Proteómica en enfermedades infecciosas | Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica

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correspondencia." ] ] ] ] "titulosAlternativos" => array:1 [ "en" => array:1 [ "titulo" => "Proteomics in infectious diseases" ] ] "textoCompleto" => "IntroducciónLas enfermedades infecciosas comportan uno de los mayores problemas de salud a nivel mundial, provocando una gran morbimortalidad y alcanzando niveles de millones de afectados cada año<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0005">1</a>. El incremento de viajes, cambios demográficos y resistencias a antimicrobianos contribuye significativamente a este fenómeno. El tratamiento de las enfermedades infecciosas se basa en un primer diagnóstico seguido de la administración del fármaco correspondiente.La mayoría de las enfermedades infecciosas son la consecuencia de una compleja red de interacciones que pueden implicar de cientos a miles de factores, tanto del patógeno como del hospedador. Para alcanzar un mejor entendimiento de los procesos de las enfermedades infecciosas es esencial realizar estudios traslacionales y multidisciplinares donde se integran la cooperación del personal implicado en las diferentes áreas de trabajo.Los análisis más exhaustivos realizados hasta el momento en cuanto a la búsqueda de biomarcadores y nuevas dianas para fármacos y vacunas se han realizado a partir de estudios en genómica y transcriptómica. En las últimas décadas ha aumentado significativamente el número de estudios proteómicos en enfermedades infecciosas y en todo el ámbito clínico para la búsqueda de biomarcadores y nuevas dianas para la vacunación y fármacos.La secuenciación del genoma microbiano ha revolucionado el estudio de los patógenos, no solo a nivel de microbiología básica, sino también en diagnóstico, epidemiología, fisiopatología, tratamiento de las enfermedades y desarrollo de vacunas. Además, la secuenciación del genoma microbiano ha posibilitado el estudio de sus proteomas. El primer genoma secuenciado fue el virus del Epstein-Barr (1984), de 170Kbs<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0010">2</a>, y una década después, en 1995, se secuenció el genoma de la bacteria gramnegativa Haemophilus influenzae, de 1,8Mb<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0015">3</a>.Muchos estudios se basaban en el análisis de los genes expresados en diferentes tipos celulares y tejidos en diferentes contextos fisiológicos, principalmente mediante un análisis de ARN mensajero (ARNm), sin existir a menudo una correlación directa entre el contenido en ARNm y el contenido proteico. La falta de correlación entre los niveles ARNm-proteína se debe a que el conjunto de proteína producida por una cantidad dada de ARNm depende del estado fisiológico de la célula<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0020">4</a>. Un ejemplo de esta ausencia de correlación entre transcriptómica (ARNm) y proteómica (proteína) se demuestra en el trabajo de Franco et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0025">5</a>, donde se comparan dos cepas de Helicobacter pylori, una carcinogénica y un progenitor no carcinogénico. Los análisis en ARNm no mostraron diferencias entre ambas cepas, mientras que a nivel proteico estas cepas eran diferenciables.La proteómica es considerada el siguiente paso en el estudio de un sistema biológico, después de la genómica y transcriptómica. La complejidad de los estudios proteómicos es mayor, ya que el genoma de un organismo es estático, mientras que el proteoma difiere de una célula a otra y entre estados. El término proteoma<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0030">6</a>, definido por Marc Wilkins en 1994, es una imagen dinámica de todas las proteínas expresadas por un organismo, célula o compartimento subcelular concreto, en un momento dado y bajo determinadas condiciones, constituyendo el mapa de expresión proteica de una célula, tejido u organismo dado. Un factor adicional de complejidad son las modificaciones que puede experimentar la estructura o secuencia básica de la proteína (p.ej., el procesado proteolítico) y las modificaciones postraduccionales (PTM), que sirven para modificar o modular la actividad, función o localización de una proteína en diferentes contextos fisiológicos o metabólicos. Finalmente, otro factor de complejidad es el moonlighting o multifuncionalidad, en que una misma proteína puede realizar varias funciones<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0035">7</a>.La proteómica, término también acuñado por Wilkins, es un nuevo enfoque en el estudio de las proteínas que ha evolucionado en los últimos años gracias a la integración de tecnologías como métodos de separación de proteínas de alto rendimiento, espectrometría de masas (MS) y, sobre todo, herramientas en bioinformática que han permitido el análisis de un gran volumen de datos. Gracias a su aplicabilidad, la proteómica permite no solo identificar las proteínas, sino también categorizarlas y clasificarlas en cuanto a su función e interacciones.El campo de estudio de la proteómica es realmente amplio, pero podemos agruparlo en 3 subgrupos: a)proteómica de expresión, cuyo objetivo es identificar las proteínas presentes en la muestra así como obtener toda la información acerca de abundancias, PTM y localización subcelular; b)proteómica estructural, que permite la obtención de la estructura tridimensional de las proteínas, y c)proteómica funcional, cuya finalidad es averiguar la función de las proteínas y conocer las interacciones que puedan efectuar.Las técnicas en proteómica ofrecen un novedoso y potente enfoque para el diagnóstico de patógenos, seguimiento de brotes, dinámica patógeno-hospedador, control de la enfermedad y desarrollo de fármacos y vacunas.La presente revisión tiene como objetivo mostrar la amplia variedad de técnicas y aplicaciones disponibles en el campo de la proteómica destinadas al estudio de las enfermedades infecciosas.Metodologías proteómicasLas técnicas en proteómica envuelven multitud de metodologías experimentales, como electroforesis en 2 dimensiones (2DE), cromatografía líquida (LC) y MS. La combinación de estas técnicas con un posterior análisis bioinformático es utilizada para el estudio proteico de una gran variedad de organismos. Estas técnicas son potencialmente valiosas, aunque hay complejidades en las muestras que pueden afectar a su análisis e interpretación, como son el grado de PTM, el alcance dinámico de la expresión (p.ej., la abundancia de albúmina en plasma enmascara proteínas minoritarias) y problemas de detección de proteínas asociadas a membrana<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0040">8</a>.El mayor obstáculo para el progreso en el área de la proteómica es la dificultad en la recopilación de patógenos in vivo en suficiente abundancia y de forma adecuada para análisis proteómicos. Aun siendo estas las condiciones idóneas para estudios de expresión de proteínas en microorganismos patógenos, existen casos en los que no se puede realizar y el cultivo axénico (in vitro) se convierte en la mejor opción. Se han analizado multitud de patógenos utilizando técnicas proteómicas en condiciones in vitro. Estos estudios permiten conocer la magnitud de expresión de proteínas y tener una idea global de su proteoma. Basarse únicamente en el estudio del proteoma en estas condiciones puede provocar la pérdida de una información fundamental<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0045">9-12</a>, ya que no permite identificar las proteínas implicadas en infección, como factores de virulencia, proteínas que permiten la evasión de la respuesta inmune del hospedador y proteínas que permiten la utilización de la maquinaria celular del hospedador para propagarse. Una simulación experimental de las condiciones de infección in vivo es la infección de cultivos celulares (simulación in vitro del entorno de infección) o la utilización de modelos animales<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0065">13,14</a>. La desventaja en estos estudios radica en la presencia de una gran «contaminación» por proteínas del hospedador, además de una baja obtención de biomasa del patógeno.En conjunto, enfoques experimentales in vitro/ex vivo tienen implicaciones significantes con respecto a la identificación de nuevas vacunas, dianas para fármacos, biomarcadores de infectividad y progreso de enfermedad.La mayoría de las proteínas implicadas en los primeros estadios de infección del hospedador son las proteínas de superficie celular. Estas proteínas son la conexión entre la célula y el medio extracelular, por lo que son el mediador principal en la infección. Por consiguiente, son componentes de gran interés para el desarrollo de nuevas vacunas y para la caracterización de nuevas dianas para fármacos. La información de estas moléculas se encuentra en baja representación en los estudios proteómicos debido a su baja abundancia, poca solubilidad y la problemática en su fraccionamiento sin una contaminación por proteínas citoplasmáticas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0075">15,16</a>. En el caso del estudio de las bacterias grampositivas y hongos, también es importante conocer la composición proteica de la pared celular y no solo de la membrana plasmática<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0085">17</a>.Preparación de muestraLa obtención y preparación de las muestras es uno de los pasos más relevantes en los estudios proteómicos. Es de vital importancia que las muestras sean tomadas y procesadas mediante el mismo protocolo para que los resultados obtenidos sean veraces, reproducibles y que las diferencias observadas no sean fruto de la manipulación.El procesamiento de la muestra en el laboratorio difiere según la procedencia de esta y la finalidad del estudio. En los estudios en cultivo axénico no es necesario un aislamiento previo para la obtención de la muestra proteica. Por el contrario, cuando se analiza el microorganismo en estado infectivo, la preparación de la muestra precisa de un aislamiento del microorganismo respecto a las células del hospedador. Los métodos más comúnmente utilizados para la separación son la centrifugación, la separación inmunomagnética (IMS) y la clasificación de células mediante citometría de flujo (FACS).El primer método, la centrifugación, es el recomendado para patógenos con pared celular (plantas, hongos, algas, arqueas y bacterias grampositivas), previa lisis de las células eucariotas (hospedador) por presión osmótica<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0090">18,19</a> o detergentes como el tritónX-114<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0065">13</a>.En el segundo método, la técnica de IMS, se utilizan partículas magnéticas conjugadas con una inmunoglobulina (Ig) específica frente al microorganismo de interés. Estos microorganismos pueden ser fácilmente enriquecidos y purificados, generando suficiente biomasa virtualmente libre de proteínas del hospedador para un exhaustivo análisis del proteoma. La ventaja más importante respecto a la centrifugación es la obtención de una muestra libre de contaminantes procedente del hospedador. Por el contrario, esta técnica requiere anticuerpos específicos frente a estructuras de la superficie del patógeno.En el tercer método, el FACS, se utilizan anticuerpos específicos para el marcaje fluorescente del microorganismo diana, con la finalidad de facilitar la separación de este respecto a otros microorganismos o detritos de la célula hospedadora. Esta técnica puede separar miles de partículas por segundo, pero la acumulación de suficiente material patógeno para la aplicación de técnicas proteómicas requiere bastantes horas de clasificación, haciéndola muy costosa.Todos estos métodos de separación deben ser optimizados para incrementar la velocidad de procesamiento de la muestra y reducir el riesgo de digestión parcial por proteasas, además de reducir la probabilidad de contaminación con proteínas del hospedador.Los estudios en proteómica se pueden dirigir al estudio del proteoma total, subproteoma o una proteína concreta. La selección de una proteína o población proteica determinada se debe realizar mediante un fraccionamiento de la muestra. Entre las técnicas utilizadas para esta finalidad cabe destacar la purificación de afinidad en tándem (TAP)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0100">20</a>, co-inmunoprecipitación (CO-IP)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0105">21</a> y el chip de exploración del peptidoma mediante HLA<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0110">22,23</a>.Técnicas proteómicasLas técnicas proteómicas se dividen en cualitativas y cuantitativas. Las primeras informan acerca de la expresión o no de una determinada proteína o conjunto proteico (presencia/ausencia), mientras que la proteómica cuantitativa permite determinar y comparar la cantidad de proteína presente en la muestra.En los estudios en proteómica, la muestra es una mezcla compleja de cientos/miles de proteínas. Por este motivo es esencial la utilización de una técnica de separación. Estas técnicas se agrupan en: en gel y gel-free. Las técnicas en gel son aquellas en las que se utiliza un entramado de polímeros para la separación. Las técnicas gel-free realizan la separación de la muestra proteica en solución mediante diferentes tipos de cromatografía líquida (intercambio iónico, afinidad, fase reversa…). En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a> se muestran las ventajas y desventajas de las distintas técnicas proteómicas.<elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia>Proteómica cualitativaTécnicas en gelLa separación de las proteínas en gel es una herramienta que permite la separación de estas por propiedades como el tamaño (Mr), el punto isoeléctrico (pI) y/o la conformación (geles nativos). La separación en gel se puede realizar por una sola propiedad (monodimensional) o por 2 propiedades consecutivas (bidimensional). Debido a la complejidad de los extractos proteicos totales, la separación de las muestras en electroforesis bidimensional (2DE) ofrece una mayor resolución. Mediante esta técnica las proteínas son separadas por pI y posteriormente por Mr, obteniendo un mapa global del proteoma de la muestra.La técnica 2DE únicamente puede ser aplicada satisfactoriamente si hay un mínimo de 108 células aisladas. Esta técnica permite separar entre 3.000-5.000 proteínas únicas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0120">24</a>, diferenciadas generalmente en un único spot. No obstante, una misma proteína puede identificarse en diferentes spots, indicando que esta proteína presenta varias isoformas que difieren en pI y/o Mr. Estas isoformas pueden informar acerca de las posibles PTM de una determinada proteína. Las PTM más frecuentes son fosforilaciones, glucosilaciones o proteólisis limitada<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0125">25</a>. Otro fenómeno menos común es la identificación de dos proteínas en el mismo spot, debido a su igual pI y Mr.La preparación de la muestra para la electroforesis bidimensional es crucial para la obtención de resultados óptimos, siendo necesarios procesos de solubilización, disgregación, desnaturalización y reducción de las proteínas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0130">26</a>.Una posibilidad que ofrecen los geles 2D es su combinación con técnicas de marcaje de proteínas permitiendo la comparación de proteomas en un mismo gel, evitando de esta manera las variaciones interensayo (entre geles/experimentos). Esta técnica es conocida como gel bidimensional diferencial (2D-DIGE). El marcaje mediante fluoróforos puede ser aplicado al estudio comparativo de 2 proteomas permitiendo una cuantificación relativa de las muestras. Este marcaje puede dirigirse a conjuntos específicos de proteínas; por ejemplo, el estudio de proteínas con regiones expuestas hacia el medio extracelular. La aplicabilidad de esta técnica ha permitido el estudio del surfoma<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0135">27</a> evitando el fraccionamiento de proteínas de superficie, las cuales suelen ser largas y costosas.Los geles 2D-DIGE se pueden aplicar a la búsqueda de dianas terapéuticas analizando el proteoma in vitro frente al proteoma del patógeno en situación de infección, obteniendo en el mismo gel la comparativa del proteoma en ambas situaciones. Debido a la dificultad para obtener muestra suficiente de patógeno en situación de infección, se han realizado estudios en los que se compara el proteoma del microorganismo in vitro en diferentes fases de crecimiento. En el trabajo de Hayashi et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0140">28</a> se estudiaron las proteínas expresadas por Legionella pneumophila en 2 fases de crecimiento: exponencial y postexponencial, observándose una elevada expresión de factores de virulencia en la fase postexponencial. Gracias a este estudio se puede establecer en futuros trabajos en Legionella el proteoma en fase postexponencial como aproximación del proteoma en infección.Una desventaja importante de la técnica 2DE es la limitación en la capacidad de enfoque de proteínas de media a baja abundancia debido a la gran gama de niveles de expresión de proteínas. Las proteínas más afectadas por dicha limitación son las proteínas de membrana y proteínas de bajo peso molecular, que se encuentran subrepresentadas en proteomas totales. Estas proteínas pueden ser mejor detectadas mediante otras técnicas proteómicas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0145">29</a>.Técnicas gel-freeLa técnica gel-free requiere una primera separación de las proteínas presentes en la muestra mediante cromatografía líquida por diferentes propiedades, definidas según la columna utilizada. Existen en el mercado diferentes tipos de columnas, siendo las más utilizadas las de fase reversa, intercambio iónico, afinidad y exclusión molecular. Posteriormente se realiza un análisis mediante MS para la identificación de las proteínas (LC-MS/MS).Las técnicas de separación gel-free son aconsejables cuando la cantidad de muestra es escasa, como es el caso de experimentos en infección en los que se obtiene una baja cantidad de microorganismos. En estos casos, las técnicas gel-free MS son adecuadas por ofrecer una mejor sensibilidad, ya que permite monitorizar 500-600 proteínas desde únicamente 106 células<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0070">14</a> (una cantidad 100 veces menor que en los geles 2D). Esta técnica permite la detección de proteínas difícilmente separables en 2DE, como proteínas muy hidrofóbicas, proteínas de membrana y proteínas con pI o Mr extremos, como son las proteínas ribosomales con un pI básico<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0150">30-32</a>. Un claro ejemplo en el que se demuestra esta mayor sensibilidad es el trabajo realizado en Mycoplasma genitalium, modelo de genoma y proteoma mínimo, en el que se estudió la fracción rica en proteínas de membrana mediante fraccionamiento por tritón114. El análisis de esta fracción se realizó tanto por 2DE como por LC-MS, obteniéndose una clara diferencia en cuanto a número de proteínas identificadas. Mediante 2DE se identificaron 49 proteínas, mientras que por LC-MS se identificaron 242 proteínas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165">33</a>.Proteómica cuantitativaLa proteómica cuantitativa es una herramienta útil para los análisis proteómicos mediante LC-MS/MS<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170">34</a>. Los métodos de cuantificación se pueden clasificar en cuantificación relativa/absoluta o con/sin marcaje.Los métodos de cuantificación relativa (ICAT, iTRAQ, IPTL o SILAC) son utilizados para la comparación de abundancias de proteínas o péptidos entre muestras. Por otro lado, mediante el uso de péptidos sintéticos marcados isotópicamente se obtiene una cuantificación absoluta de los péptidos diana.Proteómica cuantitativa mediante marcajeLas técnicas cuantitativas mediante marcaje utilizan compuestos isotópicos para un posterior análisis mediante MS, obteniendo una cuantificación relativa. El marcaje de las proteínas puede efectuarse durante el crecimiento celular o una vez realizada la extracción de estas. Las muestras a comparar son diferenciadas mediante marcaje isotópico. Según la técnica de marcaje diferenciamos: ICAT (isotope code affinity tagging: marcaje por afinidad con codificación isotópica)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0175">35</a>, iTRAQ (multiplexed isobaric tagging chemistry: etiquetado isobárico multiplexado químico)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0180">36</a> e IPTL (isobaric peptide termini labeling: unión terminal isobárica del péptido)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0185">37</a>.La cuantificación relativa mediante marcaje permite la comparativa de 2 poblaciones según su crecimiento celular mediante SILAC (stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture: marcaje isotópico estable de aminoácidos en cultivo celular). En esta técnica, los marcadores isotópicos no radiactivos son incorporados durante el crecimiento celular a las proteínas sintetizadas de novo<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0190">38-41</a>.Las técnicas de cuantificación mediante marcaje tienen ciertas limitaciones, como es el incremento de la complejidad en la preparación de la muestra (por el tratamiento independiente de la muestra), la necesidad de una gran concentración de esta, los costes elevados de los reactivos, marcajes incompletos que distorsionan el resultado y la necesidad de software específico para la cuantificación.Proteómica cuantitativa libre de marcajeLas estrategias libres de marcaje pueden ser utilizadas para cuantificación tanto relativa como absoluta. Estas técnicas alcanzan una mayor rapidez, resultados más limpios y un análisis simple de los resultados. Por este motivo son prometedoras en la cuantificación de proteínas poco abundantes debido a su alta sensibilidad, aunque para ser aplicadas se deben tener en cuenta ciertos criterios: a)es necesario disponer de espectrómetros de masas con gran precisión e instrumentos HPLC con un tiempo seguro de retención; b)debe ser aplicado suficiente material para determinar la concentración proteica antes de la medición por MS con la finalidad de aplicar cantidades equivalentes de péptidos, y c)el número de péptidos de la célula hospedadora debe ser reducido al mínimo para evitar falsos positivos.La cuantificación de proteínas por este método se basa generalmente en 2 categorías: a)medición de los cambios de intensidad de los iones, ya sea por área de los picos o por la altura de estos en espectrometría, y b)recuento de espectros de las proteínas identificadas después del análisis MS/MS<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0210">42-53</a>.Una mejora de la proteómica cuantitativa sin marcaje es la incorporación de péptidos sintéticos marcados isotópicamente como estándares internos. Estos péptidos permiten una cuantificación absoluta (AQUA: absolute quantification) de los péptidos de interés<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0270">54</a>.Instrumentos para análisis e identificación proteica mediante espectrometría de masasLa identificación de proteínas se realiza en su gran mayoría mediante espectrómetros de masas. Estos instrumentos permiten la obtención de iones a partir de moléculas orgánicas, separándolos y detectándolos en función de su masa/carga (m/z). Los espectrómetros de masas constan de 3 componentes: fuente de ionización, analizador de masa y detector. Existen diferentes tipos de espectrómetros de masas según la combinación de los diferentes elementos. Los más comúnmente utilizados son:<ul class="elsevierStyleList" id="lis0005"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0005">•MALDI-TOF (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Time Of Flight: desorción/ionización mediante láser asistido por matriz, «tiempo de vuelo»): utilizado comúnmente para la identificación de proteínas mediante huella peptídica y el estudio de los perfiles proteicos de una muestra e interacciones de proteínas. Cabe destacar el desarrollo de la técnica del «Imaging», que permite una visualización en 2 dimensiones de la distribución de metales traza, metabolitos, lípidos de superficie, péptidos y proteínas, directamente en los tejidos sin realizar una fijación o extracción previa<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0275">55,56</a>.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0010">•SELDI-TOF (Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-Time Of Flight: desorción/ionización mediante láser de superficie mejorada, «tiempo de vuelo»): este instrumento utiliza la misma tecnología que el MALDI-TOF incorporando la funcionalización de la placa (intercambio iónico, fase reversa, anticuerpos, ADN, otras proteínas, etc.) en la que se carga la muestra. La comparación de las proteínas retenidas en la placa entre diferentes muestras puede ser utilizada para la búsqueda de biomarcadores<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0285">57</a>.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0015">•ESI (ElectroSpray Ionization: ionización por electrospray): este dispositivo es especialmente útil para la secuenciación peptídica, ya que permite la ionización de las macromoléculas fragmentándolas por los enlaces peptídicos (uniones más débiles), obteniendo de esta forma la secuencia aminoacídica<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0280">56,58</a>.