La identificación proteómica de micobacterias no tuberculosas (MNTs) mediante MALDI-TOF presenta una mayor complejidad debido a la especial composición de su pared celular, que complica la extracción de proteínas. Un total de 106 aislamientos pertenecientes a diferentes especies de MNTs procedentes de muestras clínicas del Complejo Asistencial Universitario de León recogidas durante los años 2019 y 2020 se han identificado por un método proteómico abreviado (MALDI-TOF Biotyper Bruker®) desarrollado en nuestro laboratorio. La identificación se ha comparado con la realizada en paralelo en el Centro de Referencia de Majadahonda. Se analizaron un total de 22 especies diferentes de MNTs obteniendo una concordancia del 91,5%. Las nueve discrepancias detectadas se dieron entre especies pertenecientes al mismo grupo taxonómico. En el 67,92% de las identificaciones el score fue superior a 1,8. En el tiempo de procesamiento se obtuvo un ahorro aproximado de 24 minutos con respecto al recomendado por el fabricante.
Proteomic techniques relaying upon mass spectrometry (MALDI_TOF) applied to nontuberculous mycobacteria (NTM) identification, constitute a difficult goal. Cell wall structure features complicates the protein extraction procedure. A total of 106 isolates belonging to a variety of MNTs species isolated from clinical samples taken at the Complejo Asistencial Universitario de León for a two years period (2019-20) were identified following a simplified method (MALDI-TOF Biotyper Bruker®) developped in our laboratory. The resultant identification was compared to a parallel one ruled on the Centro de Referencia de Majadahonda. A total of 22 different MNTs species were tested, obtaining an agreement of 91,5%. Only 9 minor discrepancies between species belonging to the same taxonomic group of MNTs were detected. The score obtained in the 67.92% of the cases was higher than 1.8. A time-saving of 24 minutes compared to the manufacturer‘s proceeding was achieved.
Desde hace algunos años la identificación de las micobacterias no tuberculosas (MNTs) se fundamenta en métodos moleculares. El empleo de técnicas proteómicas como la espectrometría de masas (MALDI-TOF) se ha impuesto y ha revolucionado los laboratorios de microbiología. Sin embargo, esta tecnología encuentra especiales dificultades en el campo de la micobacteriología. La especial complejidad de la pared celular micobacteriana y su complejo proteoma1 convierte la extracción de las proteínas en una tarea nada fácil, en cualquier caso, menos eficiente que en el resto de las bacterias. Recientemente se han descrito hasta 35 proteínas diferentes en el ribosoma micobacteriano, muchas de ellas de mayor tamaño que sus equivalentes en E. coli y algunas de ellas específicas de micobacterias2. Esta especificidad permite que mediante MALDI-TOF se puedan distinguir los perfiles proteómicos de M. chimaera y M. intracellulare, ambas especies del mismo grupo taxonómico3.
Otro problema sobreañadido es que las bases de datos (BD) de los sistemas MALDI comercialmente disponibles no disponen de un completo catálogo que cubra todas las especies de MNTs o que los aislamientos más habituales de nuestra área geográfica no estén suficientemente representados. Según muestra Alcaide et al. en su revisión colaborativa, al menos 17 especies raras de MNTs no se encontraban en la versión 4.0 de la BD de Brucker y al menos 12 en la siguiente versión 5.04.
Los sistemas de extracción recomendados por el fabricante (Bruker®) son laboriosos y con resultados variables5. Por otra parte, en algunas publicaciones se pone de manifiesto que la identificación basada en espectrometría de masas es igual o superior a algunos sistemas comerciales de hibridación reversa como GenoType6. En nuestro laboratorio hemos tratado de simplificar el sistema de extracción de proteínas para tratar de acortar este tedioso proceso de extracción y preparación. Nuestro objetivo ha sido comparar la identificación de MNTs por el método proteómico abreviado (MALDI-TOF Biotyper Bruker®) con la identificación realizada en el Centro de Referencia.
