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Inicio Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica Aplicaciones de la proteómica en el laboratorio de Microbiología Clínica
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Aplicaciones de la proteómica en el laboratorio de Microbiología Clínica
Proteomic applications in the Clinical Microbiology laboratory
Juan Luis Muñoz Bellidoa,b,c,
Autor para correspondencia
jlmubel@usal.es

Autor para correspondencia.
, Silvia Vega Castañoa,b, Laura Ferreirac,d, Fernando Sánchez Juanesc,d, José Manuel González Buitragoc,d,e
a Departamento de Medicina Preventiva, Salud Pública y Microbiología Médica, Universidad de Salamanca, Salamanca, España
b Servicio de Microbiología, Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, España
c G.I.R. MICRAPE, Universidad de Salamanca, Salamanca, España
d Unidad de Investigación, Hospital Universitario de Salamanca, Salamanca, España
e Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Universidad de Salamanca, Salamanca, España
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    "textoCompleto" => "<span class="elsevierStyleSections"><span id="sec0005" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle">Introducci&#243;n</span><p id="par0005" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Durante a&#241;os&#44; la identificaci&#243;n bacteriana en el laboratorio de Microbiolog&#237;a Cl&#237;nica se ha venido llevando a cabo&#44; de manera rutinaria&#44; de acuerdo a caracter&#237;sticas fenot&#237;picas de los microorganismos &#40;morfolog&#237;a&#44; estructura de la pared puesta de manifiesto mediante diferentes tinciones&#44; capacidad del microorganismo para crecer en diferentes medios de cultivo y en distintas condiciones de atm&#243;sfera y temperatura&#44; capacidad para degradar o utilizar mediante distintas v&#237;as bioqu&#237;micas sustratos diversos y&#44; en algunos casos&#44; caracter&#237;sticas concretas de sensibilidad a ciertos antimicrobianos&#41;&#46; Algunas de estas pruebas no han sufrido una evoluci&#243;n tecnol&#243;gica significativa en d&#233;cadas&#46; Otras han evolucionado en lo relativo a la miniaturizaci&#243;n de las bater&#237;as de pruebas y la automatizaci&#243;n de su realizaci&#243;n y lectura&#44; y han experimentado mejoras sensibles en lo relativo al tiempo de respuesta&#46;</p><p id="par0010" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Sin embargo&#44; la mayor parte de las t&#233;cnicas microbiol&#243;gicas convencionales contin&#250;an bas&#225;ndose en principios y pruebas que requieren el crecimiento del microorganismo&#44; lo que hace que la identificaci&#243;n pueda retrasarse desde horas hasta varias semanas tras la recepci&#243;n de la muestra&#46; Por otra parte&#44; estas t&#233;cnicas tienen limitaciones evidentes en cuanto a su aplicabilidad y fiabilidad cuando se trata de microorganismos que crecen con dificultad&#44; o no crecen en absoluto en medios de cultivo&#44; o que muestran una actividad bioqu&#237;mica muy limitada&#46;</p><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Hace ya a&#241;os&#44; se empezaron a desarrollar diferentes metodolog&#237;as&#44; basadas sobre todo en t&#233;cnicas gen&#233;ticas&#44; dirigidas a salvar estas limitaciones&#46; Estas t&#233;cnicas han supuesto una aportaci&#243;n importante en algunos aspectos&#44; como fiabilidad de la identificaci&#243;n y&#44; en algunos casos&#44; diagn&#243;stico directo a partir de la muestra sin cultivo previo&#46; Sin embargo&#44; estas t&#233;cnicas solo han conseguido hasta el momento imponerse a las t&#233;cnicas cl&#225;sicas en algunos casos&#44; debido a diferentes problemas como complejidad t&#233;cnica&#44; disponibilidad solo para ciertos microorganismos y relaci&#243;n coste&#47;beneficio&#46; En conjunto&#44; la irrupci&#243;n de las t&#233;cnicas gen&#233;ticas ha tenido una repercusi&#243;n muy importante en virolog&#237;a cl&#237;nica&#44; mientras en bacteriolog&#237;a&#44; micolog&#237;a y parasitolog&#237;a esta repercusi&#243;n ha sido&#44; por el momento&#44; menor&#46;</p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle">Espectrometr&#237;a de masas matrix-assisted laser desorption&#47;ionization time of flight &#40;MALDI-TOF&#41;</span><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La espectrometr&#237;a de masas &#40;EM&#41;&#44; en sus distintas modalidades t&#233;cnicas&#44; ha sido una t&#233;cnica muy utilizada para la identificaci&#243;n de mol&#233;culas en diferentes ramas de la ciencia durante buena parte del siglo XX&#46; Hasta la d&#233;cada de 1990 las prote&#237;nas se hab&#237;an resistido a su an&#225;lisis por espectrometr&#237;a de masas debido fundamentalmente a la dificultad de generar iones a partir de estas mol&#233;culas grandes no vol&#225;tiles&#46; A finales de los ochenta se presentaron dos m&#233;todos que permitir&#237;an la ionizaci&#243;n de las prote&#237;nas&#46; Estos eran la ionizaci&#243;n por pulverizaci&#243;n el&#233;ctrica &#40;electrospray ionization&#44; ESI&#41; y la desabsorci&#243;n&#47;ionizaci&#243;n por l&#225;ser con ayuda de una matriz &#40;matrix-assisted laser desorption&#47;ionization&#44; MALDI&#41;&#46; A partir de ese momento la espectrometr&#237;a de masas pudo utilizarse para estudios de prote&#237;nas&#46;</p><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La espectrometr&#237;a de masas MALDI-TOF&#46; Se trata de un m&#233;todo que&#44; mediante la aplicaci&#243;n de energ&#237;a laser a una muestra embebida en una matriz&#44; consigue vaporizar e ionizar esa matriz&#44; que eventualmente puede arrastrar en esa vaporizaci&#243;n e ionizar a su vez a una muestra representativa de las prote&#237;nas contenidas en la muestra&#46; Esas prote&#237;nas ionizadas son sometidas a aceleraci&#243;n en un campo el&#233;ctrico y a una migraci&#243;n a trav&#233;s de un tubo de vac&#237;o hasta un detector&#46; El tiempo que transcurra desde su vaporizaci&#243;n&#47;ionizaci&#243;n hasta su detecci&#243;n depender&#225; del cociente masa&#47;carga &#40;m&#47;z&#41; de esa prote&#237;na&#44; y ese cociente m&#47;z permitir&#225; determinar la masa exacta de la prote&#237;na de manera extremadamente fiable&#46; En el caso de los microorganismos&#44; se genera de esta forma un perfil de prote&#237;nas con diferentes cocientes m&#47;z&#44; que se comporta como una huella dactilar&#44; permitiendo identificar con gran fiabilidad al microorganismo a partir de dicho perfil&#46;</p></span><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle">Aplicaci&#243;n de la espectrometr&#237;a de masas maldi-tof a la identificaci&#243;n de microorganismos</span><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La primera descripci&#243;n del uso de la espectrometr&#237;a de masas para la identificaci&#243;n bacteriana data de 1975&#46; En aquella &#233;poca el rango de masas estaba limitado a peque&#241;as mol&#233;culas&#44; lo que restring&#237;a las aplicaciones de la EM a l&#237;pidos bacterianos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0005"><span class="elsevierStyleSup">1&#8211;4</span></a>&#46; Las prote&#237;nas tienen un orden de magnitud mayor&#44; y su an&#225;lisis por EM tuvo que esperar a la llegada de las t&#233;cnicas suaves de ionizaci&#243;n como el MALDI&#46; A partir de ese momento el MALDI-TOF comenz&#243; a utilizarse en la identificaci&#243;n bacteriana por grupos de investigaci&#243;n&#46; En el 2004&#44; se describi&#243; la primera base de datos completa para la identificaci&#243;n bacteriana&#44; basada en el an&#225;lisis de mol&#233;culas de superficie&#44; pero no fue bien acogida para ser utilizada como identificaci&#243;n rutinaria&#44; ya que necesitaba una estandarizaci&#243;n muy rigurosa debido a la variaci&#243;n de las prote&#237;nas de superficie&#46; Sin embargo&#44; el cambio de matriz permiti&#243; la ionizaci&#243;n de prote&#237;nas&#44; fundamentalmente ribos&#243;micas&#44; m&#225;s conservadas que las anteriores&#44; lo cual se consider&#243; m&#225;s adecuado para la identificaci&#243;n rutinaria de bacterias&#44; ya que parec&#237;a que las condiciones de cultivo no variaban los resultados de la identificaci&#243;n&#46; A partir de ese momento se desarrollaron sistemas comerciales con bases de datos y programas de manejo sencillo&#44; empezando a usarse la EM MALDI-TOF como un m&#233;todo r&#225;pido y fiable para la identificaci&#243;n bacteriana<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0025"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a>&#46; Se hab&#237;an efectuado estudios parciales sobre su efectividad para la identificaci&#243;n de determinados microorganismos en condiciones controladas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0030"><span class="elsevierStyleSup">6&#8211;8</span></a>&#44; pero recientemente han empezado a aparecer numerosos trabajos relativos a su efectividad en la identificaci&#243;n de aislamientos cl&#237;nicos&#44; sometidos a esta prueba directamente desde los medios de cultivo rutinarios y sin condiciones especiales<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0045"><span class="elsevierStyleSup">9</span></a>&#46;</p><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle">Bacterias aerobias</span><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los estudios disponibles sobre la identificaci&#243;n directa de microorganismos a partir del crecimiento en medios de cultivo habituales muestran excelentes resultados&#44; con porcentajes de coincidencia con la identificaci&#243;n bioqu&#237;mica convencional superiores al 90&#37;&#46; Estos altos niveles de correlaci&#243;n se dan tanto en gram positivos como en gram negativos&#46; Por otra parte&#44; cuando las discrepancias entre la EM y la identificaci&#243;n convencional se han comprobado mediante secuenciaci&#243;n del ARNr 16S&#44; se ha demostrado que&#44; en la mayor&#237;a de los casos&#44; esta t&#233;cnica corroboraba los resultados ofrecidos por la EM MALDI-TOF&#46; As&#237;&#44; uno de los primeros trabajos publicados con la tecnolog&#237;a disponible actualmente<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0050"><span class="elsevierStyleSup">10</span></a>&#44; un estudio retrospectivo sobre 1&#46;116 aislamientos cl&#237;nicos y 108 cepas tipo&#44; mostr&#243; un 93&#44;5&#37; de identificaciones correctas por MALDI-TOF para las cepas tipo&#44; y un 95&#44;2&#37; para los aislamientos cl&#237;nicos&#46; Las identificaciones correctas estuvieron por encima del 90&#37; en el caso de enterobacterias &#40;95&#44;5&#37;&#41;&#44; estafilococos &#40;99&#44;5&#37;&#41;&#44; enterococos &#40;100&#37;&#41; y estreptococos &#40;93&#44;7&#37;&#41;&#44; mientras bajaron al 79&#44;7&#37; en bacilos gram negativos no fermentadores&#46;</p><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los