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Su forma más frecuente es la hipermetilación de islotes CpG, esto es, secuencias del genoma ricas en guanina y citosina que se localizan principalmente en regiones promotoras y que se encargan del control de la actividad transcripcional de los genes. Su estado de metilación se ha implicado en la activación de oncogenes e inactivación de genes supresores tumorales<span class="elsevierStyleSup">2</span>.</p><p class="elsevierStylePara">Los genes supresores de tumores son buenos candidatos para inactivarse mediante este mecanismo<span class="elsevierStyleSup">3</span>. Se ha demostrado que la inactivación por hipermetilación de algunos genes supresores en la línea germinal puede predisponer a casos hereditarios de cáncer<span class="elsevierStyleSup">1</span>. Un ejemplo conocido de esta situación son las alteraciones de los genes reparadores MMR <span class="elsevierStyleItalic">(mismatch repair genes)</span>, en concreto, del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span>. Este gen se ha estudiado ampliamente en los casos de cáncer de colon hereditario no polipoideo<span class="elsevierStyleSup">4</span>, en el que la hipermetilación representa la causa más frecuente de inactivación epigenética y guarda, además, una estrecha relación con la presencia de inestabilidad de microsatélites<span class="elsevierStyleSup">5</span>. Este fenómeno también se ha comprobado en otros tipos de tumores<span class="elsevierStyleSup">6-8</span> y, aunque se ha descrito, está por determinar su importancia en los casos de cáncer de colon esporádico<span class="elsevierStyleSup">9</span>. La inactivación por hipermetilación del promotor del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> también se ha implicado en la progresión tumoral y en la respuesta a quimioterápicos<span class="elsevierStyleSup">7</span>.</p><p class="elsevierStylePara">El carcinoma de células renales (CCR) es un tumor heterogéneo desde el punto de vista histológico, genético y de comportamiento clínico. Sus alteraciones genéticas más frecuentes son las deleciones del brazo corto del cromosoma 3 (3p11-3p25), tanto en casos esporádicos como familiares<span class="elsevierStyleSup">10</span>. En cuanto a los genes analizados en el CCR, el más estudiado ha sido el gen supresor <span class="elsevierStyleItalic">VHL</span>, en el que se detectan alteraciones en un 30-57% de los casos<span class="elsevierStyleSup">11,12</span>.</p><p class="elsevierStylePara">La relación entre los genes MMR y el CCR apenas se ha estudiado, a pesar de que existen indicios de que las alteraciones en estos genes podrían desempeñar un papel importante en la carcinogénesis del CCR. En estos estudios se ha comprobado en líneas celulares de CCR una disminución de la expresión de ARNm tanto de <span class="elsevierStyleItalic"> hMLH1</span> como <span class="elsevierStyleItalic">hMSH3</span><span class="elsevierStyleSup">13</span>, además de encontrarse fenómenos de hipermetilación en algunas de ellas<span class="elsevierStyleSup">14</span>. Basándonos en estos datos nos planteamos determinar la existencia de alteraciones epigenéticas por hipermetilación en la región promotora del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> en pacientes con CCR esporádico, así como sus posibles implicaciones pronósticas.</p><p class="elsevierStylePara">Material y método</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Muestras</span></p><p class="elsevierStylePara">Se han analizado muestras de tejido tumoral procedentes de 65 pacientes diagnosticados de forma consecutiva de CCR esporádico y tratados quirúrgicamente en el Complejo Hospitalario Universitario de Albacete. El diagnóstico y la estadificación de los pacientes se realizaron según el protocolo establecido por la comunidad urológica, utilizándose la clasificación TNM para el estadio tumoral y la de Furhman para el grado de diferenciación celular. Tras solicitar su consentimiento por escrito para participar en el estudio, se obtuvieron de las historias clínicas los datos correspondientes a edad, sexo, clínica de inicio y características patológicas.