MétodosSe han recogido datos de 106 aislamientos pertenecientes a diferentes especies de MNTs procedentes de muestras clínicas del Complejo Asistencial Universitario de León durante los años 2019 y 2020. Para la identificación se partió de colonias de cultivos preferentemente jóvenes con buen crecimiento, aisladas en medio de Lowenstein-Jensen comercial y en agar Middlebrook 7H11 fresco (no comercial). Se resuspendieron en 1 mL de agua y se inactivaron en termobloque a 95°C durante 20 minutos. Se centrifugaron, se decantó el sobrenadante, se resuspendieron en 20 μL de etanol y vórtex. Tras una breve centrifugación se retiró el etanol y se dejó secar el pellet en un termobloque a 45°C. A continuación se colocó directamente el pellet sobre el pocillo de la placa con ayuda de un palillo. Se prosiguió añadiendo 1 μL de ácido fórmico al 100% y una vez seco se añadió 1 o 2 μL (dependiendo del pellet) de matriz y se dejó secar. Por último, se procedió a la lectura automática por el método «standard» de MALDI Biotyper Bruker® y después en modo manual. Para la identificación se empleó la base de datos de micobacterias de Brucker (versiones v5.0 y v6.0). Paralelamente las mismas cepas se enviaron al Laboratorio de Micobacterias del Centro de Referencia CNM de Majadahonda, donde se realizó la identificación final por métodos moleculares (PRA HSP-65).
ResultadosSe identificaron un total de 22 especies diferentes de MNTs. De los 106 aislamientos de MNTs estudiados 17 se identificaron como M. avium, 15 M. chimaera-intracellulare, 14 M. gordonae, ocho M. chelonae, siete M. lentiflavum, siete M. abscessus, siete M. paragordonae, seis M. mageritense, cuatro M. peregrinum, cuatro M. elephantis, dos M. celatum, dos M. salmoniphilum, dos M. malmoense y un sólo aislamiento del resto de las especies, tal y como se indica en la tabla 1. Al comparar la identificación proteómica con la realizada en el Centro de Referencia, 98 de las 106 micobacterias se identificaron correctamente a nivel especie, lo que supone un porcentaje de concordancia del 91.5%. Las nueve discrepancias detectadas se han producido todas ellas en las pertenecientes al mismo grupo taxonómico: cuatro discrepancias entre las del grupo M. avium-complex, una entre las del grupo M. fortuitum complex, una entre las del grupo M. chelonae dos entre M. gordonae y M. paragordonae y una entre M.lentiflavum y M.interjectum. Con respecto al score obtenido en el sistema de identificación MALDI, en 72 de las 106 cepas estudiadas (67,92%) el score medio fue superior a 1,8, siendo ligeramente superior en las de rápido crecimiento (1,94) que en las de lento (1,84). Con respecto al método de extracción, el tiempo aproximado de procesamiento se redujo desde 83 minutos (procedimiento MycoEx de Brucker®) a 59 minutos con el procedimiento abreviado (tabla 2).
Correlación entre la especie de MNT identificada por técnicas proteómicas (MALDI-TOF) y la identificación genómica por el Centro de Referencia (PRA HSP-65)
| Especie de MNTN= 22 | N=106 | <1.59 | 1.6-1.79 | >1.80 (%) | Score medio MALDI | N° discrepancias | ID Centro de Referencia |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| MNTs DE CRECIMIENTO LENTON=72 | 1.84 | ||||||
| M. avium | 17 | 3 | 3 | 11 (64.7) | 1,838 | 1 | M.intracellulare II |
| M. chimaera IC | 15 | 2 | 3 | 10 (66.6) | 1,961 | 2 | M.intracellulare I |
| M. lentiflavum | 7 | 1 | 1 | 5 (71.4) | 1,861 | 1 | M.interjectum |
| M. gordonae | 14 | 2 | 12 (85.7) | 1,855 | |||
| M. celatum | 2 | 2 (100) | 2,210 | ||||
| M. paragordonae | 7 | 2 | 1 | 4 (57.1) | 1,922 | 2 | M.gordonae III (los 2) |
| M. kumamotonense | 1 | 1 (100) | 2,262 | ||||
| M. malmoense | 2 | 1 | 1 (50) | 1,545 | |||
| M. xenopi | 1 | 1 | 1,410 | ||||
| M. kansasii | 1 | 1 (100) | 1,980 | ||||
| M. marinum | 1 | 1 (100) | 2,090 | ||||
| M. paraffinicum | 1 | 1 | 1,600 | ||||
| M. vulneris | 1 | 1,408 | 1 | M.intracellulare II | |||
| MNTs DE CRECIMIENTO RÁPIDON=34 | 1.94 | ||||||
| M. chelonae | 8 | 1 | 3 | 4 (50) | 1,743 | ||
| M. abscesus | 7 | 2 | 5 (71.4) | 1,905 | |||
| M. mageritense | 6 | 6 (100) | 2.198 | ||||
| M. peregrinum | 4 | 2 | 2 (50) | 2,021 | |||
| M. elephantis | 4 | 4 (100) | 2,028 | ||||
| M. porcinum | 1 | 1 (100) | 2,410 | ||||
| M. septicum | 1 | 1 (100) | 1,877 | 1 | M.peregrinum III | ||
| M. salmoniphilum | 2 | 1 | 1 (50) | 1,844 | 1 | M.chelonae I | |
| M. holsaticum | 1 | 1 | 1 | 1,460 | |||
MNTs: micobacterias no tuberculosas.