estudios prospectivos realizados a partir de ese momento sobre aislamientos obtenidos de muestras cl&#237;nicas ofrecen cifras parecidas&#46; Uno de los estudios que han tenido mayor trascendencia<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0045"><span class="elsevierStyleSup">9</span></a>&#44; publicado en 2009 en Clinical Infectious Diseases y realizado sobre 1&#46;660 aislamientos pertenecientes a 109 especies&#44; muestra una eficacia en la identificaci&#243;n del 95&#44;4&#37; a nivel de g&#233;nero&#44; y del 84&#44;1&#37; a nivel de especie&#46; Un estudio publicado por Bizzini et al en 2010<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0055"><span class="elsevierStyleSup">11</span></a> sobre 1&#46;371 aislamientos muestra un 98&#44;5&#37; de identificaciones correctas a nivel de g&#233;nero y un 93&#44;2&#37; a nivel de especie&#44; con solo un 1&#44;5&#37; de identificaciones fallidas&#46;</p><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Un estudio publicado tambi&#233;n en 2010 por Cherkaoui et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0060"><span class="elsevierStyleSup">12</span></a> sobre 720 aislamientos pertenecientes a 33 g&#233;neros&#44; comparando dos sistemas comerciales &#40;Bruker Daltonics y Shimadzu&#41;&#44; mostr&#243; un 93&#44;6&#37; de identificaciones fiables a nivel de especie &#40;score<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#62;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>2&#44;0&#41; para el primer sistema y un 88&#44;3&#37; para el segundo&#44; de las que un 99&#44;1&#37; fueron corroboradas mediante secuenciaci&#243;n de RNA 16S&#46; Otro estudio publicado por Van Veen et al&#44; tambi&#233;n en 2010<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0065"><span class="elsevierStyleSup">13</span></a> sobre 980 aislamientos&#44; muestra un 97&#44;2&#37; de correlaci&#243;n con la metodolog&#237;a convencional a nivel de g&#233;nero&#44; y un 79&#44;9&#37; a nivel de especie&#46; La mayor correlaci&#243;n a nivel de g&#233;nero o especie se obtuvo en enterobacterias &#40;97&#44;7&#37;&#41;&#44; seguidas de estafilococos &#40;94&#44;3&#37;&#41;&#44; bacilos gram negativos no fermentadores &#40;92&#37;&#41;&#44; estreptococos &#40;84&#44;8&#37;&#41; y&#44; finalmente&#44; del grupo <span class="elsevierStyleItalic">Haemophilus&#44; Actinobacillus&#44; Cardiobacterium&#44; Eikenella</span> y <span class="elsevierStyleItalic">Kingella</span> &#40;HACEK&#41; con un 84&#37;&#46;</p><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Otros estudios m&#225;s reducidos publicados recientemente muestran resultados similares&#46; As&#237;&#44; un estudio publicado por Risch et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0070"><span class="elsevierStyleSup">14</span></a> muestra una correlaci&#243;n entre MALDI-TOF y la identificaci&#243;n bioqu&#237;mica convencional &#40;Vitek&#44; bioM&#233;rieux&#44; Francia&#41; del 88&#37; en gram negativos y del 85&#37; en gram positivos&#44; pero no llega a discriminar entre ambos sistemas por una t&#233;cnica de referencia como la secuenciaci&#243;n de RNA 16S&#46; Finalmente&#44; un estudio reciente sobre 10&#46;000 aislamientos publicado por Gravet et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0075"><span class="elsevierStyleSup">15</span></a> muestra una correlaci&#243;n a nivel de g&#233;nero y especie del 98&#44;8&#37;&#46;</p><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El estudio m&#225;s amplio publicado hasta el momento en Espa&#241;a<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0080"><span class="elsevierStyleSup">16</span></a> muestra una correlaci&#243;n del 100&#37; a nivel de especie en una muestra de 65 gram positivos que incluye estreptococos&#44; estafilococos&#44; corinebacterias y <span class="elsevierStyleItalic">Listeria</span>&#44; y una correlaci&#243;n del 87&#44;7&#37; a nivel de especie&#44; y del 97&#44;7&#37; a nivel de g&#233;nero en una muestra de 229 gram negativos&#46; En este caso tampoco se realiz&#243; estudio de rRNA 16S&#44; con lo cual las discrepancias pueden deberse a error de cualquiera de los sistemas utilizados&#46;</p><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Como es evidente&#44; no todos los grupos de microorganismos se identifican con la misma fiabilidad mediante EM MALDI-TOF&#46; Los datos disponibles sugieren que se trata de un sistema extremadamente fiable en gram negativos fermentadores con algunas excepciones como la no discriminaci&#243;n entre <span class="elsevierStyleItalic">Escherichia</span> y <span class="elsevierStyleItalic">Shigella</span>&#44; y bastante fiable en no fermentadores&#46; Aunque los datos de diversos estudios muestran una correlaci&#243;n con los sistemas de identificaci&#243;n convencionales menor que en otros gram negativos&#44; lo cierto es que esta discrepancia puede derivar de deficiencias en cualquiera de los dos sistemas&#46; De hecho&#44; un estudio publicado por Mellman et al en 2008<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0085"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a> muestra que&#44; en bacilos gram negativos no fermentadores&#44; los resultados de MALDI-TOF se correlacionan con los obtenidos por secuenciaci&#243;n de rRNA 16S en m&#225;s del 85&#37; de los casos&#44; una cifra sin duda superior a la que ofrecen los sistemas bioqu&#237;micos convencionales de identificaci&#243;n&#46; La identificaci&#243;n en gram positivos aerobios es tambi&#233;n bastante fiable&#44; con la excepci&#243;n de la frecuente confusi&#243;n entre <span class="elsevierStyleItalic">Streptococcus pneumoniae</span> y otros estreptococos <span class="elsevierStyleItalic">viridans</span> &#40;<span class="elsevierStyleItalic">S&#46; mitis</span> fundamentalmente&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0090"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a>&#46; En cuanto a otros grupos espec&#237;ficos como los microorganismos anaerobios o las micobacterias&#44; los resultados son m&#225;s heterog&#233;neos&#46;</p></span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle">Bacterias anaerobias</span><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Ya en 2002&#44; Shah et al auguraban que la EM MALDI-TOF iba a tener un impacto importante en el diagn&#243;stico microbiano de los numerosos microorganismos anaerobios que crecen mal en los medios de cultivo habituales y son virtualmente arreactivos en los sistemas de identificaci&#243;n convencionales<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0095"><span class="elsevierStyleSup">19</span></a>&#46; Estudios aparecidos con posterioridad muestran buenos resultados en la identificaci&#243;n de <span class="elsevierStyleItalic">Clostridium</span> aunque&#44; como es l&#243;gico&#44; muy condicionados por la calidad de la biblioteca de espectros que se utilice como referencia<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0100"><span class="elsevierStyleSup">20</span></a>&#46; Otro estudio reciente muestra asimismo buenos resultados en la identificaci&#243;n de especies de <span class="elsevierStyleItalic">Prevotella</span> aisladas de cuadros de periodontitis<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0105"><span class="elsevierStyleSup">21</span></a>&#46; En un estudio m&#225;s amplio sobre 270 aislamientos cl&#237;nicos de bacterias anaerobias&#44; el 97&#44;5&#37; fueron identificados de manera inequ&#237;voca &#40;score<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#62;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>2&#44;00&#41; por MALDI-TOF&#46; Adem&#225;s&#44; en 10 de los 11 aislamientos en que se observaron discrepancias con la identificaci&#243;n convencional&#44; la secuenciaci&#243;n del rRNA 16S confirm&#243; la identificaci&#243;n obtenida por MALDI-TOF<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0110"><span class="elsevierStyleSup">22</span></a>&#46; Del mismo modo&#44; otra publicaci&#243;n realizada en 2001 muestra un 95&#37; de identificaciones correctas en cocos gram positivos anaerobios&#44; en comparaci&#243;n con la secuenciaci&#243;n de rRNA 16S<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0115"><span class="elsevierStyleSup">23</span></a>&#46;</p><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Sin embargo&#44; las publicaciones m&#225;s recientes ofrecen resultados menos halag&#252;e&#241;os&#46; En un estudio comparativo de los dos sistemas comerciales m&#225;s difundidos &#40;Bruker Daltonics y Shimadzu&#41; sobre 79 aislamientos pertenecientes a 19 g&#233;neros&#44; y usando como referencia la secuenciaci&#243;n de rRNA 16S&#44; Shimadzu identific&#243; correctamente el 71&#37; de los aislamientos a nivel de g&#233;nero&#44; y el 61&#37; a nivel de especie&#46; Bruker Daltonics obtuvo resultados inferiores&#44; con un 61 y un 51&#37;&#44; respectivamente&#46; No obstante&#44; cuando el mismo estudio se realiz&#243; con una versi&#243;n actualizada del software de Bruker Daltonics&#44; los resultados se equipararon<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0120"><span class="elsevierStyleSup">24</span></a>&#46; Otro estudio posterior&#44; tambi&#233;n publicado en 2011 sobre m&#225;s de 500 aislamientos de bacterias anaerobias&#44; muestra tambi&#233;n porcentajes de identificaci&#243;n correcta del 61&#37;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0125"><span class="elsevierStyleSup">25</span></a>&#44; y el estudio m&#225;s reciente publicado hasta el momento muestra porcentajes similares &#40;67&#37; de identificaciones correctas con Bruker frente a 49&#37; con Shimadzu&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0130"><span class="elsevierStyleSup">26</span></a>&#46; Estos estudios vienen de nuevo a incidir en la gran importancia de la amplitud y correcci&#243;n de la base de datos para obtener buenos resultados con este sistema<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0130"><span class="elsevierStyleSup">26</span></a>&#46; Otros autores coinciden en que la utilidad cl&#237;nica de estos sistemas para la identificaci&#243;n de bacterias anaerobias pasa por una optimizaci&#243;n de las bases de datos disponibles<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0135"><span class="elsevierStyleSup">27</span></a>&#46; Probablemente las limitaciones de los m&#233;todos convencionales utilizados para la identificaci&#243;n de bacterias anaerobias han dado una visi&#243;n err&#243;neamente reducida de la variedad de especies anaerobias presentes en los diferentes nichos ecol&#243;gicos&#46; Como consecuencia&#44; un n&#250;mero importante de aislamientos a los que por los m&#233;todos tradicionales se asignaba una identificaci&#243;n presuntamente fiable al presentar un comportamiento bioqu&#237;mico similar