</li></ul>BioinformáticaLos análisis proteómicos generan una gran cantidad de datos a analizar. El desarrollo de herramientas bioinformáticas, como la introducción de nuevos algoritmos, ha sido clave para manipular dichos conjuntos de datos. Este campo permite y facilita la manipulación de datos a gran escala, desarrollando programas y herramientas de búsqueda oportunas. Estas herramientas se han aplicado con gran éxito en el procesamiento de datos MS tanto en análisis de huella peptídica (identificación de proteínas), huella de fragmentación peptídica (identificación de la secuencia de péptidos) y secuenciación de novo.Existen multitud de programas que permiten la identificación in sillico de proteínas. En estudios proteómicos en enfermedades infecciosas existen programas que permiten la identificación y caracterización de epítopos del patógeno que interaccionan con el sistema inmune del hospedador, inmunoma. Las interacciones patógeno-hospedador no se conocen en profundidad en muchas de las enfermedades infecciosas, por lo que estudios bioinformáticos pueden dirigir el estudio de estas interacciones.AplicacionesProteoma de microorganismosLos estudios del proteoma total de los microorganismos patógenos son muy valiosos en cuanto a la información que se obtiene de la expresión proteica en una condición determinada. En otros estudios es más interesante obtener información de determinados subproteomas, como las proteínas expuestas en la membrana, o conocer qué proteínas desencadenan la respuesta inmune en el hospedador. Cabe destacar el papel de las PTM en la interacción entre el patógeno y el hospedador, por lo que debería tenerse en cuenta su estudio en microorganismos patógenos.Proteínas de membrana, de superficie y secretadasEl subproteoma de membrana constituye un conjunto de proteínas relacionadas con la infección. Existen técnicas para la detección de las proteínas expuestas en la superficie celular (surfoma), como son el marcaje específico mediante fluoróforos en el 2D-DIGE y el afeitado celular. La técnica del afeitado celular se ha utilizado satisfactoriamente en diversos patógenos humanos grampositivos como en Streptococcus<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0295">59</a> o en Staphylococcus aureus<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0300">60</a>, aunque aún no se conoce con certeza su aplicabilidad en bacterias gramnegativas. Estas bacterias poseen una envuelta celular menos rígida y menos resistente que las grampositivas, por lo que el «afeitado» compromete la integridad de la membrana y provoca la lisis celular. Como alternativa a estas técnicas se han mejorado los protocolos de extracción de proteínas de membrana existentes a través de diferentes detergentes o aislamiento de membranas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0305">61</a>, como es el caso de la utilización del tampón carbonato para la eliminación de proteínas solubles contaminantes en las muestras.Las proteínas secretadas constituyen un importante subproteoma y pueden desencadenar la lisis de las células hospedadoras mediante toxinas, que pueden influir en la adhesión, colonización e invasión, así como la desviación de la respuesta inmune del hospedador<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0310">62-66</a>. Este importante grupo de proteínas se pierde durante el procesamiento de las bacterias intactas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0335">67,68</a>. Las proteínas de las vesículas de membrana externa (OMV) constituyen un subproteoma muy importante en los patógenos, ya que desencadenan reacciones inmunogénicas potentes al ser liberadas por el microorganismo al medio extracelular. Las vesículas producidas por Neisseria meningitidis han sido utilizadas por su efecto inmunoprotector frente a este patógeno<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0345">69,70</a>.BiopelículasLas biopelículas están formadas por una biocapa robusta de microorganismos y matriz extracelular. Esta estructura permite a las células que la componen la unión a superficies artificiales o bióticas, dificultando la eliminación de los microorganismos que la componen<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0355">71</a>. Las biopelículas bacterianas representan una antigua estrategia de supervivencia procariota. Donlan<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0360">72</a> definió la biopelícula como una comunidad microbiana sésil, caracterizada por células que están adheridas irreversiblemente a un sustrato o interfase, o unas con otras, embebidas en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares que ellas han producido exhibiendo un fenotipo alterado en relación con la tasa de crecimiento y transcripción génica. La biopelícula proporciona a las bacterias embebidas en ella ventajas significantes frente a fluctuaciones medioambientales de humedad, temperatura y pH y reserva de nutrientes<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0365">73</a>. Por este motivo se estudiaron las diferencias en la abundancia de proteínas entre las células crecidas en biopelícula y células plantónicas mediante la técnica 2DE con tinción de plata en Candida albicans. Como resultado de esta comparación, se observó que las células crecidas en biopelícula presentaban una menor capacidad antioxidativa además de presentar la proteína Pil1p, proteína sensible al tratamiento con un tipo determinado de antifúngicos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0370">74</a>. Este resultado permitió encontrar una diana y un tratamiento eficaces contra el estado más resistente de estas levaduras.Identificación de microorganismos y sensibilidad a antimicrobianosLa identificación de los microorganismos causantes de infección es preciso que se logre en el mínimo tiempo posible. Por ello, un campo amplio de investigación es la búsqueda de técnicas de identificación alternativas a las fenotípicas/metabólicas, que requieren, además del aislamiento del microorganismo, entre 18-24h más para la identificación de este. Una opción para la identificación rápida de microorganismos es la optimización de la MS. En la revisión de Jordana-Lluch et al.<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0375">75</a> se explica detalladamente el uso de esta técnica y los avances obtenidos hasta el momento.La aplicación de la MS en la identificación de microorganismos requiere únicamente del aislamiento y una media de 5min; sin embargo, en este proceso no se obtienen datos sobre la sensibilidad a antimicrobianos. Para obtener dicha información es necesaria la realización de pruebas de sensibilidad del microorganismo, pero dichas pruebas requieren de un tiempo añadido. Se han realizado estudios utilizando la MS para detectar la presencia de betalactamasas, diferenciar entre S.aureus sensibles y resistentes a meticilina, e incluso detectar factores de patogenicidad<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0380">76-79</a>.Búsqueda de biomarcadores en fluidos corporalesLos biomarcadores facilitan el desarrollo de herramientas específicas de diagnóstico, monitorizando la respuesta a la terapia o el progreso de la enfermedad<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0400">80</a>. Cuando analizamos muestras biológicas (de procedencia humana o animal modelo), la dificultad radica en la creación de grupos homogéneos para asegurar una buena correlación de resultados. Por ello es imprescindible la estandarización de la clasificación de las muestras.La comparativa de fluidos entre pacientes y controles puede permitir la identificación de proteínas diferenciales. Estas proteínas pueden ser utilizadas posteriormente como método de diagnóstico rápido. Un estudio de este tipo se llevó a cabo con el virus de la hepatitisE (HEV), en el que el plasma y la orina de pacientes infectados fueron analizados mediante 2D-DIGE frente muestras control. Se demostró que más de 30 proteínas se expresaban de manera diferencial en pacientes con HEV aguda respecto a los controles<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0405">81</a>. Estos resultados demuestran la potencialidad de la proteómica en la búsqueda de biomarcadores.Las proteínas diferenciales obtenidas en la comparación entre pacientes con diferentes grados de la enfermedad podrían ser utilizadas para determinar el pronóstico del paciente.InmunomaLa inmunoproteómica es una herramienta potencialmente útil en el campo de búsqueda de biomarcadores para enfermedades infecciosas, especialmente en situaciones donde el patógeno es difícil de cultivar in vitro<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0410">82-85</a>. La tecnología SELDI ha sido aplicada muy recientemente en la identificación de biomarcadores para discernir cepas de Helicobacter pylori asociadas a diferentes estados de la enfermedad<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0430">86</a>. De esta manera se identifican «firmas» de anticuerpos en suero<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0415">83,84</a>.La identificación y caracterización de proteínas antigénicas es un requerimiento para el desarrollo de vacunas, ya que poseen un gran interés como alternativa terapéutica al tratamiento. Para la investigación de la inmunorreactividad de los anticuerpos humanos o anticuerpos de modelos animales frente a las proteínas microbianas, la combinación de 2DE e inmunoblotting representa el método de elección. Extractos proteicos totales del microorganismo patogénico son separados por 2DE y las proteínas inmunorreactivas son detectadas mediante 2D inmunoblots con suero de pacientes infectados, en comparación con el patrón obtenido con sueros control<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0435">87</a>. Las proteínas que generan señal diferencial entre ambos grupos son identificadas por huella peptídica.La expresión proteica varía según el estado y condición de crecimiento de los microorganismos. Por esta razón es aconsejable realizar los inmunoblottings con extracto proteico del microorganismo crecido in vivo, para evitar las variaciones transcripcionales, traduccionales y postraduccionales encontradas entre los cultivos in vitro vs in vivo.La inmunoproteómica es útil para aportar propuestas generales de diagnóstico o para la selección de biomarcadores<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0415">83</a>. Además, esta metodología puede ser fácilmente aplicada a múltiples infecciones humanas y de veterinaria de gran importancia por su incidencia y severidad<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0440">88-96</a>.Vacunas y fármacosLa selección de dianas para fármacos y/o vacunas es esencial para la obtención de un resultado óptimo en el control y/o tratamiento de una enfermedad infecciosa. Los criterios a tener en cuenta para seleccionar una diana son: a)que esta sea esencial para la infectividad y proliferación del patógeno en el hospedador; b)que tenga una baja redundancia en las vías del patógeno, aunque tenga elevada redundancia en las vías del hospedador, siempre y cuando se puedan mitigar los efectos tóxicos; c)que esté amplia y consistentemente expresada en los tejidos de infección y en los diferentes pacientes de la población, y d)que sea terapéuticamente tratable utilizando pequeñas moléculas tales como siRNA, anticuerpos u otras modalidades farmacéuticas.La vacunología reversa es una técnica utilizada en la búsqueda de nuevas dianas. Esta aproximación permite un cribado a favor de las proteínas con potencial inmunogénico. Los datos obtenidos del proteoma durante la infección pueden ser explotados como base para el desarrollo de nuevas quimioterapias antimicrobianas y vacunas. Una baja proporción de estas proteínas puede ser utilizada como diana para quimioterapia antimicrobiana<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0485">97</a> o como antígeno para vacunas protectoras<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0490">98</a>. Algunos patógenos en los que se ha realizado el estudio del inmunoma son: Chlamydia pneumoniae, Haemophilus influenza, Neisseria meningitidis, Helicobacter pylori, Bacillus anthracis, Streptococcus agalactiae, Mycobacterium tuberculosis y Mycobacterium bovis<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0490">98-111</a>.ConclusiónLa proteómica es una herramienta verdaderamente útil en el estudio de las enfermedades infecciosas, proporcionando una visión global. Los análisis proteómicos permiten la realización de un estudio básico de la enfermedad, facilitando la búsqueda de marcadores de infección o virulencia. Posteriormente, los resultados obtenidos tienen una aplicabilidad traslacional dirigida al diagnóstico y pronóstico de la enfermedad, además de permitir el desarrollo de nuevas terapias antimicrobianas y el avance en vacunología.Las técnicas proteómicas no solo permiten la identificación de nuevos marcadores, sino que pueden ser implantadas como técnicas de diagnóstico rápido, pudiendo dirigir el tratamiento con mayor celeridad evitando los cultivos in vitro, que requieren largos tiempos de incubación, retrasando el diagnóstico, además de generar falsos negativos en aquellos microorganismos viables pero no cultivables.Esta revisión muestra como la proteómica es una herramienta potente en investigación. A día de hoy, muchos expertos consideran las técnicas en proteómica útiles en el descubrimiento de proteínas de interés clínico, como biomarcadores, pero su aplicabilidad asistencial es baja. El resultado obtenido en los trabajos de investigación basados en proteómica es adaptado a técnicas convencionales como el ELISA, pero estas no se mantienen como herramientas en diagnóstico. Esta revisión pretende mostrar a los expertos del ámbito clínico nuevas técnicas disponibles para resolver las dificultades que se presentan día tras día.Actualmente, la proteómica es un área valorada por su clara utilidad, aunque aún hay mucho trabajo que realizar en ámbitos como las enfermedades infecciosas. Para mejorar su utilidad en el futuro, debemos concienciar a todo el personal implicado en el ámbito asistencial de su importancia, así como integrar los resultados de los estudios de todas las «ómicas». Este último aspecto es de gran importancia, ya que, por ejemplo, el conocimiento del genoma de un microorganismo es de vital importancia para la interpretación de los resultados proteómicos.Otro aspecto limitante en la microbiología clínica es el aislamiento del microorganismo para su posterior identificación. Eliminando este paso, tanto la genómica como la proteómica mejorarían su aplicabilidad en la identificación del agente patógeno en una infección. Por ello, estas mejoras harían posible la aceptación de las técnicas proteómicas en el ámbito asistencial para la detección y diagnóstico en enfermedades infecciosas, reduciendo tiempo y costes.Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses." 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Estadísticas