</p><p class="elsevierStylePara">Una vez recogidas, las muestras se congelaron a ­80 °C hasta su procesamiento. Para la obtención y purificación del ADN genómico tumoral se utilizó el equipo comercial KIAamp DNA mini kit (Qiagen<span class="elsevierStyleSup">®</span>), siguiendo las instrucciones del fabricante.</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Digestiones de ADN con enzimas de restricción</span></p><p class="elsevierStylePara">Se realizaron 2 digestiones independientes de cada una de las muestras de ADN empleando las enzimas de restricción <span class="elsevierStyleItalic">Hpa</span>II y <span class="elsevierStyleItalic">Msp</span>I. Ambas enzimas reconocen la secuencia CCGG, aunque <span class="elsevierStyleItalic">Hpa</span>II no digiere la diana de restricción cuando la citosina presente en el dinucleótido CG está metilada. Las reacciones se realizaron durante 16 h a 37 °C en un volumen de 20 µl, y se emplearon en cada una de ellas 400 ng de ADN y 20 U de enzima. El producto de digestión se empleó como molde para llevar a cabo diferentes reacciones de amplificación ­reacción en cadena de la polimerasa (PCR)­. Como control negativo del estado de metilación del promotor del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> se utilizó ADN procedente de sangre venosa periférica de 2 individuos sanos, y como control positivo, el mismo ADN tratado con la metilasa <span class="elsevierStyleItalic">Hpa</span>II. Como control positivo adicional se utilizó ADN de la línea celular 293T procedente de tejido renal humano, caracterizada por tener inactivado por metilación el promotor del gen <span class="elsevierStyleItalic"> hMLH1</span><span class="elsevierStyleSup">15</span>.</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Reacción en cadena de la polimerasa</span></p><p class="elsevierStylePara">En la región promotora del gen <span class="elsevierStyleItalic"> hMLH1</span> existen 4 sitios CCGG, en las posiciones S1 (­567), S2 (­527), S3 (­347) y S4 (­341) (fig. 1). Los sitios S1 y S2 se amplificaron en reacciones independientes, mientras que los sitios S3 y S4 se amplificaron conjuntamente. Se realizaron 3 reacciones de amplificación de cada uno de estos sitios empleando ADN molde digerido independientemente con las enzimas de restricción <span class="elsevierStyleItalic">Hpa</span>II y <span class="elsevierStyleItalic">Msp</span>I y el mismo ADN molde sin digerir. El volumen total de cada reacción fue de 25 µl y contenía 100 ng de ADN, dNTPs (200 µmol), ADN <span class="elsevierStyleItalic">Taq</span> polimerasa (0,5 U) (Biotools<span class="elsevierStyleSup">®</span>) y cebadores (400 nmol). La temperatura de hibridación fue de 58 °C en todos los casos y se emplearon 25 ciclos de amplificación<span class="elsevierStyleSup">16</span>.</p><p class="elsevierStylePara"><img src="2v126n12-13086325tab01.gif"></img></p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Fig. 1. Localización de los 4 sitios de metilación estudiados en el promotor del gen</span> hMLH1<span class="elsevierStyleItalic">. Las flechas del mismo color indican la localización de los cebadores empleados para amplificar cada uno de los fragmentos que contienen en su interior un sitio metilable, nombrados como S1, S2, S3 y S4. El número entre paréntesis indica la posición de cada sitio en el promotor.</span></p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Electroforesis en gel de agarosa</span></p><p class="elsevierStylePara">Los productos de amplificación se analizaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% y se detectaron mediante bromuro de etidio. Las bandas obtenidas se fotografiaron con un sistema de fotodocumentación (GelDoc-it Imaging System UVP).</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Análisis densitométrico</span></p><p class="elsevierStylePara">Se usó el programa Quantity One 4,1 (Bio-rad) para cuantificar cada uno de los fragmentos amplificados por PCR. Se determinó el porcentaje del amplicón obtenido después de digerir el ADN tumoral con la enzima <span class="elsevierStyleItalic"> Hpa</span>II, respecto al mismo amplicón obtenido sin digestión previa del ADN (control positivo de la PCR).