al de especies conocidas&#44; no se identifican por m&#233;todos m&#225;s espec&#237;ficos&#44; como MALDI-TOF&#44; al no estar sus perfiles incluidos en las bases de datos&#46; Esto es debido a que se trata&#44; en realidad&#44; de especies que se consideraban muy infrecuentes&#44; o de especies totalmente nuevas&#46; As&#237;&#44; en un estudio reciente<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0125"><span class="elsevierStyleSup">25</span></a> en que solo se identificaron el 61&#37; de los aislamientos anaerobios por MALDI-TOF&#44; el 39&#37; se identific&#243; mediante secuenciaci&#243;n de rRNA&#44; hall&#225;ndose entre ellas siete especies o g&#233;neros nuevos&#46; Otro estudio reciente demuestra que&#44; si se elaboran bases de datos de referencia amplias de los grupos fenot&#237;picos basadas en una identificaci&#243;n inequ&#237;voca por secuenciaci&#243;n de rRNA 16S&#44; los resultados posteriores de la EM MALDI-TOF en muestras cl&#237;nicas mejoran sensiblemente<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0115"><span class="elsevierStyleSup">23</span></a>&#46; Del mismo modo&#44; un estudio reciente limitado al g&#233;nero <span class="elsevierStyleItalic">Bacteroides</span> muestra que la correlaci&#243;n con la secuenciaci&#243;n del rRNA 16S es mucho mayor en el caso de la EM MALDI-TOF que en el de la identificaci&#243;n bioqu&#237;mica convencional&#44; y que en la mayor&#237;a de los casos&#44; las identificaciones err&#243;neas derivan de la no inclusi&#243;n de algunas especies descritas recientemente en las bases de datos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0140"><span class="elsevierStyleSup">28</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle">Micobacterias</span><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Una de las &#225;reas todav&#237;a menos exploradas es probablemente la de las micobacterias&#46; El estudio m&#225;s amplio disponible hasta el momento es el de Lotz et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0145"><span class="elsevierStyleSup">29</span></a>&#44; realizado sobre 311 cepas pertenecientes a 31 especies y 4 complejos&#46; El estudio compara la eficacia en la identificaci&#243;n a partir de L&#246;wenstein-Jensen y de MGIT con un m&#233;todo directo &#40;sin extracci&#243;n&#41;&#44; obteniendo un 97&#37; de identificaciones correctas en el primero y un 77&#37; en el segundo&#46; No se produjo ning&#250;n error de identificaci&#243;n a nivel de g&#233;nero&#44; pero las cepas pertenecientes a especies del complejo <span class="elsevierStyleItalic">tuberculosis</span> se identificaron solamente a nivel de complejo&#44; siendo imposible su diferenciaci&#243;n a nivel de especie&#46; Este resultado ha sido corroborado por un estudio posterior<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0150"><span class="elsevierStyleSup">30</span></a>&#44; que tambi&#233;n obtiene buenos resultados&#44; pero en el que&#44; al igual que en el estudio de Lotz et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0145"><span class="elsevierStyleSup">29</span></a>&#44; las especies del complejo <span class="elsevierStyleItalic">tuberculosis</span> son identificadas solamente a nivel de complejo&#44; pero no de especie&#46; Del mismo modo&#44; en este estudio&#44; la EM MALDI-TOF no fue capaz de discriminar entre especies muy pr&#243;ximas como <span class="elsevierStyleItalic">M&#46; abscessus&#47;M&#46; massiliense&#44; M&#46; mucogenicum&#47;M&#46; phocaicum</span>&#44; y <span class="elsevierStyleItalic">M&#46; chimaera&#47;M&#46; intracellulare</span>&#46; Otro estudio m&#225;s reciente&#44; realizado mediante un protocolo de extracci&#243;n desarrollado espec&#237;ficamente&#44; que incluye inactivaci&#243;n por calor&#44; ruptura mec&#225;nica de la pared celular bacteriana y extracci&#243;n de prote&#237;nas con acetonitrilo y &#225;cido f&#243;rmico&#44; permite obtener buenos perfiles proteicos a partir de cantidades peque&#241;as de bacterias &#40;10<span class="elsevierStyleSup">5</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>UFC&#41;&#44; y permiti&#243; identificar correctamente 87 aislamientos cl&#237;nicos de <span class="elsevierStyleItalic">M&#46; tuberculosis</span>&#44; 25 de <span class="elsevierStyleItalic">M&#46; avium</span> y 12 de otras especies de micobacterias<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0155"><span class="elsevierStyleSup">31</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle">Otros g&#233;neros y especies bacterianos</span><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El espectro de bacterias susceptibles de identificaci&#243;n mediante este sistema&#44; a priori&#44; tiene muy pocas limitaciones&#44; salvo que requiere al menos para su uso convencional crecimiento en un medio de cultivo&#44; y que est&#225; muy vinculado a la amplitud y complejidad de las bases de datos de perfiles proteicos de referencia y el <span class="elsevierStyleItalic">software</span> utilizados&#46; No obstante&#44; puede presentar algunos problemas de especificidad entre g&#233;neros o especies muy pr&#243;ximos&#44; como se ha descrito para <span class="elsevierStyleItalic">Shigella</span> y <span class="elsevierStyleItalic">Escherichia</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0160"><span class="elsevierStyleSup">32</span></a>&#44; <span class="elsevierStyleItalic">Streptococcus mitis</span> y <span class="elsevierStyleItalic">S&#46; pneumoniae</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0090"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a>&#44; o especies del g&#233;nero <span class="elsevierStyleItalic">Brucella</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165"><span class="elsevierStyleSup">33</span></a>&#44; o especies muy pr&#243;ximas de micobacterias&#44; como se ha mencionado en el apartado anterior<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0150"><span class="elsevierStyleSup">30</span></a>&#46; Por lo dem&#225;s&#44; se ha demostrado su capacidad para identificar los g&#233;neros y especies m&#225;s diversos&#44; desde <span class="elsevierStyleItalic">Bacillus anthracis</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">34</span></a> a <span class="elsevierStyleItalic">Listeria</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0175"><span class="elsevierStyleSup">35</span></a>&#44; <span class="elsevierStyleItalic">Brucella</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165"><span class="elsevierStyleSup">33</span></a>&#44; el grupo HACEK<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0180"><span class="elsevierStyleSup">36</span></a>&#44; <span class="elsevierStyleItalic">Nocardia</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0185"><span class="elsevierStyleSup">37</span></a> o <span class="elsevierStyleItalic">Dermatophilus congolensis</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0190"><span class="elsevierStyleSup">38</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle">Hongos</span><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Otro grupo con caracter&#237;sticas particulares desde el punto de vista de la identificaci&#243;n son los hongos&#46; En general&#44; los datos disponibles muestran excelentes resultados respecto a la identificaci&#243;n de levaduras&#44; mientras los resultados con hongos filamentosos son m&#225;s irregulares&#46;</p><p id="par0090" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Varios de los primeros estudios generales sobre identificaci&#243;n bacteriana introducen tambi&#233;n grupos&#44; en general peque&#241;os&#44; de aislamientos de levaduras&#44; obteniendo buenos resultados&#46; As&#237;&#44; Cherkaoui et al&#44; en 2010&#44; demuestran una eficacia del 95&#37; en la identificaci&#243;n de especies del g&#233;nero <span class="elsevierStyleItalic">Candida</span>&#44; aunque sobre un grupo de solo 24 aislamientos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0060"><span class="elsevierStyleSup">12</span></a>&#46; En un estudio del mismo tipo en el que se incluyen 61 aislamientos de levaduras&#44; Van Veen et al obtienen un porcentaje de identificaciones correctas del 96&#44;7&#37; a nivel de g&#233;nero y del 85&#44;2&#37; a nivel de especie<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0065"><span class="elsevierStyleSup">13</span></a>&#46;</p><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Trabajos centrados m&#225;s espec&#237;ficamente en levaduras y con mayor n&#250;mero de cepas muestran resultados similares&#46; As&#237;&#44; un estudio sobre m&#225;s de 200 aislamientos de 16 especies de levaduras mostr&#243; una exactitud en la identificaci&#243;n pr&#243;xima al 100&#37;&#44; diferenciando adem&#225;s con gran exactitud <span class="elsevierStyleItalic">C&#46; parapsilosis</span>&#44; <span class="elsevierStyleItalic">C&#46; orthopsilosis</span> y <span class="elsevierStyleItalic">C&#46; metapsilosis</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0195"><span class="elsevierStyleSup">39</span></a>&#46; Otros estudios posteriores sobre mayor n&#250;mero de aislamientos ofrecen datos similares&#44; con porcentajes de identificaci&#243;n correcta por encima del 95&#37; y buena discriminaci&#243;n entre especies dif&#237;ciles de diferenciar por otros m&#233;todos&#44; como las referidas anteriormente o <span class="elsevierStyleItalic">C&#46; glabrata</span> y <span class="elsevierStyleItalic">C&#46; bracarensis</span><a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0200"><span class="elsevierStyleSup">40&#8211;42</span></a>&#46; Los datos disponibles en nuestro laboratorio &#40;datos no publicados&#41; corroboran estos &#237;ndices de eficacia en la identificaci&#243;n de levaduras&#46; Solamente un estudio reciente refiere unos resultados algo peores&#44; ya que entre 303 aislamientos cl&#237;nicos de levaduras&#44; 20 &#40;6&#44;6&#37;&#41; no fueron identificados por EM debido a carencias en la base de datos&#44; y de 26 identificaciones discrepantes con Vitek-2&#44; en 21 &#40;6&#44;9&#37;&#41; se consider&#243; que la identificaci&#243;n mediante EM hab&#237;a sido err&#243;nea al comprobarlas por m&#233;todos gen&#233;ticos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0215"><span class="elsevierStyleSup">43</span></a>&#46;</p><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Existen muchos menos datos relativos a la identificaci&#243;n de hongos filamentosos&#46; Aunque los primeros estudios suger&#237;an unos resultados bastante aceptables<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0220"><span class="elsevierStyleSup">44&#8211;47</span></a>&#44; existe la idea de que la fiabilidad de la EM MALDI-TOF en este grupo es sensiblemente menor&#46; La heterogeneidad de los resultados obtenidos con hongos filamentosos probablemente