Revisión

Proteómica en enfermedades infecciosas

Proteomics in infectious diseases

Sara Queroa,b,1, Noemí Párraga-Niñoa,1,

Autor para correspondencia

nparraga@igtp.cat

Autor para correspondencia.

, Marian García-Núñeza,c, Miquel Sabriàb,c,d

a Unitat de Malalties Infeccioses, Fundació Institut d’Investigació Germans Trias i Pujol, Badalona, Barcelona, España

b Universitat Autònoma de Barcelona, Cerdanyola, Barcelona, España

c CIBER de Enfermedades Respiratorias, Bunyola, Illes Balears, España

d Unitat de Malalties Infeccioses, Hospital Universitari Germans Trias i Pujol, Badalona, Barcelona, España

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tanto del pat&#243;geno como del hospedador&#46; Para alcanzar un mejor entendimiento de los procesos de las enfermedades infecciosas es esencial realizar estudios traslacionales y multidisciplinares donde se integran la cooperaci&#243;n del personal implicado en las diferentes &#225;reas de trabajo&#46;</p><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los an&#225;lisis m&#225;s exhaustivos realizados hasta el momento en cuanto a la b&#250;squeda de biomarcadores y nuevas dianas para f&#225;rmacos y vacunas se han realizado a partir de estudios en gen&#243;mica y transcript&#243;mica&#46; En las &#250;ltimas d&#233;cadas ha aumentado significativamente el n&#250;mero de estudios prote&#243;micos en enfermedades infecciosas y en todo el &#225;mbito cl&#237;nico para la b&#250;squeda de biomarcadores y nuevas dianas para la vacunaci&#243;n y f&#225;rmacos&#46;</p><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La secuenciaci&#243;n del genoma microbiano ha revolucionado el estudio de los pat&#243;genos&#44; no solo a nivel de microbiolog&#237;a b&#225;sica&#44; sino tambi&#233;n en diagn&#243;stico&#44; epidemiolog&#237;a&#44; fisiopatolog&#237;a&#44; tratamiento de las enfermedades y desarrollo de vacunas&#46; Adem&#225;s&#44; la secuenciaci&#243;n del genoma microbiano ha posibilitado el estudio de sus proteomas&#46; El primer genoma secuenciado fue el virus del Epstein-Barr &#40;1984&#41;&#44; de 170<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>Kbs<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0010"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>&#44; y una d&#233;cada despu&#233;s&#44; en 1995&#44; se secuenci&#243; el genoma de la bacteria gramnegativa <span class="elsevierStyleItalic">Haemophilus influenzae</span>&#44; de 1&#44;8<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>Mb<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0015"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a>&#46;</p><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Muchos estudios se basaban en el an&#225;lisis de los genes expresados en diferentes tipos celulares y tejidos en diferentes contextos fisiol&#243;gicos&#44; principalmente mediante un an&#225;lisis de ARN mensajero &#40;ARNm&#41;&#44; sin existir a menudo una correlaci&#243;n directa entre el contenido en ARNm y el contenido proteico&#46; La falta de correlaci&#243;n entre los niveles ARNm-prote&#237;na se debe a que el conjunto de prote&#237;na producida por una cantidad dada de ARNm depende del estado fisiol&#243;gico de la c&#233;lula<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0020"><span class="elsevierStyleSup">4</span></a>&#46; Un ejemplo de esta ausencia de correlaci&#243;n entre transcript&#243;mica &#40;ARNm&#41; y prote&#243;mica &#40;prote&#237;na&#41; se demuestra en el trabajo de Franco et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0025"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a>&#44; donde se comparan dos cepas de <span class="elsevierStyleItalic">Helicobacter pylori</span>&#44; una carcinog&#233;nica y un progenitor no carcinog&#233;nico&#46; Los an&#225;lisis en ARNm no mostraron diferencias entre ambas cepas&#44; mientras que a nivel proteico estas cepas eran diferenciables&#46;</p><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La prote&#243;mica es considerada el siguiente paso en el estudio de un sistema biol&#243;gico&#44; despu&#233;s de la gen&#243;mica y transcript&#243;mica&#46; La complejidad de los estudios prote&#243;micos es mayor&#44; ya que el genoma de un organismo es est&#225;tico&#44; mientras que el proteoma difiere de una c&#233;lula a otra y entre estados&#46; El t&#233;rmino proteoma<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0030"><span class="elsevierStyleSup">6</span></a>&#44; definido por Marc Wilkins en 1994&#44; es una imagen din&#225;mica de todas las prote&#237;nas expresadas por un organismo&#44; c&#233;lula o compartimento subcelular concreto&#44; en un momento dado y bajo determinadas condiciones&#44; constituyendo el mapa de expresi&#243;n proteica de una c&#233;lula&#44; tejido u organismo dado&#46; Un factor adicional de complejidad son las modificaciones que puede experimentar la estructura o secuencia b&#225;sica de la prote&#237;na &#40;p&#46;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ej&#46;&#44; el procesado proteol&#237;tico&#41; y las modificaciones postraduccionales &#40;PTM&#41;&#44; que sirven para modificar o modular la actividad&#44; funci&#243;n o localizaci&#243;n de una prote&#237;na en diferentes contextos fisiol&#243;gicos o metab&#243;licos&#46; Finalmente&#44; otro factor de complejidad es el <span class="elsevierStyleItalic">moonlighting</span> o multifuncionalidad&#44; en que una misma prote&#237;na puede realizar varias funciones<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0035"><span class="elsevierStyleSup">7</span></a>&#46;</p><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La prote&#243;mica&#44; t&#233;rmino tambi&#233;n acu&#241;ado por Wilkins&#44; es un nuevo enfoque en el estudio de las prote&#237;nas que ha evolucionado en los &#250;ltimos a&#241;os gracias a la integraci&#243;n de tecnolog&#237;as como m&#233;todos de separaci&#243;n de prote&#237;nas de alto rendimiento&#44; espectrometr&#237;a de masas &#40;MS&#41; y&#44; sobre todo&#44; herramientas en bioinform&#225;tica que han permitido el an&#225;lisis de un gran volumen de datos&#46; Gracias a su aplicabilidad&#44; la prote&#243;mica permite no solo identificar las prote&#237;nas&#44; sino tambi&#233;n categorizarlas y clasificarlas en cuanto a su funci&#243;n e interacciones&#46;</p><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El campo de estudio de la prote&#243;mica es realmente amplio&#44; pero podemos agruparlo en 3 subgrupos&#58; a&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">prote&#243;mica de expresi&#243;n</span>&#44; cuyo objetivo es identificar las prote&#237;nas presentes en la muestra as&#237; como obtener toda la informaci&#243;n acerca de abundancias&#44; PTM y localizaci&#243;n subcelular&#59; b&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">prote&#243;mica estructural</span>&#44; que permite la obtenci&#243;n de la estructura tridimensional de las prote&#237;nas&#44; y c&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">prote&#243;mica funcional</span>&#44; cuya finalidad es averiguar la funci&#243;n de las prote&#237;nas y conocer las interacciones que puedan efectuar&#46;</p><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las t&#233;cnicas en prote&#243;mica ofrecen un novedoso y potente enfoque para el diagn&#243;stico de pat&#243;genos&#44; seguimiento de brotes&#44; din&#225;mica pat&#243;geno-hospedador&#44; control de la enfermedad y desarrollo de f&#225;rmacos y vacunas&#46;</p><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La presente revisi&#243;n tiene como objetivo mostrar la amplia variedad de t&#233;cnicas y aplicaciones disponibles en el campo de la prote&#243;mica destinadas al estudio de las enfermedades infecciosas&#46;</p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0030">Metodolog&#237;as prote&#243;micas</span><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las t&#233;cnicas en prote&#243;mica envuelven multitud de metodolog&#237;as experimentales&#44; como electroforesis en 2 dimensiones &#40;2DE&#41;&#44; cromatograf&#237;a l&#237;quida &#40;LC&#41; y MS&#46; La combinaci&#243;n de estas t&#233;cnicas con un posterior an&#225;lisis bioinform&#225;tico es utilizada para el estudio proteico de una gran variedad de organismos&#46; Estas t&#233;cnicas son potencialmente valiosas&#44; aunque hay complejidades en las muestras que pueden afectar a su an&#225;lisis e interpretaci&#243;n&#44; como son el grado de PTM&#44; el alcance din&#225;mico de la expresi&#243;n &#40;p&#46;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>ej&#46;&#44; la abundancia de alb&#250;mina en plasma enmascara prote&#237;nas minoritarias&#41; y problemas de detecci&#243;n de prote&#237;nas asociadas a membrana<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0040"><span class="elsevierStyleSup">8</span></a>&#46;</p><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El mayor obst&#225;culo para el progreso en el &#225;rea de la prote&#243;mica es la dificultad en la recopilaci&#243;n de pat&#243;genos <span class="elsevierStyleItalic">in vivo</span> en suficiente abundancia y de forma adecuada para an&#225;lisis prote&#243;micos&#46; Aun siendo estas las condiciones id&#243;neas para estudios de expresi&#243;n de prote&#237;nas en microorganismos pat&#243;genos&#44; existen casos en los que no se puede realizar y el cultivo ax&#233;nico <span class="elsevierStyleItalic">&#40;in vitro&#41;</span> se convierte en la mejor opci&#243;n&#46; Se han analizado multitud de pat&#243;genos utilizando t&#233;cnicas prote&#243;micas en condiciones <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span>&#46; Estos estudios permiten conocer la magnitud de expresi&#243;n de prote&#237;nas y tener una idea global de su proteoma&#46; Basarse &#250;nicamente en el estudio del proteoma en estas condiciones puede provocar la p&#233;rdida de una informaci&#243;n fundamental<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0045"><span class="elsevierStyleSup">9-12</span></a>&#44; ya que no permite identificar las prote&#237;nas implicadas en infecci&#243;n&#44; como factores de virulencia&#44; prote&#237;nas que permiten la evasi&#243;n de la respuesta inmune del hospedador y prote&#237;nas que permiten la utilizaci&#243;n de la maquinaria celular del hospedador para propagarse&#46; Una simulaci&#243;n experimental de las condiciones de infecci&#243;n <span class="elsevierStyleItalic">in vivo</span> es la infecci&#243;n de cultivos celulares &#40;simulaci&#243;n <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> del entorno de infecci&#243;n&#41; o la utilizaci&#243;n de modelos animales<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0065"><span class="elsevierStyleSup">13&#44;14</span></a>&#46; La desventaja en estos estudios radica en la presencia de una gran &#171;contaminaci&#243;n&#187; por prote&#237;nas del hospedador&#44; adem&#225;s de una baja obtenci&#243;n de biomasa del pat&#243;geno&#46;</p><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En conjunto&#44; enfoques experimentales <span class="elsevierStyleItalic">in vitro&#47;ex vivo</span> tienen implicaciones significantes con respecto a la identificaci&#243;n de nuevas vacunas&#44; dianas para f&#225;rmacos&#44; biomarcadores de infectividad y progreso de enfermedad&#46;</p><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La mayor&#237;a de las prote&#237;nas implicadas en los primeros estadios de infecci&#243;n del hospedador son las prote&#237;nas de superficie celular&#46; Estas prote&#237;nas son la conexi&#243;n entre la c&#233;lula y el medio extracelular&#44; por lo que son el mediador principal en la infecci&#243;n&#46; Por consiguiente&#44; son componentes de gran inter&#233;s para el desarrollo de nuevas vacunas y para la caracterizaci&#243;n de nuevas dianas para f&#225;rmacos&#46; La informaci&#243;n de estas mol&#233;culas se encuentra en baja representaci&#243;n en los estudios prote&#243;micos debido a su baja abundancia&#44; poca solubilidad y la problem&#225;tica en su fraccionamiento sin una contaminaci&#243;n por prote&#237;nas citoplasm&#225;ticas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0075"><span class="elsevierStyleSup">15&#44;16</span></a>&#46; En el caso del estudio de las bacterias grampositivas y hongos&#44; tambi&#233;n es importante conocer la composici&#243;n proteica de la pared celular y no solo de la membrana plasm&#225;tica<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0085"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a>&#46;</p><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0035">Preparaci&#243;n de muestra</span><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La obtenci&#243;n y preparaci&#243;n de las muestras es uno de los pasos m&#225;s relevantes en los estudios prote&#243;micos&#46; Es de vital importancia que las muestras sean tomadas y procesadas mediante el mismo protocolo para que los resultados obtenidos sean veraces&#44; reproducibles y que las diferencias observadas no sean fruto de la manipulaci&#243;n&#46;</p><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El procesamiento de la muestra en el laboratorio difiere seg&#250;n la procedencia de esta y la finalidad del estudio&#46; En los estudios en cultivo ax&#233;nico no es necesario un aislamiento previo para la obtenci&#243;n de la muestra proteica&#46; Por el contrario&#44; cuando se analiza el microorganismo en estado infectivo&#44; la preparaci&#243;n de la muestra precisa de un aislamiento del microorganismo respecto a las c&#233;lulas del hospedador&#46; Los m&#233;todos m&#225;s com&#250;nmente utilizados para la separaci&#243;n son la centrifugaci&#243;n&#44; la separaci&#243;n inmunomagn&#233;tica &#40;IMS&#41; y la clasificaci&#243;n de c&#233;lulas mediante citometr&#237;a de flujo &#40;FACS&#41;&#46;</p><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El primer m&#233;todo&#44; la centrifugaci&#243;n&#44; es el recomendado para pat&#243;genos con pared celular &#40;plantas&#44; hongos&#44; algas&#44; arqueas y bacterias grampositivas&#41;&#44; previa lisis de las c&#233;lulas eucariotas &#40;hospedador&#41; por presi&#243;n osm&#243;tica<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0090"><span class="elsevierStyleSup">18&#44;19</span></a> o detergentes como el trit&#243;n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>X-114<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0065"><span class="elsevierStyleSup">13</span></a>&#46;</p><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En el segundo m&#233;todo&#44; la t&#233;cnica de IMS&#44; se utilizan part&#237;culas magn&#233;ticas conjugadas con una inmunoglobulina &#40;Ig&#41; espec&#237;fica frente al microorganismo de inter&#233;s&#46; Estos microorganismos pueden ser f&#225;cilmente enriquecidos y purificados&#44; generando suficiente biomasa virtualmente libre de prote&#237;nas del hospedador para un exhaustivo an&#225;lisis del proteoma&#46; La ventaja m&#225;s importante respecto a la centrifugaci&#243;n es la obtenci&#243;n de una muestra libre de contaminantes procedente del hospedador&#46; Por el contrario&#44; esta t&#233;cnica requiere anticuerpos espec&#237;ficos frente a estructuras de la superficie del