción de ácidos nucleicos automatizado, avalado por el Marcado CE, lo que aportaría mejoras a la técnica actual.</p><p class="elsevierStylePara">Autor para correspondencia. luisdario.pineirovazquez@osakidetza.net</p>" "pdfFichero" => "28v27n09a13142802pdf001.pdf" "tienePdf" => true "bibliografia" => array:2 [ "titulo" => "Bibliografía" "seccion" => array:1 [ 0 => array:1 [ "bibliografiaReferencia" => array:7 [ 0 => array:3 [ "identificador" => "bib1" "etiqueta" => "1" "referencia" => array:1 [ 0 => array:2 [ "contribucion" => array:1 [ 0 => array:2 [ "titulo" => "WHO. Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections: overview and estimates (WHO/HIV_AIDS/2001.02WHO/CDS/CSR/EDC/2001.10). 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| 2020 Mayo | 27 | 10 | 37 |
| 2020 Abril | 28 | 5 | 33 |
| 2020 Marzo | 39 | 5 | 44 |
| 2020 Febrero | 12 | 8 | 20 |
| 2020 Enero | 17 | 6 | 23 |
| 2019 Diciembre | 32 | 18 | 50 |
| 2019 Noviembre | 14 | 7 | 21 |
| 2019 Octubre | 19 | 7 | 26 |
| 2019 Septiembre | 16 | 1 | 17 |
| 2019 Agosto | 23 | 4 | 27 |
| 2019 Julio | 30 | 12 | 42 |
| 2019 Junio | 35 | 15 | 50 |
| 2019 Mayo | 86 | 24 | 110 |
| 2019 Abril | 42 | 20 | 62 |
| 2019 Marzo | 17 | 6 | 23 |
| 2019 Febrero | 21 | 5 | 26 |
| 2019 Enero | 12 | 5 | 17 |
| 2018 Diciembre | 17 | 2 | 19 |
| 2018 Noviembre | 21 | 2 | 23 |
| 2018 Octubre | 26 | 10 | 36 |
| 2018 Septiembre | 22 | 4 | 26 |
| 2018 Agosto | 8 | 0 | 8 |
| 2018 Julio | 12 | 0 | 12 |
| 2018 Junio | 12 | 2 | 14 |
| 2018 Mayo | 11 | 1 | 12 |
| 2018 Abril | 22 | 1 | 23 |
| 2018 Marzo | 6 | 0 | 6 |
| 2018 Febrero | 5 | 0 | 5 |
| 2018 Enero | 12 | 1 | 13 |
| 2017 Diciembre | 5 | 0 | 5 |
| 2017 Noviembre | 35 | 3 | 38 |
| 2017 Octubre | 23 | 2 | 25 |
| 2017 Septiembre | 16 | 0 | 16 |
| 2017 Agosto | 16 | 2 | 18 |
| 2017 Julio | 9 | 1 | 10 |
| 2017 Junio | 15 | 5 | 20 |
| 2017 Mayo | 9 | 2 | 11 |
| 2017 Abril | 15 | 0 | 15 |
| 2017 Marzo | 32 | 33 | 65 |
| 2017 Febrero | 28 | 2 | 30 |
| 2017 Enero | 20 | 0 | 20 |
| 2016 Diciembre | 36 | 5 | 41 |
| 2016 Noviembre | 55 | 4 | 59 |
| 2016 Octubre | 43 | 7 | 50 |
| 2016 Septiembre | 44 | 9 | 53 |
| 2016 Agosto | 21 | 1 | 22 |
| 2016 Julio | 35 | 2 | 37 |
| 2016 Junio | 41 | 10 | 51 |
| 2016 Mayo | 27 | 10 | 37 |
| 2016 Abril | 18 | 4 | 22 |
| 2016 Marzo | 27 | 3 | 30 |
| 2016 Febrero | 26 | 8 | 34 |
| 2016 Enero | 27 | 6 | 33 |
| 2015 Diciembre | 27 | 10 | 37 |
| 2015 Noviembre | 45 | 4 | 49 |
| 2015 Octubre | 36 | 3 | 39 |
| 2015 Septiembre | 49 | 5 | 54 |
| 2015 Agosto | 22 | 4 | 26 |
| 2015 Julio | 17 | 0 | 17 |
| 2015 Junio | 18 | 0 | 18 |
| 2015 Mayo | 29 | 7 | 36 |
| 2015 Abril | 13 | 7 | 20 |
| 2015 Marzo | 23 | 4 | 27 |
| 2015 Febrero | 18 | 3 | 21 |
| 2015 Enero | 34 | 0 | 34 |
| 2014 Diciembre | 42 | 4 | 46 |
| 2014 Noviembre | 43 | 4 | 47 |
| 2014 Octubre | 51 | 3 | 54 |
| 2014 Septiembre | 40 | 3 | 43 |
| 2014 Agosto | 33 | 4 | 37 |
| 2014 Julio | 51 | 7 | 58 |
| 2014 Junio | 43 | 3 | 46 |
| 2014 Mayo | 25 | 3 | 28 |
| 2014 Abril | 31 | 3 | 34 |
| 2014 Marzo | 49 | 2 | 51 |
| 2014 Febrero | 46 | 1 | 47 |
| 2014 Enero | 38 | 2 | 40 |
| 2013 Diciembre | 43 | 2 | 45 |
| 2013 Noviembre | 55 | 1 | 56 |
| 2013 Octubre | 55 | 5 | 60 |
| 2013 Septiembre | 49 | 5 | 54 |
| 2013 Agosto | 54 | 5 | 59 |
| 2013 Julio | 42 | 2 | 44 |
| 2013 Junio | 14 | 0 | 14 |
| 2013 Mayo | 23 | 0 | 23 |
| 2013 Abril | 8 | 0 | 8 |
| 2013 Marzo | 5 | 0 | 5 |
| 2013 Febrero | 5 | 0 | 5 |
| 2013 Enero | 6 | 0 | 6 |
| 2012 Diciembre | 1 | 0 | 1 |
| 2012 Noviembre | 1 | 0 | 1 |
| 2012 Octubre | 3 | 0 | 3 |
| 2009 Noviembre | 890 | 0 | 890 |
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