se relaciona con los diferentes perfiles proteicos que muestran estos microorganismos en funci&#243;n de diferentes caracter&#237;sticas del cultivo&#44; como el tiempo o el propio medio utilizado&#44; y con la diferente composici&#243;n proteica de las distintas partes del hongo<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0240"><span class="elsevierStyleSup">48</span></a>&#46; Se ha sugerido una posible relaci&#243;n de esta situaci&#243;n con la inexistencia de protocolos optimizados para el procesamiento de estos microorganismos&#44; de modo que protocolos m&#225;s estrictos en cuanto a medios de cultivo&#44; tiempos de incubaci&#243;n&#44; etc&#46; mejorar&#237;an los resultados&#46; Sin embargo&#44; el establecimiento de protocolos que obliguen a realizar subcultivos o a prolongar los tiempos de incubaci&#243;n&#44; afectar&#237;an sensiblemente a una de las principales ventajas de esta tecnolog&#237;a&#44; como es la posibilidad de identificar r&#225;pidamente desde la placa de cultivo primario&#46; Por ello&#44; probablemente tenga mayor inter&#233;s la elaboraci&#243;n de bases de datos m&#225;s complejas&#44; que recojan mayor n&#250;mero de perfiles proteicos de cada especie en diferentes fases de cultivo&#46;</p><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">De hecho&#44; los estudios m&#225;s recientes muestran que&#44; cuando las bibliotecas de perfiles de referencia se elaboran usando colonias tanto j&#243;venes como maduras&#44; los porcentajes de identificaci&#243;n correcta de <span class="elsevierStyleItalic">Aspergillus&#44; Fusarium</span> y mucorales alcanzan valores superiores al 95&#37;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0245"><span class="elsevierStyleSup">49</span></a>&#46; Asimismo&#44; estudios recientes demuestran que a&#241;adiendo una base de datos suplementaria a la base de datos original y con algunos ajustes de los puntos de corte&#44; la identificaci&#243;n de dermatofitos mejora muy significativamente &#40;93 vs&#46; 37&#44;4&#37; a nivel de g&#233;nero y 59&#44;6 vs&#46; 20&#44;5&#37; a nivel de especie&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0250"><span class="elsevierStyleSup">50</span></a>&#46;</p></span></span><span id="sec0045" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle">Aspectos t&#233;cnicos y relaci&#243;n beneficio&#47;coste</span><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Desde el punto de vista t&#233;cnico&#44; la incorporaci&#243;n de esta tecnolog&#237;a a la identificaci&#243;n rutinaria supone en muchos casos un aumento en la fiabilidad y en la rapidez de la misma&#44; fundamentalmente cuando la identificaci&#243;n convencional depende de sistemas que requieren crecimiento del microorganismo&#44; ya que este sistema permite la identificaci&#243;n en unos minutos&#46; La mejora en tiempo y fiabilidad es relativamente modesta en aquellos casos en que la identificaci&#243;n convencional es aceptablemente r&#225;pida &#40;18-24 horas como m&#225;ximo&#41; y fiable&#44; lo cual es cierto que ocurre con buena parte de los pat&#243;genos m&#225;s habituales&#46; Supone&#44; en cambio&#44; una mejora importante en tiempo y fiabilidad cuando se trata de microorganismos en los que la identificaci&#243;n convencional requiere periodos de tiempo m&#225;s largos&#44; o cuando la fiabilidad de los m&#233;todos convencionales es menor&#46; Ello afecta a un n&#250;mero no despreciable de especies&#44; como numerosos bacilos gram negativos no fermentadores&#44; bacilos gram positivos aerobios&#44; bacterias anaerobias&#44; y probablemente la mayor parte de las micobacterias&#44; aunque con algunos de estos grupos la experiencia es todav&#237;a reducida&#46;</p><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Por otra parte&#44; diferentes aportaciones t&#233;cnicas van facilitando el procedimiento&#44; ya inicialmente sencillo&#46; Existen dos m&#233;todos de aplicaci&#243;n de la muestra&#58; mediante extensi&#243;n de la muestra directamente en la placa del espectr&#243;metro de masas y adici&#243;n sobre la misma de la matriz &#40;aplicaci&#243;n directa&#41;&#44; o mediante un paso previo de extracci&#243;n proteica de la muestra con acetonitrilo y &#225;cido f&#243;rmico&#46; Hasta el momento&#44; numerosos microorganismos se identificaban correctamente mediante el m&#233;todo de aplicaci&#243;n directa&#44; mientras que los microorganismos m&#225;s complejos &#40;hongos&#44; micobacterias&#44; algunos anaerobios&#41; requer&#237;an con frecuencia el paso de extracci&#243;n&#44; que aunque sencillo&#44; introduce una complejidad algo mayor en la preparaci&#243;n de la muestra&#46; Sin embargo&#44; estudios recientes sugieren que la simple adici&#243;n de 1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de &#225;cido f&#243;rmico a la muestra aplicada directamente en la placa mejora los resultados hasta cifras similares a las de la extracci&#243;n convencional&#44; simplificando de este modo este procedimiento cuando se considere necesario<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0255"><span class="elsevierStyleSup">51</span></a>&#46;</p><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En cuanto a la relaci&#243;n coste&#47;beneficio&#44; uno de los extremos m&#225;s controvertidos ha sido el precio por identificaci&#243;n&#46; Los equipos de EM tienen un coste de adquisici&#243;n alto&#44; pero en contrapartida el gasto en fungible es muy reducido&#46; Otros sistemas de identificaci&#243;n&#44; como es el caso de los sistemas de identificaci&#243;n bioqu&#237;mica automatizados&#44; tambi&#233;n requieren la amortizaci&#243;n de uno u otro modo &#40;compra&#44; alquiler&#44; etc&#46;&#41; de equipos costosos&#44; y el gasto en fungible es sensiblemente mayor&#46; Seng et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0045"><span class="elsevierStyleSup">9</span></a> han estimado que el coste de la identificaci&#243;n por MALDI-TOF &#40;incluyendo consumibles&#44; gastos de personal y amortizaci&#243;n de equipos&#41; estar&#237;a en torno al 25&#37; del coste de la identificaci&#243;n bioqu&#237;mica convencional &#40;2&#44;44 &#8364; frente a 4&#44;6-13&#44;9 &#8364;&#41;&#46; Cherkaoui et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0060"><span class="elsevierStyleSup">12</span></a> llegan a una conclusi&#243;n similar&#44; cuando afirman que en su estudio sobre 720 aislados&#44; el coste de la identificaci&#243;n por MALDI-TOF&#44; incluyendo el de la reidentificaci&#243;n por m&#233;todos convencionales de los aislados que la EM MALDI-TOF no consigui&#243; identificar&#44; ser&#237;a como media del 25&#37; del coste de la identificaci&#243;n bioqu&#237;mica sistem&#225;tica de todos los aislados&#44; y el tiempo requerido&#44; en torno al 20&#37;&#46; Un estudio reciente muestra asimismo que el sistema es coste efectivo en la identificaci&#243;n de levaduras<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0210"><span class="elsevierStyleSup">42</span></a>&#46; A ello hay que a&#241;adir otra serie de cuestiones quiz&#225; menores pero que&#44; en conjunto&#44; influyen de forma importante en el flujo y la carga de trabajo del personal t&#233;cnico&#46; Es el caso de los subcultivos frecuentemente necesarios para descartar enteropat&#243;genos en coprocultivos&#44; que con esta metodolog&#237;a pueden descartarse directamente a partir de una sola colonia&#44; o los tipos respiratorios y aislamientos en bacterias anaerobias&#44; que esta tecnolog&#237;a hace en muchos casos innecesarios&#46;</p></span><span id="sec0050" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle">Identificaci&#243;n directa a partir de muestras cl&#237;nicas</span><p id="par0125" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Un valor a&#241;adido&#44; que podr&#237;a convertirse en decisivo a la hora de propiciar la implantaci&#243;n definitiva de esta tecnolog&#237;a en los laboratorios de Microbiolog&#237;a Cl&#237;nica&#44; es su capacidad para la identificaci&#243;n de microorganismos directamente a partir de muestras biol&#243;gicas o de hemocultivos&#46;</p><span id="sec0055" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle">Identificaci&#243;n directa en muestras de orina</span><p id="par0130" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Un estudio inicial comunicado al 19&#46;&#176; ECCMID mostraba que la EM MALDI-TOF era capaz de identificar microorganismos causantes de infecci&#243;n urinaria tras un paso de concentraci&#243;n de la orina<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0260"><span class="elsevierStyleSup">52</span></a>&#46; No obstante&#44; como afirma el grupo encabezado por Raoult et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0265"><span class="elsevierStyleSup">53</span></a>&#44; este no parece un m&#233;todo pr&#225;ctico&#44; dado el alto porcentaje de muestras negativas y el uso rutinario de otros m&#233;todos r&#225;pidos&#46; Sin embargo&#44; se ha demostrado que puede identificar con notable eficacia microorganismos causantes de infecci&#243;n urinaria directamente sobre muestras de orina siempre que los recuentos sean altos &#40;por lo general&#44; &#62;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>10<span class="elsevierStyleSup">5</span><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>UFC&#47;mL&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0270"><span class="elsevierStyleSup">54</span></a>&#44; lo cual en combinaci&#243;n con m&#233;todos de cribado como los basados en citometr&#237;a de flujo podr&#237;a constituir una alternativa en el procesamiento de muestras de orina<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0255"><span class="elsevierStyleSup">51</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0060" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle">Identificaci&#243;n directa en hemocultivos</span><p id="par0135" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La EM MALDI-TOF se ha mostrado capaz de identificar microorganismos causantes de bacteriemia directamente desde el hemocultivo&#44; en el momento en que este es identificado como positivo por el sistema automatizado correspondiente&#44; tambi&#233;n con una alta fiabilidad<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0275"><span class="elsevierStyleSup">55&#8211;59</span></a>&#46; Pese a que la identificaci&#243;n directa desde hemocultivo parece haber presentado algunas lagunas&#44; como la identificaci&#243;n de algunos cocos gram positivos o la detecci&#243;n de candidemias&#44; en algunos estudios<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0290"><span class="elsevierStyleSup">58</span></a>&#44; otros muestran excelentes resultados tambi&#233;n en estos aspectos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0300"><span