pat&#243;geno&#46;</p><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En el tercer m&#233;todo&#44; el FACS&#44; se utilizan anticuerpos espec&#237;ficos para el marcaje fluorescente del microorganismo diana&#44; con la finalidad de facilitar la separaci&#243;n de este respecto a otros microorganismos o detritos de la c&#233;lula hospedadora&#46; Esta t&#233;cnica puede separar miles de part&#237;culas por segundo&#44; pero la acumulaci&#243;n de suficiente material pat&#243;geno para la aplicaci&#243;n de t&#233;cnicas prote&#243;micas requiere bastantes horas de clasificaci&#243;n&#44; haci&#233;ndola muy costosa&#46;</p><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Todos estos m&#233;todos de separaci&#243;n deben ser optimizados para incrementar la velocidad de procesamiento de la muestra y reducir el riesgo de digesti&#243;n parcial por proteasas&#44; adem&#225;s de reducir la probabilidad de contaminaci&#243;n con prote&#237;nas del hospedador&#46;</p><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los estudios en prote&#243;mica se pueden dirigir al estudio del proteoma total&#44; subproteoma o una prote&#237;na concreta&#46; La selecci&#243;n de una prote&#237;na o poblaci&#243;n proteica determinada se debe realizar mediante un fraccionamiento de la muestra&#46; Entre las t&#233;cnicas utilizadas para esta finalidad cabe destacar la purificaci&#243;n de afinidad en t&#225;ndem &#40;TAP&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0100"><span class="elsevierStyleSup">20</span></a>&#44; co-inmunoprecipitaci&#243;n &#40;CO-IP&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0105"><span class="elsevierStyleSup">21</span></a> y el chip de exploraci&#243;n del peptidoma mediante HLA<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0110"><span class="elsevierStyleSup">22&#44;23</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0040">T&#233;cnicas prote&#243;micas</span><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las t&#233;cnicas prote&#243;micas se dividen en cualitativas y cuantitativas&#46; Las primeras informan acerca de la expresi&#243;n o no de una determinada prote&#237;na o conjunto proteico &#40;presencia&#47;ausencia&#41;&#44; mientras que la prote&#243;mica cuantitativa permite determinar y comparar la cantidad de prote&#237;na presente en la muestra&#46;</p><p id="par0125" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En los estudios en prote&#243;mica&#44; la muestra es una mezcla compleja de cientos&#47;miles de prote&#237;nas&#46; Por este motivo es esencial la utilizaci&#243;n de una t&#233;cnica de separaci&#243;n&#46; Estas t&#233;cnicas se agrupan en&#58; en gel y <span class="elsevierStyleItalic">gel-free</span>&#46; Las t&#233;cnicas en gel son aquellas en las que se utiliza un entramado de pol&#237;meros para la separaci&#243;n&#46; Las t&#233;cnicas <span class="elsevierStyleItalic">gel-free</span> realizan la separaci&#243;n de la muestra proteica en soluci&#243;n mediante diferentes tipos de cromatograf&#237;a l&#237;quida &#40;intercambio i&#243;nico&#44; afinidad&#44; fase reversa&#8230;&#41;&#46; En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a> se muestran las ventajas y desventajas de las distintas t&#233;cnicas prote&#243;micas&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0045">Prote&#243;mica cualitativa</span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0050">T&#233;cnicas en gel</span><p id="par0130" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La separaci&#243;n de las prote&#237;nas en gel es una herramienta que permite la separaci&#243;n de estas por propiedades como el tama&#241;o &#40;Mr&#41;&#44; el punto isoel&#233;ctrico &#40;pI&#41; y&#47;o la conformaci&#243;n &#40;geles nativos&#41;&#46; La separaci&#243;n en gel se puede realizar por una sola propiedad &#40;monodimensional&#41; o por 2 propiedades consecutivas &#40;bidimensional&#41;&#46; Debido a la complejidad de los extractos proteicos totales&#44; la separaci&#243;n de las muestras en electroforesis bidimensional &#40;2DE&#41; ofrece una mayor resoluci&#243;n&#46; Mediante esta t&#233;cnica las prote&#237;nas son separadas por pI y posteriormente por Mr&#44; obteniendo un mapa global del proteoma de la muestra&#46;</p><p id="par0135" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La t&#233;cnica 2DE &#250;nicamente puede ser aplicada satisfactoriamente si hay un m&#237;nimo de 10<span class="elsevierStyleSup">8</span> c&#233;lulas aisladas&#46; Esta t&#233;cnica permite separar entre 3&#46;000-5&#46;000 prote&#237;nas &#250;nicas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0120"><span class="elsevierStyleSup">24</span></a>&#44; diferenciadas generalmente en un &#250;nico spot&#46; No obstante&#44; una misma prote&#237;na puede identificarse en diferentes spots&#44; indicando que esta prote&#237;na presenta varias isoformas que difieren en pI y&#47;o Mr&#46; Estas isoformas pueden informar acerca de las posibles PTM de una determinada prote&#237;na&#46; Las PTM m&#225;s frecuentes son fosforilaciones&#44; glucosilaciones o prote&#243;lisis limitada<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0125"><span class="elsevierStyleSup">25</span></a>&#46; Otro fen&#243;meno menos com&#250;n es la identificaci&#243;n de dos prote&#237;nas en el mismo spot&#44; debido a su igual pI y Mr&#46;</p><p id="par0140" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La preparaci&#243;n de la muestra para la electroforesis bidimensional es crucial para la obtenci&#243;n de resultados &#243;ptimos&#44; siendo necesarios procesos de solubilizaci&#243;n&#44; disgregaci&#243;n&#44; desnaturalizaci&#243;n y reducci&#243;n de las prote&#237;nas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0130"><span class="elsevierStyleSup">26</span></a>&#46;</p><p id="par0145" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Una posibilidad que ofrecen los geles 2D es su combinaci&#243;n con t&#233;cnicas de marcaje de prote&#237;nas permitiendo la comparaci&#243;n de proteomas en un mismo gel&#44; evitando de esta manera las variaciones interensayo &#40;entre geles&#47;experimentos&#41;&#46; Esta t&#233;cnica es conocida como gel bidimensional diferencial &#40;2D-DIGE&#41;&#46; El marcaje mediante fluor&#243;foros puede ser aplicado al estudio comparativo de 2 proteomas permitiendo una cuantificaci&#243;n relativa de las muestras&#46; Este marcaje puede dirigirse a conjuntos espec&#237;ficos de prote&#237;nas&#59; por ejemplo&#44; el estudio de prote&#237;nas con regiones expuestas hacia el medio extracelular&#46; La aplicabilidad de esta t&#233;cnica ha permitido el estudio del surfoma<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0135"><span class="elsevierStyleSup">27</span></a> evitando el fraccionamiento de prote&#237;nas de superficie&#44; las cuales suelen ser largas y costosas&#46;</p><p id="par0150" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los geles 2D-DIGE se pueden aplicar a la b&#250;squeda de dianas terap&#233;uticas analizando el proteoma <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> frente al proteoma del pat&#243;geno en situaci&#243;n de infecci&#243;n&#44; obteniendo en el mismo gel la comparativa del proteoma en ambas situaciones&#46; Debido a la dificultad para obtener muestra suficiente de pat&#243;geno en situaci&#243;n de infecci&#243;n&#44; se han realizado estudios en los que se compara el proteoma del microorganismo <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> en diferentes fases de crecimiento&#46; En el trabajo de Hayashi et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0140"><span class="elsevierStyleSup">28</span></a> se estudiaron las prote&#237;nas expresadas por <span class="elsevierStyleItalic">Legionella pneumophila</span> en 2 fases de crecimiento&#58; exponencial y postexponencial&#44; observ&#225;ndose una elevada expresi&#243;n de factores de virulencia en la fase postexponencial&#46; Gracias a este estudio se puede establecer en futuros trabajos en <span class="elsevierStyleItalic">Legionella</span> el proteoma en fase postexponencial como aproximaci&#243;n del proteoma en infecci&#243;n&#46;</p><p id="par0155" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Una desventaja importante de la t&#233;cnica 2DE es la limitaci&#243;n en la capacidad de enfoque de prote&#237;nas de media a baja abundancia debido a la gran gama de niveles de expresi&#243;n de prote&#237;nas&#46; Las prote&#237;nas m&#225;s afectadas por dicha limitaci&#243;n son las prote&#237;nas de membrana y prote&#237;nas de bajo peso molecular&#44; que se encuentran subrepresentadas en proteomas totales&#46; Estas prote&#237;nas pueden ser mejor detectadas mediante otras t&#233;cnicas prote&#243;micas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0145"><span class="elsevierStyleSup">29</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0055">T&#233;cnicas <span class="elsevierStyleItalic">gel-free</span></span><p id="par0160" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La t&#233;cnica <span class="elsevierStyleItalic">gel-free</span> requiere una primera separaci&#243;n de las prote&#237;nas presentes en la muestra mediante cromatograf&#237;a l&#237;quida por diferentes propiedades&#44; definidas seg&#250;n la columna utilizada&#46; Existen en el mercado diferentes tipos de columnas&#44; siendo las m&#225;s utilizadas las de fase reversa&#44; intercambio i&#243;nico&#44; afinidad y exclusi&#243;n molecular&#46; Posteriormente se realiza un an&#225;lisis mediante MS para la identificaci&#243;n de las prote&#237;nas &#40;LC-MS&#47;MS&#41;&#46;</p><p id="par0165" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las t&#233;cnicas de separaci&#243;n <span class="elsevierStyleItalic">gel-free</span> son aconsejables cuando la cantidad de muestra es escasa&#44; como es el caso de experimentos en infecci&#243;n en los que se obtiene una baja cantidad de microorganismos&#46; En estos casos&#44; las t&#233;cnicas <span class="elsevierStyleItalic">gel-free</span> MS son adecuadas por ofrecer una mejor sensibilidad&#44; ya que permite monitorizar 500-600 prote&#237;nas desde &#250;nicamente 10<span class="elsevierStyleSup">6</span> c&#233;lulas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0070"><span class="elsevierStyleSup">14</span></a> &#40;una cantidad 100 veces menor que en los geles 2D&#41;&#46; Esta t&#233;cnica permite la detecci&#243;n de prote&#237;nas dif&#237;cilmente separables en 2DE&#44; como prote&#237;nas muy hidrof&#243;bicas&#44; prote&#237;nas de membrana y prote&#237;nas con pI o Mr extremos&#44; como son las prote&#237;nas ribosomales con un pI b&#225;sico<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0150"><span class="elsevierStyleSup">30-32</span></a>&#46; Un claro ejemplo en el que se demuestra esta mayor sensibilidad es el trabajo realizado en <span class="elsevierStyleItalic">Mycoplasma genitalium</span>&#44; modelo de genoma y proteoma m&#237;nimo&#44; en el que se estudi&#243; la fracci&#243;n rica en prote&#237;nas de membrana mediante fraccionamiento por trit&#243;n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>114&#46; El an&#225;lisis de esta fracci&#243;n se realiz&#243; tanto por 2DE como por LC-MS&#44; obteni&#233;ndose una clara diferencia en cuanto a n&#250;mero de prote&#237;nas identificadas&#46; Mediante 2DE se identificaron 49 prote&#237;nas&#44; mientras que por LC-MS se identificaron 242 prote&#237;nas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0165"><span class="elsevierStyleSup">33</span></a>&#46;</p></span></span><span id="sec0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0060">Prote&#243;mica cuantitativa</span><p id="par0170" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La prote&#243;mica cuantitativa es una herramienta &#250;til para los an&#225;lisis prote&#243;micos mediante LC-MS&#47;MS<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0170"><span class="elsevierStyleSup">34</span></a>&#46; Los m&#233;todos de cuantificaci&#243;n se pueden clasificar en cuantificaci&#243;n relativa&#47;absoluta o con&#47;sin marcaje&#46;</p><p id="par0175" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los m&#233;todos de cuantificaci&#243;n relativa &#40;ICAT&#44; iTRAQ&#44; IPTL o SILAC&#41; son utilizados para la comparaci&#243;n de abundancias de prote&#237;nas o p&#233;ptidos entre muestras&#46; Por otro lado&#44; mediante el uso de p&#233;ptidos sint&#233;ticos marcados isot&#243;picamente se obtiene una cuantificaci&#243;n absoluta de los p&#233;ptidos diana&#46;</p><span id="sec0045" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0065">Prote&#243;mica cuantitativa mediante marcaje</span><p id="par0180" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las t&#233;cnicas cuantitativas mediante marcaje utilizan compuestos isot&#243;picos para un posterior an&#225;lisis mediante MS&#44; obteniendo una cuantificaci&#243;n relativa&#46; El marcaje de las prote&#237;nas puede efectuarse durante el crecimiento celular o una vez realizada la extracci&#243;n de estas&#46; Las muestras a comparar son diferenciadas mediante marcaje isot&#243;pico&#46; Seg&#250;n la t&#233;cnica de marcaje diferenciamos&#58; ICAT &#40;<span class="elsevierStyleItalic">isotope code affinity tagging</span>&#58; marcaje por afinidad con codificaci&#243;n isot&#243;pica&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0175"><span class="elsevierStyleSup">35</span></a>&#44; iTRAQ &#40;<span class="elsevierStyleItalic">multiplexed isobaric tagging chemistry</span>&#58; etiquetado isob&#225;rico multiplexado qu&#237;mico&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0180"><span class="elsevierStyleSup">36</span></a> e IPTL &#40;<span class="elsevierStyleItalic">isobaric peptide termini labeling</span>&#58; uni&#243;n terminal isob&#225;rica del p&#233;ptido&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0185"><span class="elsevierStyleSup">37</span></a>&#46;</p><p id="par0185" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La cuantificaci&#243;n relativa mediante marcaje permite la comparativa de 2 poblaciones seg&#250;n su crecimiento celular mediante SILAC &#40;<span class="elsevierStyleItalic">stable isotope labeling by&#47;with amino acids in cell culture</span>&#58; marcaje isot&#243;pico estable de amino&#225;cidos en cultivo celular&#41;&#46; En esta t&#233;cnica&#44; los marcadores isot&#243;picos no radiactivos son incorporados durante el crecimiento celular a las prote&#237;nas sintetizadas <span class="elsevierStyleItalic">de novo</span><a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0190"><span class="elsevierStyleSup">38-41</span></a>&#46;</p><p id="par0190" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las t&#233;cnicas de cuantificaci&#243;n mediante marcaje tienen ciertas limitaciones&#44; como es el incremento de la complejidad en la preparaci&#243;n de la muestra &#40;por el tratamiento independiente de la muestra&#41;&#44; la necesidad de una gran concentraci&#243;n de esta&#44; los costes elevados de los reactivos&#44; marcajes incompletos que distorsionan el resultado y la necesidad de software espec&#237;fico para la cuantificaci&#243;n&#46;</p></span><span id="sec0050" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0070">Prote&#243;mica cuantitativa libre de