Comparación de los tiempos de extracción y procesamiento de los aislamientos de micobacterias no tuberculosas (MNTs) según el método recomendado por el fabricante (MycoEx Brucker® rev 3) y según el método abreviado
| Proceso | Procedimiento abreviado (min.) | Procedimiento fabricante (min.) |
|---|---|---|
| Inactivación 90°C | 20 | 30 |
| Centrifugación | 5 | 5 |
| Agua | - | 2 |
| Etanol absoluto | 2 | 2 |
| Centrifugación | 2 | 4 (2x2) |
| Secado pellet | 10 | 10 |
| Acetonitrilo zirconia | - | 4 |
| Ácido fórmico | 10* | 4 |
| Centrifugación | - | 2 |
| Poner muestra y secado | -* | 10 |
| Poner matriz y secado | 10 | 10 |
| Total tiempo | 59 min. | 83 min. |
La versión v5.0 de la librería de micobacterias del MALDI Biotyper contiene 912 espectros correspondientes a 159 especies de micobacterias, mientras que la versión v2.12 de la librería RUO de VITEK MS contiene 1.286 espectros que representan a las 45 especies de micobacterias más frecuentes en el ambiente clínico7. La última versión de MALDI Biotyper (v6.0) contiene 1.038 espectros correspondientes a 177 especies de micobacterias. A pesar del notable incremento en el número de especies y de aislamientos en la BD Brucker, cuando el número de cepas de una misma especie en la BD es pequeño, existe la posibilidad de que el software nos lleve al taxón más próximo con un score insuficiente. La gran variabilidad geográfica de las MNTs plantea problemas puntuales en la identificación de aquellas especies raras, pero con un predominio local.
El protocolo de extracción recomendado por Sociedad española de Microbiología y Enfermedades Infecciosas y en la mayoría de los casos3,6,7 incluye el empleo de acetonitrilo junto con bolas de zirconia. En algunas publicaciones se ha suprimido el paso de acetonitrilo, obteniendo scores similares 8 por lo que hemos probado eliminando este paso y colocando el pellet directamente sobre el pocillo de la placa (no el sobrenadante) para después añadir la matriz (compuesta al 50% por acetonitrilo). En esta masa del pellet estarían buena parte de las proteínas ribosómicas, como ocurre con bacterias convencionales, lo que explicaría el score obtenido. Según se establece en algunas publicaciones los protocolos de inactivación empleados para la extracción de ADN en Mycobacterium tuberculosis9,10, proponen un tiempo de inactivación de 20 minutos a 95°C, que aplicados a MNTs, suponen una reducción del tiempo global de procesamiento.
En la identificación de micobacterias se considera de alta confianza un score mayor o igual a 1,8. En nuestro caso el score final obtenido podría ser comparable al de otros autores11 partiendo del pellet del medio líquido, salvando la disparidad en la proporción de especies estudiadas. En nuestra experiencia el empleo de colonias crecidas en medio Middlebrook 7H11 fresco (no comercial) aumenta el score y mejora las probabilidades de identificación con este sistema abreviado de extracción, evitando repetir el proceso, siendo especialmente notable en las de rápido crecimiento. Con cierta frecuencia se realizan identificaciones inesperadas de M. chelonae procedentes de abscesos que han seguido idéntico procesamiento que un E. coli, obteniendo scores superiores a 2. Esto sugiere que en las de rápido crecimiento podría bastar una extracción de proteínas convencional o al menos no tan exigente. En nuestra experiencia, cuando se parte de medios líquidos, los scores obtenidos con el método estándar o el abreviado son menores o no identifica a la primera, lo que prolonga el tiempo de procesamiento. La ventaja de partir de colonias aisladas en medios sólidos es evitar las posibles mezclas de colonias/especies en medios líquidos, sorteando perfiles proteómicos mixtos y erróneos, conducentes a falsas identificaciones. Para perfeccionar este sistema abreviado de extracción sería necesario procesar un mayor número de especies y de aislamientos de MNTs que contribuya a mejorar su rentabilidad.
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