class="elsevierStyleSup">60&#44;61</span></a>&#46; Se trata de una aportaci&#243;n trascendente al manejo cl&#237;nico de las bacteriemias&#44; ya que puede permitir instaurar o modificar tratamientos con un conocimiento exacto del microorganismo implicado&#44; minutos despu&#233;s de ser informado el hemocultivo como positivo&#46; Ayuda a ello el hecho de que&#44; aunque la sensibilidad es todav&#237;a mejorable para la identificaci&#243;n de algunas especies en estas circunstancias&#44; la especificidad es excelente&#44; de modo que cuando el sistema informa de la presencia de un determinado microorganismo con una puntuaci&#243;n suficiente&#44; este dato es extremadamente fiable&#46;</p><p id="par0140" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En este aspecto&#44; los resultados&#44; sobre todo en cuanto a sensibilidad&#44; son variables debido en buena parte a que las metodolog&#237;as propuestas para el procesamiento del hemocultivo&#44; previamente a su introducci&#243;n en el espectr&#243;metro de masas&#44; han sido m&#250;ltiples &#40;centrifugaci&#243;n&#44; lisis con cloruro am&#243;nico&#44; tubos con separador de suero&#44; y &#250;ltimamente sistemas comerciales suministrados por los propios fabricantes de los espectr&#243;metros&#41;&#46; As&#237;&#44; La Scola et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0280"><span class="elsevierStyleSup">56</span></a>&#44; en un estudio sobre m&#225;s de 500 hemocultivos&#44; refieren la identificaci&#243;n correcta del 66&#37; &#40;91&#37; de los gram negativos y 49&#37; de los gram positivos&#41;&#44; Prod&#8217;hom et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0285"><span class="elsevierStyleSup">57</span></a> refieren la identificaci&#243;n correcta del 79&#37; &#40;90&#37; de los gram negativos y 73&#37; de los gram positivos&#41;&#44; si bien es cierto que sobre un n&#250;mero de hemocultivos muy inferior &#40;122 hemocultivos&#41; y Stevenson et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0290"><span class="elsevierStyleSup">58</span></a> refieren&#44; en conjunto&#44; el 76&#44;4&#37; de 212 hemocultivos positivos&#46; Un estudio realizado por nuestro grupo<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0295"><span class="elsevierStyleSup">59</span></a> obtuvo una identificaci&#243;n coincidente con los m&#233;todos convencionales en gram negativos del 83&#44;3&#37; a nivel de especie&#44; y del 96&#44;6&#37; a nivel de g&#233;nero&#46; La correlaci&#243;n fue peor en gram positivos &#40;31&#44;8&#37; a nivel de especie&#44; 64&#44;8&#37; a nivel de g&#233;nero&#41;&#44; sobre todo debido a la falta de correlaci&#243;n en la identificaci&#243;n a nivel de especie de los estafilococos no productores de coagulasa&#44; y a los malos resultados obtenidos con <span class="elsevierStyleItalic">Staphylococcus aureus</span>&#46; De 18 fungemias detectadas por cultivo&#44; solo una se detect&#243; mediante MALDI-TOF&#46; Sin embargo&#44; Marinach-Patrice et al obtienen mejores resultados en la detecci&#243;n de fungemias<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0300"><span class="elsevierStyleSup">60</span></a>&#46;</p><p id="par0145" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Ferroni et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0305"><span class="elsevierStyleSup">61</span></a>&#44; mediante un m&#233;todo que solubiliza selectivamente las c&#233;lulas hem&#225;ticas manteniendo intactas las membranas bacterianas&#44; obtienen por encima del 90&#37; de identificaciones correctas&#44; tanto en bacteriemias como en candidemias&#44; cifras similares a las referidas por otros autores<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0310"><span class="elsevierStyleSup">62</span></a>&#46; Por su parte&#44; Moussaoui et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0315"><span class="elsevierStyleSup">63</span></a>&#44; en un estudio utilizando tubos con gel separador de suero&#44; y solo 1&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ml de hemocultivo&#44; obtienen un 91&#37; de identificaciones correctas a nivel de especie en gram negativos&#44; y un 89&#37; en gram positivos&#46; Ha de tenerse en cuenta que tambi&#233;n existen diferencias respecto a la interpretaci&#243;n de los <span class="elsevierStyleItalic">scores</span> obtenidos en hemocultivos&#44; que pueden influir asimismo en los resultados&#46; Mientras unos autores se ci&#241;en a los <span class="elsevierStyleItalic">scores</span> convencionalmente aceptados de forma general &#40;en el caso de Bruker Daltonics&#44; &#8805;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>2&#44;00 para identificaci&#243;n a nivel de especie&#44; &#62;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>1&#44;7 para identificaci&#243;n a nivel de g&#233;nero&#41;&#44; otros consideran puntos de corte m&#225;s bajos &#40;<span class="elsevierStyleItalic">scores</span> de 1&#44;5&#44; o incluso 1&#44;3&#41; cuando se obtienen repetidamente valores superiores a estos puntos de corte para la misma identificaci&#243;n en el mismo o distintos an&#225;lisis<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0280"><span class="elsevierStyleSup">56</span></a>&#46;</p><p id="par0150" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Algunos estudios han sugerido diferencias significativas en la eficacia de la identificaci&#243;n mediante EM MALDI-TOF entre los diferentes sistemas de hemocultivo disponibles comercialmente&#46; As&#237;&#44; mientras la mayor parte de los estudios realizados usando el sistema BACTEC &#40;Becton Dickinson&#44; EE&#46;UU&#46;&#41; obtiene identificaciones correctas en m&#225;s del 85&#37; de los casos&#44; algunos estudios realizados mediante el sistema BacT&#47;Alert &#40;bioM&#233;rieux&#44; Francia&#41; obtienen resultados muy inferiores&#44; en torno al 30&#37;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0320"><span class="elsevierStyleSup">64</span></a>&#46; Es cierto&#44; no obstante&#44; que son mucho m&#225;s numerosos los estudios realizados con BACTEC&#44; y que se requieren m&#225;s estudios con el sistema BacT&#47;ALERT para corroborar o no estos resultados&#46; Un estudio reciente<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0325"><span class="elsevierStyleSup">65</span></a> que compara tres sistemas de hemocultivo &#40;BACTEC&#44; BacT&#47;ALERT y VERSATREK &#40;TREK Diagnostic Systems&#44; Thermo Fisher&#44; EE&#46;UU&#46;&#41; muestra diferencias a favor de BACTEC &#40;76&#44;2 frente al 68&#44;6&#37; de VERSATREK y el 61&#44;5&#37; de BacT&#47;ALERT&#41;&#44; pero esas diferencias no fueron estad&#237;sticamente significativas&#46; Sin embargo&#44; otro estudio realizado recientemente en Alemania refiere de nuevo cifras muy superiores para BACTEC respecto a BacT&#47;ALERT<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0330"><span class="elsevierStyleSup">66</span></a>&#46; As&#237;&#44; en BACTEC en conjunto&#44; la EM identificar&#237;a correctamente el 72&#37; de los pat&#243;genos&#44; frente al 45&#44;6&#37; de BacT&#47;ALERT sin resinas&#44; y al 23&#37; de BacT&#47;ALERT con resinas&#46; Los resultados en gram negativos fueron del 86&#44;6&#44; 69&#44;2 y 47&#44;1&#37;&#44; respectivamente&#44; pero la diferencia fue especialmente marcada en gram positivos con porcentajes de identificaci&#243;n correcta del 60&#44;0&#44; 28&#44;8 y 5&#44;4&#37;&#44; respectivamente&#46;</p><p id="par0155" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Diversos estudios han ido simplificando la metodolog&#237;a&#46; Un estudio realizado por nuestro grupo mostr&#243; recientemente que&#44; en un 50&#37; de los hemocultivos&#44; la aplicaci&#243;n directa de la muestra ofrec&#237;a resultados muy similares a los obtenidos con extracci&#243;n previa<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0335"><span class="elsevierStyleSup">67</span></a>&#46; La Scola corrobora&#44; en una revisi&#243;n reciente&#44; el potencial de estas t&#233;cnicas simplificadas para el diagn&#243;stico etiol&#243;gico de la bacteriemia a partir del hemocultivo<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0340"><span class="elsevierStyleSup">68</span></a>&#46;</p><p id="par0160" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Asimismo&#44; recientemente se ha publicado un m&#233;todo basado en la lisis diferencial de las c&#233;lulas hem&#225;ticas&#44; y otro basado en el enriquecimiento de la muestra previamente a la espectrometr&#237;a&#44; que tambi&#233;n mejorar&#237;an significativamente los resultados &#40;&#62;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>85&#37; de identificaciones correctas&#41;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0345"><span class="elsevierStyleSup">69&#44;70</span></a>&#46;</p><p id="par0165" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Finalmente&#44; Bruker Daltonics ha comercializado un m&#233;todo de procesamiento espec&#237;fico para hemocultivos &#40;MALDI Sepsityper<span class="elsevierStyleSup">R</span> kit&#41;&#44; que parece ofrecer buenos resultados con una identificaci&#243;n correcta del 100&#37; a nivel de g&#233;nero tanto en gram positivos como en gram negativos&#44; y una identificaci&#243;n correcta a nivel de especie del 91&#44;4&#37; en gram negativos y del 67&#44;7&#37; en gram positivos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0355"><span class="elsevierStyleSup">71</span></a>&#46; Asimismo&#44; este sistema parece haber supuesto una mejora muy considerable en la identificaci&#243;n de levaduras directamente del hemocultivo&#46; La &#250;nica publicaci&#243;n disponible actualmente al respecto refleja que&#44; en un estudio sobre 42 fungemias &#40;28 <span class="elsevierStyleItalic">Candida albicans</span>&#44; 8 <span class="elsevierStyleItalic">Candida parapsilosis</span>&#44; 5 <span class="elsevierStyleItalic">Candida tropicalis</span> y 1 <span class="elsevierStyleItalic">Cryptococcus neoformans</span>&#41;&#44; este m&#233;todo de procesamiento permiti&#243; la identificaci&#243;n del 100&#37; de las levaduras a nivel de especie directamente del hemocultivo<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0360"><span class="elsevierStyleSup">72</span></a>&#46;</p><p id="par0170" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Uno de los principales inconvenientes que se planteaban en relaci&#243;n con la identificaci&#243;n directa a partir de muestra era la imposibilidad de identificaci&#243;n cuando hab&#237;a m&#225;s de un microorganismo implicado&#44; ya que lo que aparec&#237;a era un perfil proteico no identificable&#44; derivado de la superposici&#243;n de los perfiles de los diferentes microorganismo implicados<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0310"><span class="elsevierStyleSup">62</span></a>&#44; o identificaba en numerosos casos uno