marcaje</span><p id="par0195" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las estrategias libres de marcaje pueden ser utilizadas para cuantificaci&#243;n tanto relativa como absoluta&#46; Estas t&#233;cnicas alcanzan una mayor rapidez&#44; resultados m&#225;s limpios y un an&#225;lisis simple de los resultados&#46; Por este motivo son prometedoras en la cuantificaci&#243;n de prote&#237;nas poco abundantes debido a su alta sensibilidad&#44; aunque para ser aplicadas se deben tener en cuenta ciertos criterios&#58; a&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>es necesario disponer de espectr&#243;metros de masas con gran precisi&#243;n e instrumentos HPLC con un tiempo seguro de retenci&#243;n&#59; b&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>debe ser aplicado suficiente material para determinar la concentraci&#243;n proteica antes de la medici&#243;n por MS con la finalidad de aplicar cantidades equivalentes de p&#233;ptidos&#44; y c&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>el n&#250;mero de p&#233;ptidos de la c&#233;lula hospedadora debe ser reducido al m&#237;nimo para evitar falsos positivos&#46;</p><p id="par0200" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La cuantificaci&#243;n de prote&#237;nas por este m&#233;todo se basa generalmente en 2 categor&#237;as&#58; a&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>medici&#243;n de los cambios de intensidad de los iones&#44; ya sea por &#225;rea de los picos o por la altura de estos en espectrometr&#237;a&#44; y b&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>recuento de espectros de las prote&#237;nas identificadas despu&#233;s del an&#225;lisis MS&#47;MS<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0210"><span class="elsevierStyleSup">42-53</span></a>&#46;</p><p id="par0205" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Una mejora de la prote&#243;mica cuantitativa sin marcaje es la incorporaci&#243;n de p&#233;ptidos sint&#233;ticos marcados isot&#243;picamente como est&#225;ndares internos&#46; Estos p&#233;ptidos permiten una cuantificaci&#243;n absoluta &#40;AQUA&#58; <span class="elsevierStyleItalic">absolute quantification</span>&#41; de los p&#233;ptidos de inter&#233;s<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0270"><span class="elsevierStyleSup">54</span></a>&#46;</p></span></span></span><span id="sec0055" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0075">Instrumentos para an&#225;lisis e identificaci&#243;n proteica mediante espectrometr&#237;a de masas</span><p id="par0210" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La identificaci&#243;n de prote&#237;nas se realiza en su gran mayor&#237;a mediante espectr&#243;metros de masas&#46; Estos instrumentos permiten la obtenci&#243;n de iones a partir de mol&#233;culas org&#225;nicas&#44; separ&#225;ndolos y detect&#225;ndolos en funci&#243;n de su masa&#47;carga &#40;m&#47;z&#41;&#46; Los espectr&#243;metros de masas constan de 3 componentes&#58; fuente de ionizaci&#243;n&#44; analizador de masa y detector&#46; Existen diferentes tipos de espectr&#243;metros de masas seg&#250;n la combinaci&#243;n de los diferentes elementos&#46; Los m&#225;s com&#250;nmente utilizados son&#58;<ul class="elsevierStyleList" id="lis0005"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0005"><span class="elsevierStyleLabel">&#8226;</span><p id="par0215" class="elsevierStylePara elsevierViewall">MALDI-TOF &#40;<span class="elsevierStyleItalic">Matrix-Assisted Laser Desorption&#47;Ionization-Time Of Flight</span>&#58; desorci&#243;n&#47;ionizaci&#243;n mediante l&#225;ser asistido por matriz&#44; &#171;tiempo de vuelo&#187;&#41;&#58; utilizado com&#250;nmente para la identificaci&#243;n de prote&#237;nas mediante huella pept&#237;dica y el estudio de los perfiles proteicos de una muestra e interacciones de prote&#237;nas&#46; Cabe destacar el desarrollo de la t&#233;cnica del &#171;Imaging&#187;&#44; que permite una visualizaci&#243;n en 2 dimensiones de la distribuci&#243;n de metales traza&#44; metabolitos&#44; l&#237;pidos de superficie&#44; p&#233;ptidos y prote&#237;nas&#44; directamente en los tejidos sin realizar una fijaci&#243;n o extracci&#243;n previa<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0275"><span class="elsevierStyleSup">55&#44;56</span></a>&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0010"><span class="elsevierStyleLabel">&#8226;</span><p id="par0220" class="elsevierStylePara elsevierViewall">SELDI-TOF &#40;<span class="elsevierStyleItalic">Surface Enhanced Laser Desorption Ionization-Time Of Flight</span>&#58; desorci&#243;n&#47;ionizaci&#243;n mediante l&#225;ser de superficie mejorada&#44; &#171;tiempo de vuelo&#187;&#41;&#58; este instrumento utiliza la misma tecnolog&#237;a que el MALDI-TOF incorporando la funcionalizaci&#243;n de la placa &#40;intercambio i&#243;nico&#44; fase reversa&#44; anticuerpos&#44; ADN&#44; otras prote&#237;nas&#44; etc&#46;&#41; en la que se carga la muestra&#46; La comparaci&#243;n de las prote&#237;nas retenidas en la placa entre diferentes muestras puede ser utilizada para la b&#250;squeda de biomarcadores<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0285"><span class="elsevierStyleSup">57</span></a>&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0015"><span class="elsevierStyleLabel">&#8226;</span><p id="par0225" class="elsevierStylePara elsevierViewall">ESI &#40;<span class="elsevierStyleItalic">ElectroSpray Ionization</span>&#58; ionizaci&#243;n por electrospray&#41;&#58; este dispositivo es especialmente &#250;til para la secuenciaci&#243;n pept&#237;dica&#44; ya que permite la ionizaci&#243;n de las macromol&#233;culas fragment&#225;ndolas por los enlaces pept&#237;dicos &#40;uniones m&#225;s d&#233;biles&#41;&#44; obteniendo de esta forma la secuencia aminoac&#237;dica<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0280"><span class="elsevierStyleSup">56&#44;58</span></a>&#46;</p></li></ul></p></span><span id="sec0060" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0080">Bioinform&#225;tica</span><p id="par0230" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los an&#225;lisis prote&#243;micos generan una gran cantidad de datos a analizar&#46; El desarrollo de herramientas bioinform&#225;ticas&#44; como la introducci&#243;n de nuevos algoritmos&#44; ha sido clave para manipular dichos conjuntos de datos&#46; Este campo permite y facilita la manipulaci&#243;n de datos a gran escala&#44; desarrollando programas y herramientas de b&#250;squeda oportunas&#46; Estas herramientas se han aplicado con gran &#233;xito en el procesamiento de datos MS tanto en an&#225;lisis de huella pept&#237;dica &#40;identificaci&#243;n de prote&#237;nas&#41;&#44; huella de fragmentaci&#243;n pept&#237;dica &#40;identificaci&#243;n de la secuencia de p&#233;ptidos&#41; y secuenciaci&#243;n <span class="elsevierStyleItalic">de novo</span>&#46;</p><p id="par0235" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Existen multitud de programas que permiten la identificaci&#243;n <span class="elsevierStyleItalic">in sillico</span> de prote&#237;nas&#46; En estudios prote&#243;micos en enfermedades infecciosas existen programas que permiten la identificaci&#243;n y caracterizaci&#243;n de ep&#237;topos del pat&#243;geno que interaccionan con el sistema inmune del hospedador&#44; inmunoma&#46; Las interacciones pat&#243;geno-hospedador no se conocen en profundidad en muchas de las enfermedades infecciosas&#44; por lo que estudios bioinform&#225;ticos pueden dirigir el estudio de estas interacciones&#46;</p></span></span><span id="sec0065" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0085">Aplicaciones</span><span id="sec0070" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0090">Proteoma de microorganismos</span><p id="par0240" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los estudios del proteoma total de los microorganismos pat&#243;genos son muy valiosos en cuanto a la informaci&#243;n que se obtiene de la expresi&#243;n proteica en una condici&#243;n determinada&#46; En otros estudios es m&#225;s interesante obtener informaci&#243;n de determinados subproteomas&#44; como las prote&#237;nas expuestas en la membrana&#44; o conocer qu&#233; prote&#237;nas desencadenan la respuesta inmune en el hospedador&#46; Cabe destacar el papel de las PTM en la interacci&#243;n entre el pat&#243;geno y el hospedador&#44; por lo que deber&#237;a tenerse en cuenta su estudio en microorganismos pat&#243;genos&#46;</p><span id="sec0075" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0095">Prote&#237;nas de membrana&#44; de superficie y secretadas</span><p id="par0245" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El subproteoma de membrana constituye un conjunto de prote&#237;nas relacionadas con la infecci&#243;n&#46; Existen t&#233;cnicas para la detecci&#243;n de las prote&#237;nas expuestas en la superficie celular &#40;surfoma&#41;&#44; como son el marcaje espec&#237;fico mediante fluor&#243;foros en el 2D-DIGE y el afeitado celular&#46; La t&#233;cnica del afeitado celular se ha utilizado satisfactoriamente en diversos pat&#243;genos humanos grampositivos como en <span class="elsevierStyleItalic">Streptococcus</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0295"><span class="elsevierStyleSup">59</span></a> o en <span class="elsevierStyleItalic">Staphylococcus aureus</span><a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0300"><span class="elsevierStyleSup">60</span></a>&#44; aunque a&#250;n no se conoce con certeza su aplicabilidad en bacterias gramnegativas&#46; Estas bacterias poseen una envuelta celular menos r&#237;gida y menos resistente que las grampositivas&#44; por lo que el &#171;afeitado&#187; compromete la integridad de la membrana y provoca la lisis celular&#46; Como alternativa a estas t&#233;cnicas se han mejorado los protocolos de extracci&#243;n de prote&#237;nas de membrana existentes a trav&#233;s de diferentes detergentes o aislamiento de membranas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0305"><span class="elsevierStyleSup">61</span></a>&#44; como es el caso de la utilizaci&#243;n del tamp&#243;n carbonato para la eliminaci&#243;n de prote&#237;nas solubles contaminantes en las muestras&#46;</p><p id="par0250" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las prote&#237;nas secretadas constituyen un importante subproteoma y pueden desencadenar la lisis de las c&#233;lulas hospedadoras mediante toxinas&#44; que pueden influir en la adhesi&#243;n&#44; colonizaci&#243;n e invasi&#243;n&#44; as&#237; como la desviaci&#243;n de la respuesta inmune del hospedador<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0310"><span class="elsevierStyleSup">62-66</span></a>&#46; Este importante grupo de prote&#237;nas se pierde durante el procesamiento de las bacterias intactas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0335"><span class="elsevierStyleSup">67&#44;68</span></a>&#46; Las prote&#237;nas de las ves&#237;culas de membrana externa &#40;OMV&#41; constituyen un subproteoma muy importante en los pat&#243;genos&#44; ya que desencadenan reacciones inmunog&#233;nicas potentes al ser liberadas por el microorganismo al medio extracelular&#46; Las ves&#237;culas producidas por <span class="elsevierStyleItalic">Neisseria meningitidis</span> han sido utilizadas por su efecto inmunoprotector frente a este pat&#243;geno<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0345"><span class="elsevierStyleSup">69&#44;70</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0080" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0100">Biopel&#237;culas</span><p id="par0255" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las biopel&#237;culas est&#225;n formadas por una biocapa robusta de microorganismos y matriz extracelular&#46; Esta estructura permite a las c&#233;lulas que la componen la uni&#243;n a superficies artificiales o bi&#243;ticas&#44; dificultando la eliminaci&#243;n de los microorganismos que la componen<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0355"><span class="elsevierStyleSup">71</span></a>&#46; Las biopel&#237;culas bacterianas representan una antigua estrategia de supervivencia procariota&#46; Donlan<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0360"><span class="elsevierStyleSup">72</span></a> defini&#243; la biopel&#237;cula como una comunidad microbiana s&#233;sil&#44; caracterizada por c&#233;lulas que est&#225;n adheridas irreversiblemente a un sustrato o interfase&#44; o unas con otras&#44; embebidas en una matriz de sustancias polim&#233;ricas extracelulares que ellas han producido exhibiendo un fenotipo alterado en relaci&#243;n con la tasa de crecimiento y transcripci&#243;n g&#233;nica&#46; La biopel&#237;cula proporciona a las bacterias embebidas en ella ventajas significantes frente a fluctuaciones medioambientales de humedad&#44; temperatura y pH y reserva de nutrientes<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0365"><span class="elsevierStyleSup">73</span></a>&#46; Por este motivo se estudiaron las diferencias en la abundancia de prote&#237;nas entre las c&#233;lulas crecidas en biopel&#237;cula y c&#233;lulas plant&#243;nicas mediante la t&#233;cnica 2DE con tinci&#243;n de plata en <span class="elsevierStyleItalic">Candida albicans</span>&#46; Como resultado de esta comparaci&#243;n&#44; se observ&#243; que las c&#233;lulas crecidas en biopel&#237;cula presentaban una menor capacidad antioxidativa adem&#225;s de presentar la prote&#237;na Pil1p&#44; prote&#237;na sensible al tratamiento con un tipo determinado de antif&#250;ngicos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0370"><span class="elsevierStyleSup">74</span></a>&#46; Este resultado permiti&#243; encontrar una diana y un tratamiento eficaces contra el estado m&#225;s resistente de estas levaduras&#46;</p></span></span><span id="sec0085" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0105">Identificaci&#243;n de microorganismos y sensibilidad a antimicrobianos</span><p id="par0260" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La identificaci&#243;n de los microorganismos causantes de infecci&#243;n es preciso que se logre en el m&#237;nimo tiempo posible&#46; Por ello&#44; un campo amplio de investigaci&#243;n es la b&#250;squeda de t&#233;cnicas de identificaci&#243;n alternativas a las fenot&#237;picas&#47;metab&#243;licas&#44; que requieren&#44; adem&#225;s del aislamiento del microorganismo&#44; entre 18-24<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>h m&#225;s para la identificaci&#243;n de este&#46; Una opci&#243;n para la identificaci&#243;n r&#225;pida de microorganismos es la optimizaci&#243;n de la MS&#46; En la revisi&#243;n de Jordana-Lluch et al&#46;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0375"><span class="elsevierStyleSup">75</span></a> se explica detalladamente el uso de esta t&#233;cnica y los avances obtenidos hasta el momento&#46;</p><p id="par0265" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La aplicaci&#243;n de la MS en la identificaci&#243;n de microorganismos requiere &#250;nicamente del aislamiento y una media de 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#59; sin embargo&#44; en este proceso no se obtienen datos sobre la sensibilidad a antimicrobianos&#46; Para obtener dicha informaci&#243;n es necesaria la realizaci&#243;n de pruebas de sensibilidad del microorganismo&#44; pero dichas pruebas requieren de un tiempo a&#241;adido&#46; Se han realizado estudios utilizando la MS para detectar la presencia de betalactamasas&#44; diferenciar entre <span class="elsevierStyleItalic">S</span>&#46;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span><span class="elsevierStyleItalic">aureus</span> sensibles y resistentes a meticilina&#44; e incluso detectar factores de patogenicidad<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0380"><span class="elsevierStyleSup">76-79</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0090" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0110">B&#250;squeda de biomarcadores en fluidos corporales</span><p id="par0270" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los biomarcadores facilitan el desarrollo de herramientas espec&#237;ficas de diagn&#243;stico&#44; monitorizando la respuesta a la terapia o el progreso de la enfermedad<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0400"><span class="elsevierStyleSup">80</span></a>&#46; Cuando analizamos muestras biol&#243;gicas &#40;de procedencia humana o animal modelo&#41;&#44; la dificultad radica en la creaci&#243;n de grupos homog&#233;neos para asegurar una buena correlaci&#243;n de resultados&#46; Por ello es imprescindible la estandarizaci&#243;n de la clasificaci&#243;n de las muestras&#46;</p><p id="par0275" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La comparativa de fluidos entre pacientes y controles puede permitir la identificaci&#243;n de prote&#237;nas diferenciales&#46; Estas prote&#237;nas pueden ser utilizadas posteriormente como m&#233;todo de diagn&#243;stico r&#225;pido&#46; Un estudio de este tipo se llev&#243; a cabo con el virus de la hepatitis<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>E &#40;HEV&#41;&#44; en el que el plasma y la orina de pacientes infectados fueron analizados mediante 2D-DIGE frente muestras control&#46; Se demostr&#243; que m&#225;s de 30 prote&#237;nas se expresaban de manera diferencial en pacientes con HEV aguda respecto a los controles<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0405"><span class="elsevierStyleSup">81</span></a>&#46; Estos resultados demuestran la potencialidad de la prote&#243;mica en la b&#250;squeda de biomarcadores&#46;</p><p id="par0280" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las prote&#237;nas diferenciales obtenidas en la comparaci&#243;n entre pacientes con diferentes grados de la enfermedad podr&#237;an ser utilizadas para determinar el pron&#243;stico del paciente&#46;</p></span><span id="sec0095" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0115">Inmunoma</span><p id="par0285" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La inmunoprote&#243;mica es una herramienta potencialmente &#250;til en el campo de b&#250;squeda de biomarcadores para enfermedades infecciosas&#44; especialmente en situaciones donde el pat&#243;geno es dif&#237;cil de cultivar <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span><a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0410"><span class="elsevierStyleSup">82-85</span></a>&#46; La tecnolog&#237;a SELDI ha sido aplicada muy recientemente en la identificaci&#243;n de biomarcadores para discernir cepas de <span class="elsevierStyleItalic">Helicobacter pylori</span> asociadas a diferentes estados de la enfermedad<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0430"><span class="elsevierStyleSup">86</span></a>&#46; De esta manera se identifican &#171;firmas&#187; de anticuerpos en suero<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0415"><span class="elsevierStyleSup">83&#44;84</span></a>&#46;</p><p id="par0290" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La identificaci&#243;n y caracterizaci&#243;n de prote&#237;nas antig&#233;nicas es un requerimiento para el desarrollo de vacunas&#44; ya que poseen un gran inter&#233;s como alternativa terap&#233;utica al tratamiento&#46; Para la investigaci&#243;n de la inmunorreactividad de los anticuerpos humanos o anticuerpos de modelos animales frente a las prote&#237;nas microbianas&#44; la combinaci&#243;n de 2DE e <span class="elsevierStyleItalic">inmunoblotting</span> representa el m&#233;todo de elecci&#243;n&#46; Extractos proteicos totales del microorganismo patog&#233;nico son separados por 2DE y las prote&#237;nas inmunorreactivas son detectadas mediante 2D inmunoblots con suero de pacientes infectados&#44; en comparaci&#243;n con el patr&#243;n obtenido con sueros control<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0435"><span class="elsevierStyleSup">87</span></a>&#46; Las prote&#237;nas que generan se&#241;al diferencial entre ambos grupos son identificadas por huella pept&#237;dica&#46;</p><p id="par0295" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La expresi&#243;n proteica var&#237;a seg&#250;n el estado y condici&#243;n de crecimiento de los microorganismos&#46; Por esta raz&#243;n es aconsejable realizar los <span class="elsevierStyleItalic">inmunoblottings</span> con extracto proteico del microorganismo crecido <span class="elsevierStyleItalic">in vivo</span>&#44; para evitar las variaciones transcripcionales&#44; traduccionales y postraduccionales encontradas entre los cultivos <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> vs <span class="elsevierStyleItalic">in vivo</span>&#46;</p><p id="par0300" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La inmunoprote&#243;mica es &#250;til para aportar propuestas generales de diagn&#243;stico o para la selecci&#243;n de biomarcadores<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0415"><span class="elsevierStyleSup">83</span></a>&#46; Adem&#225;s&#44; esta metodolog&#237;a puede ser f&#225;cilmente aplicada a m&#250;ltiples infecciones humanas y de veterinaria de gran importancia por su incidencia y severidad<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0440"><span class="elsevierStyleSup">88-96</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0100" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0120">Vacunas y f&#225;rmacos</span><p id="par0305" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La selecci&#243;n de dianas para f&#225;rmacos y&#47;o vacunas es esencial para la obtenci&#243;n de un resultado &#243;ptimo en el control y&#47;o tratamiento de una enfermedad infecciosa&#46; Los criterios a tener en cuenta para seleccionar una diana son&#58; a&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>que esta sea esencial para la infectividad y proliferaci&#243;n del pat&#243;geno en el hospedador&#59; b&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>que tenga una baja redundancia en las v&#237;as del pat&#243;geno&#44; aunque tenga elevada redundancia en las v&#237;as del hospedador&#44; siempre y cuando se puedan mitigar los efectos t&#243;xicos&#59; c&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>que est&#233; amplia y consistentemente expresada en los tejidos de infecci&#243;n y en los diferentes pacientes de la poblaci&#243;n&#44; y d&#41;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>que sea terap&#233;uticamente tratable utilizando peque&#241;as mol&#233;culas tales como siRNA&#44; anticuerpos u otras modalidades farmac&#233;uticas&#46;</p><p id="par0310" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La vacunolog&#237;a reversa es una t&#233;cnica utilizada en la b&#250;squeda de nuevas dianas&#46; Esta aproximaci&#243;n permite un cribado a favor de las prote&#237;nas con potencial inmunog&#233;nico&#46; Los datos obtenidos del proteoma durante la infecci&#243;n pueden ser explotados como base para el desarrollo de nuevas quimioterapias antimicrobianas y vacunas&#46; Una baja proporci&#243;n de estas prote&#237;nas puede ser utilizada como diana para quimioterapia antimicrobiana<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0485"><span class="elsevierStyleSup">97</span></a> o como ant&#237;geno para vacunas protectoras<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0490"><span class="elsevierStyleSup">98</span></a>&#46; Algunos pat&#243;genos en los que se ha realizado el estudio del inmunoma son&#58; <span class="elsevierStyleItalic">Chlamydia pneumoniae&#44; Haemophilus influenza&#44; Neisseria meningitidis&#44; Helicobacter pylori&#44; Bacillus anthracis&#44; Streptococcus agalactiae&#44; Mycobacterium tuberculosis</span> y <span class="elsevierStyleItalic">Mycobacterium bovis</span><a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0490"><span class="elsevierStyleSup">98-111</span></a>&#46;</p></span></span><span id="sec0105" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0125">Conclusi&#243;n</span><p id="par0315" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La prote&#243;mica es una herramienta verdaderamente &#250;til en el estudio de las enfermedades infecciosas&#44; proporcionando una visi&#243;n global&#46; Los an&#225;lisis prote&#243;micos permiten la realizaci&#243;n de un estudio b&#225;sico de la enfermedad&#44; facilitando la b&#250;squeda de marcadores de infecci&#243;n o virulencia&#46; Posteriormente&#44; los resultados obtenidos tienen una aplicabilidad traslacional dirigida al diagn&#243;stico y pron&#243;stico de la enfermedad&#44; adem&#225;s de permitir el desarrollo de nuevas terapias antimicrobianas y el avance en vacunolog&#237;a&#46;</p><p id="par0320" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las t&#233;cnicas prote&#243;micas no solo permiten la identificaci&#243;n de nuevos marcadores&#44; sino que pueden ser implantadas como t&#233;cnicas de diagn&#243;stico r&#225;pido&#44; pudiendo dirigir el tratamiento con mayor celeridad evitando los cultivos <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span>&#44; que requieren largos tiempos de incubaci&#243;n&#44; retrasando el diagn&#243;stico&#44; adem&#225;s de generar falsos negativos en aquellos microorganismos viables pero no cultivables&#46;</p><p id="par0325" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Esta revisi&#243;n muestra como la prote&#243;mica es una herramienta potente en investigaci&#243;n&#46; A d&#237;a de hoy&#44; muchos expertos consideran las t&#233;cnicas en prote&#243;mica &#250;tiles en el descubrimiento de prote&#237;nas de inter&#233;s cl&#237;nico&#44; como biomarcadores&#44; pero su aplicabilidad asistencial es baja&#46; El resultado obtenido en los trabajos de investigaci&#243;n basados en prote&#243;mica es adaptado a t&#233;cnicas convencionales como el ELISA&#44; pero estas no se mantienen como herramientas en diagn&#243;stico&#46; Esta revisi&#243;n pretende mostrar a los expertos del &#225;mbito cl&#237;nico nuevas t&#233;cnicas disponibles para resolver las dificultades que se presentan d&#237;a tras d&#237;a&#46;</p><p id="par0330" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Actualmente&#44; la prote&#243;mica es un &#225;rea valorada por su clara utilidad&#44; aunque a&#250;n hay mucho trabajo que realizar en &#225;mbitos como las enfermedades infecciosas&#46; Para mejorar su utilidad en el futuro&#44; debemos concienciar a todo el personal implicado en el &#225;mbito asistencial de su importancia&#44; as&#237; como integrar los resultados de los estudios de todas las &#171;&#243;micas&#187;&#46; Este &#250;ltimo aspecto es de gran importancia&#44; ya que&#44; por ejemplo&#44; el conocimiento del genoma de un microorganismo es de vital importancia para la interpretaci&#243;n de los resultados prote&#243;micos&#46;</p><p id="par0335" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Otro aspecto limitante en la microbiolog&#237;a cl&#237;nica es el aislamiento del microorganismo para su posterior identificaci&#243;n&#46; Eliminando este paso&#44; tanto la gen&#243;mica como la prote&#243;mica mejorar&#237;an su aplicabilidad en la identificaci&#243;n del agente pat&#243;geno en una infecci&#243;n&#46; Por ello&#44; estas mejoras har&#237;an posible la aceptaci&#243;n de las t&#233;cnicas prote&#243;micas en el &#225;mbito asistencial para la detecci&#243;n y diagn&#243;stico en enfermedades infecciosas&#44; reduciendo tiempo y costes&#46;</p></span><span id="sec0110" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0130">Conflicto de intereses</span><p id="par0340" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los autores declaran no tener ning&#250;n conflicto de intereses&#46;</p></span></span>"
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                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Desventajas&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " colspan="3" align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">T&#233;cnicas en gel</span></td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>2DE&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Separaci&#243;n de 3&#46;000-5&#46;000 prote&#237;nas<br>Alta resoluci&#243;n<br>F&#225;cil identificaci&#243;n y secuenciaci&#243;n de biomarcadores<br>Detecci&#243;n de las isoformas de una prote&#237;na&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Requiere cantidades considerables de prote&#237;na<br>Limitaci&#243;n para prote&#237;nas de baja abundancia e hidrof&#243;bicas<br>Solapamiento de prote&#237;nas<br>Falta de automatizaci&#243;n&#44; laboriosa<br>Limitaci&#243;n en el n&#250;mero de experimentos&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>2D-DIGE&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Cuantificaci&#243;n relativa entre 2 muestras<br>Ausencia de diferencias interensayo<br>Reducci&#243;n de la cantidad de prote&#237;na&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Elevado coste de los fluor&#243;foros&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " colspan="3" align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">T&#233;cnicas</span> gel-free</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>LC-MS&#47;libre marcaje&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Requiere poca cantidad de prote&#237;na<br>Proceso automatizado<br>Multidimensional<br>Elevada sensibilidad y resoluci&#243;n<br>Posibilidad de cuantificaci&#243;n<br>N&#250;mero ilimitado de experimentos<br>Reducci&#243;n de costes por ausencia de marcaje<br>Menor manipulaci&#243;n de la muestra&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Sensible a contaminantes<br>Baja identificaci&#243;n de prote&#237;nas poco abundantes<br>Dificultad en el ensamblaje de los p&#233;ptidos tripsinizados<br>Menor precisi&#243;n en la cuantificaci&#243;n respecto con marcaje&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>LC-MS&#47;marcaje &#40;ICAT&#44; iTRAQ&#44; SILAC&#44; IPTL&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Requiere poca cantidad de prote&#237;na<br>Proceso automatizado<br>Multidimensional<br>Elevada sensibilidad y resoluci&#243;n<br>Elevada precisi&#243;n en la cuantificaci&#243;n&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Limitaci&#243;n en el n&#250;mero de experimentos<br>Elevado coste de is&#243;topos y p&#233;ptidos sint&#233;ticos<br>Mayor manipulaci&#243;n de la muestra&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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Información del artículo