solo de los microorganismos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0315"><span class="elsevierStyleSup">63</span></a>&#46; Este puede constituir un problema de cierta relevancia&#44; ya que estudios previos calculan en torno al 5&#37; los hemocultivos en los que hay presente m&#225;s de un microorganismo<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0365"><span class="elsevierStyleSup">73&#44;74</span></a>&#46; Esto parece haberse resuelto&#44; al menos en parte&#44; con el desarrollo de un nuevo software que es capaz de identificar las combinaciones de microorganismos que puedan generar los diferentes perfiles mixtos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0375"><span class="elsevierStyleSup">75</span></a>&#44; y que al parecer estar&#225; incluido en el software Biotyper 3&#46;0 de Bruker Daltonics &#40;M&#46; Kostrzewa&#44; comunicaci&#243;n personal&#41;&#46;</p></span><span id="sec0065" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle">Identificaci&#243;n directa en otro tipo de muestras</span><p id="par0175" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Existen pocos datos referentes a la identificaci&#243;n directa de microorganismos en otro tipo de muestras&#46; Alg&#250;n estudio inicial suger&#237;a la posibilidad de usarlo para la detecci&#243;n directa de bacterias causantes de meningitis con resultados aceptables<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0380"><span class="elsevierStyleSup">76</span></a>&#44; pero estudios publicados con posterioridad no corroboran estos resultados<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0385"><span class="elsevierStyleSup">77</span></a>&#46; Se trata&#44; por otra parte&#44; de una limitaci&#243;n previsible&#46; La EM MALDI-TOF no es una t&#233;cnica particularmente sensible&#44; sino que necesita cantidades relativamente altas de microorganismos para obtener perfiles proteicos fiables&#46; Los estudios realizados en muestras de infecci&#243;n urinaria demuestran que recuentos bacterianos inferiores a 60-70&#46;000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>UFC&#47;mL repercuten de forma muy negativa en la posibilidad de identificaci&#243;n directa<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0270"><span class="elsevierStyleSup">54</span></a>&#44; y se trata de recuentos muy superiores a los que aparecen habitualmente en la mayor parte de las meningitis y de otras infecciones de l&#237;quidos habitualmente est&#233;riles&#46; Por tanto&#44; <span class="elsevierStyleItalic">a priori</span>&#44; no es previsible que sea un sistema &#250;til&#44; aplicado de manera directa&#44; sobre muestras con cargas bacterianas reducidas&#46;</p></span></span><span id="sec0070" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle">Reevaluaci&#243;n de la prevalencia de pat&#243;genos conocidos y reconocimiento de nuevos pat&#243;genos</span><p id="par0180" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Un &#225;rea en la que puede ejercer tambi&#233;n una influencia notable esta tecnolog&#237;a&#44; y en la que probablemente se ha hecho poco hincapi&#233; hasta el momento&#44; es la del reconocimiento de nuevos pat&#243;genos&#44; o el cambio de consideraci&#243;n de algunas especies desde el punto de vista de su papel como pat&#243;genos&#46;</p><p id="par0185" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Sobre todo en los primeros estudios&#44; algunas discrepancias entre la EM y la identificaci&#243;n convencional derivaban de la incapacidad de la EM para diferenciar determinadas especies&#44; o de la ausencia de algunas especies en las bases de datos del espectr&#243;metro&#46; Mientras las primeras limitaciones&#44; con una notable trascendencia cl&#237;nica&#44; se mantienen en su mayor parte &#40;identificaci&#243;n err&#243;nea de <span class="elsevierStyleItalic">Shigella</span> spp&#46; como <span class="elsevierStyleItalic">E&#46; coli</span>&#44; identificaci&#243;n err&#243;nea de <span class="elsevierStyleItalic">S&#46; mitis</span> como <span class="elsevierStyleItalic">S&#46; pneumoniae</span>&#41;&#44; las segundas se han ido haciendo menos frecuentes&#44; a medida que las bases de datos se han ido ampliando en n&#250;mero de especies y n&#250;mero de espectros por especie&#46; Actualmente&#44; un porcentaje considerable de las discrepancias entre los m&#233;todos bioqu&#237;micos automatizados y la EM son debidas a que&#44; bien por limitaciones de los m&#233;todos bioqu&#237;micos rutinarios para la identificaci&#243;n fiable de determinados g&#233;neros y especies &#40;bacilos gram negativos no fermentadores&#44; corinebacterias&#44; bacterias anaerobias&#44; etc&#46;&#41; o por insuficiencias o inexactitudes de sus bases de datos&#44; algunos microorganismos se identifican simplemente a nivel de g&#233;nero&#44; o si se hace a nivel de especie&#44; es en muchas ocasiones con una fiabilidad relativa&#46; Sin embargo&#44; la disponibilidad de esta nueva metodolog&#237;a est&#225; permitiendo identificar con mayor fiabilidad estos aislamientos&#44; lo cual est&#225;&#44; en algunos casos&#44; cambiando conceptos relativos al papel etiol&#243;gico de diferentes microorganismos&#46; As&#237;&#44; en el estudio de Mellmann et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0085"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a> sobre 80 aislamientos cl&#237;nicos de bacilos gram negativos no fermentadores obtenidos en diferentes centros de Estados Unidos en 2004&#44; la EM MALDI-TOF identifica aislamientos de especies que dif&#237;cilmente hubieran podido ser identificadas por la metodolog&#237;a convencional&#44; como <span class="elsevierStyleItalic">Pseudomonas oleovorans</span>&#44; <span class="elsevierStyleItalic">Pseudomonas koreensis&#44; Pseudomonas citronellolis&#44; Pseudomonas fulva&#44; Pseudomonas savastanoi o Pseudomonas monteilii</span>&#44; todos ellos corroborados mediante secuenciaci&#243;n de rRNA 16S&#46; En otros estudios<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0055"><span class="elsevierStyleSup">11&#44;16</span></a> se identifican con relativa frecuencia aislamientos de especies &#40;<span class="elsevierStyleItalic">Enterobacter asburiae&#44; Enterobacter hormaechei</span>&#44; <span class="elsevierStyleItalic">P&#46; monteilii&#44; Pseudomonas corrugata</span>&#41; que no se recogen en las bases de datos de algunos de los sistema de identificaci&#243;n bioqu&#237;mica m&#225;s habituales&#44; de modo que estos sistemas los informan a nivel de g&#233;nero&#44; o los asimilan a especies con comportamientos bioqu&#237;micos similares &#40;p&#46;e&#46; <span class="elsevierStyleItalic">E&#46; asburiae</span> y <span class="elsevierStyleItalic">E&#46; hormaechei</span> como <span class="elsevierStyleItalic">Enterobacter</span> spp&#46; o <span class="elsevierStyleItalic">E&#46; cloacae&#44; P&#46; monteilii</span> como <span class="elsevierStyleItalic">P&#46; putida o P&#46; fluorescens</span>&#41;&#46; En otros casos&#44; determinados g&#233;neros&#44; pese a estar recogidos en las bases de datos de los sistemas de identificaci&#243;n bioqu&#237;mica&#44; en ocasiones no son capaces de identificarlos adecuadamente&#44; de modo que se informa una identificaci&#243;n err&#243;nea &#40;p&#46;e&#46; <span class="elsevierStyleItalic">Klebsiella</span> spp&#46; en lugar de <span class="elsevierStyleItalic">Raoultella ornithinolytica</span>&#41;&#46; Es cierto que en muchos casos&#44; a la luz de los conocimientos actuales&#44; se trata de diferencias con poca significaci&#243;n cl&#237;nica<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0070"><span class="elsevierStyleSup">14</span></a>&#44; desde luego menor que la de algunas de las carencias conocidas de la EM MALDI-TOF<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0090"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a>&#44; pero no cabe duda que una identificaci&#243;n m&#225;s exacta es siempre deseable&#44; y eventualmente puede llevarnos a cambiar los conceptos actuales sobre prevalencia y patogenicidad de determinadas especies&#46;</p><p id="par0190" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A las carencias conocidas derivadas de la similitud en los proteomas de algunos microorganismos&#44; ya citadas&#44; hay que a&#241;adir d&#233;ficits con indudable repercusi&#243;n cl&#237;nica en nuestro medio&#44; como son la ausencia de microorganismos como <span class="elsevierStyleItalic">Brucella&#44; Francisella tularensis&#44; B&#46; anthracis</span> o ciertas especies de <span class="elsevierStyleItalic">Clostridium</span> toxig&#233;nicos&#44; en algunas de las bases de datos utilizadas para la identificaci&#243;n de microorganismos por EM MALDI-TOF&#46;</p><p id="par0195" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Esta posibilidad de identificaci&#243;n fiable de especies hasta ahora infrecuentemente identificadas&#44; o incluso de nuevas especies&#44; se hace a&#250;n m&#225;s expl&#237;cita en el caso de las bacterias anaerobias como han demostrado recientemente La Scola et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0125"><span class="elsevierStyleSup">25</span></a>&#46; Un estudio reciente realizado por nuestro grupo confirma esta impresi&#243;n&#44; aunque tambi&#233;n demuestra que las bases de datos no son todav&#237;a &#243;ptimas en este &#225;rea ya que&#44; sobre 132 aislamientos de bacterias anaerobias estudiados&#44; en los seis casos en que la EM MALDI-TOF no obtuvo una identificaci&#243;n fiable&#44; se deb&#237;a a que la especie&#44; identificada posteriormente por secuenciaci&#243;n de rRNA 16S &#40;2 <span class="elsevierStyleItalic">Bacteroides cellulosilyticus</span>&#44; 1 <span class="elsevierStyleItalic">Negativicoccus succinivorans</span>&#44; 1 <span class="elsevierStyleItalic">Olsenella</span> spp&#46;&#44; 2 <span class="elsevierStyleItalic">Bacteroides ureolyticus</span>&#41; no estaban incluidas en dichas bases de datos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0390"><span class="elsevierStyleSup">78</span></a>&#46; Algo similar ocurre con algunas especies de levaduras&#44; como es el caso del grupo <span class="elsevierStyleItalic">Candida ortho</span>- <span class="elsevierStyleItalic">meta</span>- y <span class="elsevierStyleItalic">parapsilosis</span>&#44; indiferenciables mediante la metodolog&#237;a bioqu&#237;mica convencional&#44; y que son en cambio diferenciadas con gran exactitud con esta metodolog&#237;a<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0395"><span class="elsevierStyleSup">79</span></a>&#46;</p><p id="par0200" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La disponibilidad en un n&#250;mero amplio de centros de equipos que puedan identificar con fiabilidad todo este espectro de microorganismos de forma rutinaria puede&#44; a medio plazo&#44; obligarnos a modificar conceptos sobre patogenicidad y frecuencia de algunas de ellas&#46;</p></span><span id="sec0075" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle">Otras aplicaciones</span><p id="par0205" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las posibilidades de la EM MALDI-TOF en Microbiolog&#237;a Cl&#237;nica no se ci&#241;en a la mera identificaci&#243;n&#44; &#225;rea en la que esa utilidad est&#225; ya contrastada&#46; Estudios recientes abren nuevas perspectivas sobre su utilidad en otras &#225;reas&#46;</p><p id="par0210" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Un &#225;rea en la que est&#225; empezando a ser aplicada es la de los estudios epidemiol&#243;gicos&#46; Con frecuencia&#44; el perfil proteico que generan los microorganismos es m&#225;s complejo que lo que el <span class="elsevierStyleItalic">software</span> desarrollado por los diferentes fabricantes necesita para llevar a cabo la identificaci&#243;n&#46; Existir&#237;an as&#237; una serie de picos caracter&#237;sticos de g&#233;nero o de especie&#44; que podr&#237;amos denominar <span class="elsevierStyleItalic">perfil primario</span>&#44; y que ser&#237;an los principalmente valorados de cara a la identificaci&#243;n&#46; Existir&#237;an adem&#225;s una serie de picos secundarios&#44; m&#225;s variables dentro de la especie&#44; con lo que su utilidad para la identificaci&#243;n es menor&#44; pero que podr&#237;an configurar un <span class="elsevierStyleItalic">perfil secundario</span>&#44; cuya similitud fuera paralela a la proximidad gen&#233;tica de los microorganismos&#46; Ello permitir&#237;a establecer niveles de proximidad entre los aislamientos equiparables a los que se establecen actualmente mediante diferentes t&#233;cnicas gen&#233;ticas &#40;REP-PCR&#44; PFGE&#44; etc&#46;&#41;&#46; El planteamiento es atractivo ya que&#44; de ofrecer resultados similares&#44; se tratar&#237;a de un m&#233;todo significativamente m&#225;s r&#225;pido y barato que las t&#233;cnicas gen&#233;ticas vigentes&#46; No obstante&#44; se trata de un &#225;rea en la que casi todo se mueve aun en el terreno de la hip&#243;tesis&#44; ya que hay pocos estudios contrastados que lo avalen&#46;</p><p id="par0215" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Entre 2000 y 2005 se publicaron varios trabajos que suger&#237;an la posibilidad de diferenciar <span class="elsevierStyleItalic">S&#46; aureus</span> sensibles y resistentes a meticilina mediante EM MALDI-TOF&#44; e incluso de subtiparlos<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0400"><span class="elsevierStyleSup">80&#8211;82</span></a>&#46; Sin embargo&#44; no se han realizado trabajos posteriores con la metodolog&#237;a actual&#44; que corroboren estos resultados y&#44; sobre todo&#44; que comparen los datos de proximidad entre aislamientos con los obtenidos por las t&#233;cnicas gen&#233;ticas de referencia&#46; Del mismo modo&#44; algunos autores han sido capaces de subtipar aislamientos de <span class="elsevierStyleItalic">S&#46; pneumoniae</span> en funci&#243;n de diferencias en los perfiles proteicos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0415"><span class="elsevierStyleSup">83</span></a>&#46;</p><p id="par0220" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Del mismo modo Barbuddhe et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0175"><span class="elsevierStyleSup">35</span></a>&#44; en 2008&#44; demuestran no solo la eficacia de la EM MALDI-TOF para la identificaci&#243;n de 146 aislamientos de <span class="elsevierStyleItalic">Listeria</span>&#44; sino que es capaz de establecer un subtipado completamente superponible al que se obten&#237;a mediante PFGE&#46;</p><p id="par0225" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Existen tambi&#233;n algunos datos relativos a <span class="elsevierStyleItalic">Salmonella</span>&#46; En 2003&#44; Leuschner et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0420"><span class="elsevierStyleSup">84</span></a> publican un estudio en el que&#44; mediante EM-MALDI-TOF&#44; son capaces de encontrar en 22 aislamientos de <span class="elsevierStyleItalic">Salmonella</span> pertenecientes a seis serotipos&#44; perfiles espec&#237;ficos para los seis serovars estudiados &#40;Enteritidis&#44; Typhimurium&#44; Virchow&#44; Hadar&#44; Derby y Anatum&#41;&#46; Posteriormente&#44; Dieckmann et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0425"><span class="elsevierStyleSup">85</span></a> han sido capaces de clasificar 126 aislamientos de <span class="elsevierStyleItalic">Salmonella</span>&#44; mediante MALDI-TOF&#44; a nivel de subespecie&#46; No deja de ser llamativo que estos autores consigan estos resultados con <span class="elsevierStyleItalic">Salmonella</span>&#44; que es precisamente una de las enterobacterias que presentan mayores limitaciones para su identificaci&#243;n por EM-MALDI-TOF usando los par&#225;metros convencionales de EM&#44; sobre todo en cuanto a tama&#241;o de prote&#237;nas detectadas &#40;2-20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>kDa&#41;&#46; Usando estos par&#225;metros&#44; se consigue una identificaci&#243;n muy fiable a nivel de g&#233;nero&#44; pero la identificaci&#243;n por debajo de este nivel es muy poco fiable<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0080"><span class="elsevierStyleSup">16</span></a>&#46; Estos autores establecen unos par&#225;metros definidos de forma espec&#237;fica para su estudio&#44; obteniendo unos perfiles proteicos m&#225;s complejos&#46; Probablemente este sea unos de los campos en que queda m&#225;s trabajo por desarrollar&#46; Es previsible que los par&#225;metros que se usan para identificaci&#243;n sean &#250;tiles solamente en este aspecto&#44; pero los estudios epidemiol&#243;gicos requerir&#225;n del establecimiento de par&#225;metros espec&#237;ficos&#44; que abarquen mayores rangos de peso molecular y generen perfiles proteicos m&#225;s complejos y con mayor capacidad de discriminaci&#243;n&#46;</p><p id="par0230" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Existe tambi&#233;n alg&#250;n estudio que sugiere la posible aplicaci&#243;n de la espectrometr&#237;a de masas al diagn&#243;stico de enfermedades infecciosas&#44; pero no a trav&#233;s de la identificaci&#243;n del microorganismo&#44; sino a trav&#233;s de alteraciones generadas en la composici&#243;n proteica de diferentes fluidos&#46; As&#237;&#44; un estudio reciente sugiere la posibilidad de diagn&#243;stico de la infecci&#243;n por <span class="elsevierStyleItalic">H&#46; pylori</span> a trav&#233;s del estudio por EM-MALDI-TOF del peptidoma urinario&#46; El peptidoma urinario de pacientes infectados por <span class="elsevierStyleItalic">H&#46; pylori</span> presentaba dos prote&#237;nas con m&#47;z de 6788 y 1912&#46; Mientras la primera no pudo ser identificada&#44; la segunda correspond&#237;a a una fracci&#243;n de fibrin&#243;geno que&#44; por motivos no aclarados&#44; est&#225; aumentada en la infecci&#243;n por <span class="elsevierStyleItalic">H&#46; pylori</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0430"><span class="elsevierStyleSup">86</span></a>&#46;</p><p id="par0235" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Otro campo en que se han sugerido aplicaciones de la EM MALDI-TOF es el de la detecci&#243;n de factores de patogenicidad&#46; Algunos estudios han demostrado la existencia de picos masa&#47;carga en algunos perfiles que podr&#237;an relacionarse con la presencia de algunos de estos factores&#46; As&#237;&#44; un estudio sobre m&#225;s de 200 <span class="elsevierStyleItalic">S&#46; aureus</span> productores de prote&#237;na de Panton-Valentine&#44; y un n&#250;mero similar de cepas no productoras&#44; ha sugerido la asociaci&#243;n entre la aparici&#243;n de un pico m&#47;z de 4&#46;448<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>Da y la producci&#243;n de dicha leucocidina&#44; con una sensibilidad del 100&#37; y una especificidad del 90&#44;6&#37;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0435"><span class="elsevierStyleSup">87</span></a>&#46; Sin embargo&#44; estudios posteriores desmienten esta asociaci&#243;n<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0440"><span class="elsevierStyleSup">88</span></a>&#46;</p><p id="par0240" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Uno de los campos en los que m&#225;s actividad se ha registrado en los &#250;ltimos meses es el de la detecci&#243;n de la resistencia a antimicrobianos&#46; Se trata de un &#225;rea en la que&#44; desde el punto de vista te&#243;rico&#44; la utilidad de la EM-MALDI-TOF se ve&#237;a inicialmente problem&#225;tica&#44; ya que la obtenci&#243;n de un volumen de informaci&#243;n con trascendencia cl&#237;nica equiparable al que se obtiene con un antibiograma convencional ten&#237;a&#44; <span class="elsevierStyleItalic">a priori&#44;</span> grandes dificultades&#46; Requerir&#237;a la detecci&#243;n de numeros&#237;simas prote&#237;nas&#44; con muy diferentes localizaciones dentro de la estructura bacteriana&#44; producidas en cantidades muy variables y con un espectro de peso molecular muy amplio&#44; pero en el que al mismo tiempo&#44; peque&#241;as diferencias de peso molecular&#44; asociadas a variaciones en un solo amino&#225;cido&#44; podr&#237;an generar perfiles de resistencia radicalmente distintos&#46;</p><p id="par0245" class="elsevierStylePara elsevierViewall">No obstante&#44; ya hace algunos a&#241;os aparecieron estudios que suger&#237;an que la EM MALDI-TOF pod&#237;a permitir detectar la resistencia a meticilina en <span class="elsevierStyleItalic">S&#46; aureus</span><a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0445"><span class="elsevierStyleSup">89&#8211;92</span></a>&#46; Sin embargo&#44; se trataba de estudios con metodolog&#237;as heterog&#233;neas&#44; bajo n&#250;mero de cepas&#44; y esta capacidad de discriminaci&#243;n no termin&#243; de quedar demostrada&#46; Alg&#250;n estudio reciente vuelve a sugerir esta posibilidad<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0465"><span class="elsevierStyleSup">93</span></a>&#44; pero vuelve a tratarse de estudios con un n&#250;mero de cepas excesivamente corto &#40;23 <span class="elsevierStyleItalic">S&#46; aureus</span> sensibles a meticilina &#91;MSSA&#93; y 11 resistentes &#91;MRSA&#93; en este caso&#41;&#44; por lo que los resultados son todav&#237;a escasamente fiables&#46; Dada su trascendencia cl&#237;nica y epidemiol&#243;gica&#44; la posibilidad de discriminar con fiabilidad entre cepas de MSSA y MRSA&#44; en especial si fuera posible hacerlo directamente en hemocultivos&#44; resulta enormemente atractiva&#44; pero se requieren estudios prospectivos mucho m&#225;s amplios&#44; que establezcan una metodolog&#237;a bien