ISSN: 0213005X
Idioma original: Español

DOI:10.1016/j.eimc.2014.07.015

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2024 Septiembre	359	35	394
2024 Agosto	281	32	313
2024 Julio	290	45	335
2024 Junio	207	36	243
2024 Mayo	354	31	385
2024 Abril	217	31	248
2024 Marzo	257	30	287
2024 Febrero	331	40	371
2024 Enero	353	49	402
2023 Diciembre	350	13	363
2023 Noviembre	505	49	554
2023 Octubre	523	32	555
2023 Septiembre	284	20	304
2023 Agosto	348	9	357
2023 Julio	326	32	358
2023 Junio	383	47	430
2023 Mayo	541	39	580
2023 Abril	411	30	441
2023 Marzo	503	45	548
2023 Febrero	259	40	299
2023 Enero	166	23	189
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2022 Noviembre	265	28	293
2022 Octubre	269	35	304
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2022 Agosto	218	31	249
2022 Julio	195	31	226
2022 Junio	172	24	196
2022 Mayo	259	56	315
2022 Abril	216	28	244
2022 Marzo	160	24	184
2022 Febrero	271	18	289
2022 Enero	170	28	198
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2021 Noviembre	293	54	347
2021 Octubre	230	41	271
2021 Septiembre	213	49	262
2021 Agosto	483	36	519
2021 Julio	187	38	225
2021 Junio	173	15	188
2021 Mayo	211	22	233
2021 Abril	593	100	693
2021 Marzo	231	56	287
2021 Febrero	208	66	274
2021 Enero	245	62	307
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