estandarizada y determinen la sensibilidad y especificidad del m&#233;todo&#44; y la posibilidad de que desplace al menos en parte a los m&#233;todos actualmente aceptados&#46;</p><p id="par0250" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Algunos art&#237;culos recientes avalan la posibilidad de usar la EM MALDI-TOF para diferenciar entre <span class="elsevierStyleItalic">Bacteroides fragilis</span> portadores y no portadores del gen <span class="elsevierStyleItalic">cfiA</span>&#44; que codifica una carbapenemasa de clase B &#40;metalo &#946;-lactamasa&#41;&#44; bas&#225;ndose en que las cepas productoras y no productoras son genot&#237;picamente distintas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0470"><span class="elsevierStyleSup">94&#44;95</span></a>&#46; Sin embargo&#44; en este caso no se trata de estudios de sensibilidad propiamente dichos&#44; puesto que lo que permite la EM es deducir la presencia o no de este gen a partir de la pertenencia de la cepa a una u otra divisi&#243;n&#44; que tienen huellas prote&#243;micas distintas&#46;</p><p id="par0255" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los estudios de sensibilidad propiamente dichos est&#225;n empezando a ponerse en marcha con otra estrategia&#46; Aunque algunos estudios iniciales parec&#237;an detectar la presencia de la &#946;-lactamasa en el perfil proteico como un pico m&#47;z de en torno a 26-27&#46;000<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0480"><span class="elsevierStyleSup">96</span></a>&#44; en general&#44; lo que se busca es la huella prote&#243;mica derivada de la hidr&#243;lisis de antimicrobiano&#44; que ser&#225; distinta de la que deja el antimicrobiano intacto&#44; y por tanto revela la existencia de enzimas capaces de producir esta hidr&#243;lisis<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0485"><span class="elsevierStyleSup">97</span></a>&#46; As&#237;&#44; un estudio publicado este mismo a&#241;o encuentra que este m&#233;todo es capaz de detectar la producci&#243;n de carbapenemasas en enterobacterias y <span class="elsevierStyleItalic">Pseudomonas aeruginosa</span> con una sensibilidad y especificidad superiores al 95&#37;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0490"><span class="elsevierStyleSup">98</span></a>&#46;</p><p id="par0260" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En relaci&#243;n con los estudios de sensibilidad a antif&#250;ngicos&#44; tambi&#233;n Marinach et al<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0495"><span class="elsevierStyleSup">99</span></a> proponen en 2009 una metodolog&#237;a para determinar la sensibilidad de <span class="elsevierStyleItalic">C&#46; albicans</span> a fluconazol&#44; bas&#225;ndose en el espectro generado por el microorganismo creciendo a diferentes concentraciones de antif&#250;ngico&#46;</p><p id="par0265" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Adem&#225;s&#44; se han ideado otras estrategias sobre las que est&#225;n apareciendo diferentes estudios&#46; Diversos estudios est&#225;n empezando a plantear la utilizaci&#243;n de la EM MALDI-TOF pero no sobre p&#233;ptidos&#44; sino sobre fragmentos gen&#243;micos y sobre amplificados con dos aplicaciones&#58;</p><p id="par0270" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Como m&#233;todo de identificar mutaciones asociados a resistencia a antimicrobianos</p><p id="par0275" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Como m&#233;todo de tipado con una fiabilidad aparentemente muy alta&#46;</p><p id="par0280" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Ya hace algunos a&#241;os se empez&#243; a usar este planteamiento en diversos aspectos diagn&#243;sticos&#44; tanto en bacteriolog&#237;a como en virolog&#237;a&#46; As&#237;&#44; en 2005&#44; algunos autores&#44; mediante polimorfismo de nucle&#243;tidos simples y EM MALDI-TOF&#44; consiguen caracterizar mutaciones en las subunidades A de las topoisomerasas de <span class="elsevierStyleItalic">Neisseria gonorrhoeae</span> resistentes a fluoroquinolonas con una excelente correlaci&#243;n con los m&#233;todos de secuenciaci&#243;n<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0500"><span class="elsevierStyleSup">100</span></a> y en 2007&#44; con una metodolog&#237;a similar identifican mutaciones asociadas a resistencia a fluoroquinolonas en <span class="elsevierStyleItalic">S&#46; pneumoniae</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0505"><span class="elsevierStyleSup">101</span></a>&#46; En 2006 se us&#243; asimismo la combinaci&#243;n de amplificaci&#243;n y MALDI-TOF para caracterizar BLEEs del grupo SHV&#44; aparentemente con buenos resultados<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0510"><span class="elsevierStyleSup">102</span></a>&#46; Varios estudios publicados entre 2004 y 2006 demostraron asimismo que la EM MALDI-TOF de amplificados permit&#237;a detectar mutantes YMDD&#44; resistentes a lamivudina&#44; del virus de la hepatitis B&#44; tanto cuando constitu&#237;an una poblaci&#243;n mayoritaria como cuando constitu&#237;an subpoblaciones tan reducidas como un 5&#37;&#44; dentro de una poblaci&#243;n mixta<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0515"><span class="elsevierStyleSup">103&#8211;105</span></a>&#46; Posteriormente&#44; un estudio de 2010 parece confirmar los estudios preliminares para detectar mutaciones asociadas a resistencia en <span class="elsevierStyleItalic">S&#46; pneumoniae</span>&#44; en este caso en relaci&#243;n con mutaciones en las PBP<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0530"><span class="elsevierStyleSup">106</span></a>&#46;</p><p id="par0285" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En este aspecto del uso de la EM MALDI-TOF no sobre prote&#237;nas&#44; sino sobre fragmentos gen&#243;micos o sobre amplificados&#44; la tecnolog&#237;a m&#225;s desarrollada en este momento es la basada en el polimorfismo de nucle&#243;tidos simples &#40;single-nucleotide polymorphisms&#44; SNP&#41;&#44; determinado a trav&#233;s de un m&#233;todo de extensi&#243;n de base simple &#40;single-base extension&#41; combinada con EM MALDI-TOF &#40;iPLEX Gold&#44; Sequenom&#44; San Diego &#91;CA&#93;&#44; EE&#46;UU&#46;&#41;&#46; Se trata de un m&#233;todo que&#44; mediante PCR m&#250;ltiple&#44; amplifica determinadas &#225;reas del genoma que pueden presentar polimorfismos y determinados genes binarios&#44; analizando despu&#233;s el conjunto de amplificados obtenidos y su tama&#241;o mediante MALDI-TOF&#46; Este m&#233;todo se ha demostrado en estudios recientes como un m&#233;todo prometedor para el tipado de MRSA<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0535"><span class="elsevierStyleSup">107</span></a> y para la identificaci&#243;n y tipado epidemiol&#243;gico de <span class="elsevierStyleItalic">Mycobacterium tuberculosis</span> complex&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0540"><span class="elsevierStyleSup">108</span></a>&#44; as&#237; como para detecci&#243;n de mutaciones asociadas a resistencia a antiv&#237;ricos en virus de la hepatitis B<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0545"><span class="elsevierStyleSup">109</span></a> y para la detecci&#243;n de variantes del virus con una alta sensibilidad<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0550"><span class="elsevierStyleSup">110</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0080" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle">Conclusiones</span><p id="par0290" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La EM&#44; por sus caracter&#237;sticas de rapidez y fiabilidad&#44; est&#225; llamada a convertirse en una t&#233;cnica b&#225;sica de identificaci&#243;n bacteriana y micol&#243;gica en los laboratorios de Microbiolog&#237;a Cl&#237;nica&#44; desplazando en una parte muy importante a las t&#233;cnicas rutinarias actuales&#46; Aunque las t&#233;cnicas gen&#233;ticas probablemente sigan siendo la referencia&#44; su uso se ver&#225; reducido en el aspecto de la identificaci&#243;n a partir de colonia a las muestras en las que no se consiga una identificaci&#243;n fiable mediante EM&#46; Aunque se ha discutido mucho sobre la capacidad de esta t&#233;cnica para identificar determinados grupos de microorganismos &#40;bacterias anaerobias&#44; hongos filamentosos&#41;&#44; cada vez existen menos dudas respecto a que el problema principal&#44; en estos casos&#44; deriva fundamentalmente de carencias en las bases de datos&#44; y no se debe a limitaciones de la EM para generar espectros proteicos caracter&#237;sticos&#46; Estas limitaciones&#44; en general&#44; se van subsanando con rapidez&#46;</p><p id="par0295" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La aplicaci&#243;n de la EM MALDI-TOF sobre muestra directa&#44; hoy por hoy&#44; se restringe fundamentalmente a los hemocultivos positivos en los que&#44; una vez se va estableciendo un protocolo homog&#233;neo&#44; los resultados son muy positivos&#46; Su uso en orina&#44; aunque factible en orinas con alto recuento bacteriano&#44; probablemente va a ser m&#225;s dif&#237;cil de integrar en la rutina del laboratorio al menos a corto plazo&#46;</p><p id="par0300" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Sin embargo&#44; otras aplicaciones se van abriendo paso&#46; As&#237;&#44; su uso en epidemiolog&#237;a&#44; como alternativa a la epidemiolog&#237;a molecular&#44; es muy prometedor&#44; y se empiezan a plantear alternativas para determinar la producci&#243;n de factores de patogenicidad y orientar la sensibilidad a los antimicrobianos aunque&#44; sobre todo en este &#250;ltimo caso&#44; estamos probablemente todav&#237;a lejos de que esta tecnolog&#237;a pueda desplazar a los m&#233;todos actuales&#46;</p><p id="par0305" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Por &#250;ltimo&#44; la tecnolog&#237;a que asocia diferentes m&#233;todos de amplificaci&#243;n g&#233;nica y minisecuenciaci&#243;n a la EM MALDI-TOF empieza a mostrarse como una tecnolog&#237;a prometedora en diversos aspectos del diagn&#243;stico microbiol&#243;gico&#44; incluido un campo&#44; como el de la virolog&#237;a&#44; que hasta ahora le estaba pr&#225;cticamente vetado&#46;</p></span><span id="sec0085" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle">Conflictos de intereses</span><p id="par0310" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran no tener ning&#250;n conflicto de intereses&#46;</p></span></span>"
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Información del artículo
ISSN: 0213005X
Idioma original: Español
Datos actualizados diariamente
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2024 Octubre 89 16 105
2024 Septiembre 124 18 142
2024 Agosto 63 7 70
2024 Julio 71 9 80
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