</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Resultados</span></p><p class="elsevierStylePara">La edad media de los pacientes analizados en el presente estudio fue de 63,7 años (intervalo de confianza del 95%, 61,2-66,3) y 43 (66,3%) eran varones. El hallazgo incidental al realizar estudios radiológicos abdominales fue la causa de diagnóstico más frecuente (56,9%). En los casos en que hubo clínica indicativa de tumor renal, la clínica más frecuente fue la hematuria (16,9%). En un solo caso el tumor fue bilateral y en 2 fue múltiple. Se realizaron nefrectomías radicales en 45 casos (69,2%) y en los 20 restantes se efectuó cirugía conservadora electiva de parénquima renal. En la tabla 1 se describen las características anatomopatológicas de los pacientes. El tipo celular más frecuente fue el carcinoma de células claras, con 44 casos (67,7%). Un 73,9% de los casos se diagnosticaron en estadios inferiores a pT2; presentaban afectación ganglionar en el momento del diagnóstico 6 pacientes (9,3%), y metástasis a distancia, 13 (20%). El 61% tuvo un grado celular de Furhman inferior a 2.</p><p class="elsevierStylePara"><img src="2v126n12-13086325tab02.gif"></img></p><p class="elsevierStylePara">El análisis de metilación del promotor del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> (fig. 2A) mostró en todos los pacientes analizados un patrón de amplificación similar al obtenido con ADN de sangre de individuos sanos, empleado como control negativo de metilación (fig. 2B). Además, el patrón observado en las muestras de los pacientes fue distinto del obtenido con los controles positivos de metilación (ADN tratado con metilasa y ADN procedente de la línea celular 293T; figs. 2C y 2D, respectivamente). Estos resultados muestran que los sitios S1-S4 de la región promotora del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> no están metilados en los pacientes analizados.</p><p class="elsevierStylePara"><img src="2v126n12-13086325tab03.gif"></img></p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleItalic">Fig. 2. Análisis del estado de metilación del promotor del gen</span> hMLH1<span class="elsevierStyleItalic">. Se indica en cada calle del gel la enzima con la que se digirió el ADN molde. El control positivo (C+) de la reacción en cadena de la polimerasa se realizó con ADN sin digerir, y el control negativo (C­) no incluyó ADN. Ejemplo representativo (A) obtenido a partir de uno de los tumores analizados en este estudio y control negativo de metilación (B), realizado con ADN genómico purificado a partir de sangre de individuos sanos. Como controles positivos de metilación se empleó ADN previamente metilado con la enzima</span> HpaII <span class="elsevierStyleItalic">metilasa (C) y ADN de la línea celular 293T, en la que el promotor del gen</span> hMLH1 <span class="elsevierStyleItalic">se encuentra inactivado por metilación (D). M: marcador de tamaño molecular; pb: pares de bases.</span></p><p class="elsevierStylePara">En 12 muestras (18,5%) se observaron productos de amplificación de intensidad débil después de la digestión con <span class="elsevierStyleItalic">Hpa</span>II. Estos casos no presentaron ninguna característica anatomopatológica distinta del resto. Al realizar un análisis densitométrico de los amplicones, se comprobó que su intensidad respecto a la de su control positivo (ADN sin digerir) no alcanzó en ningún caso el 50%, porcentaje esperable en un estado de metilación monoalélica; la media se encontraba en el 12,8% (intervalo de confianza del 95%, 9,8-15,85; extremos: 5-22%). Hallazgos similares se registraron en los estudios que se realizaron con ADN genómico de sangre de individuos controles sanos (ADN no metilado), lo que indica la existencia de digestión incompleta con la enzima <span class="elsevierStyleItalic">Hpa</span>II.</p><p class="elsevierStylePara"><span class="elsevierStyleBold">Discusión</span></p><p class="elsevierStylePara">Estudios previos han mostrado que el CCR puede estar relacionado con la hipermetilación de una amplia variedad de genes, como, por ejemplo: <span class="elsevierStyleItalic">CDH1, APC, MGMT, RASSF1A, GSTP1, p16, RAR-beta2, ARF</span><span class="elsevierStyleSup">17</span>, <span class="elsevierStyleItalic">Timp-3, VHL</span><span class="elsevierStyleSup">18</span> y el gen de la E-caderina<span class="elsevierStyleSup">15</span>. Estos trabajos han evidenciado la presencia de hipermetilación en uno o más de estos genes en un 93% de los casos; el gen hipermetilado más frecuentemente es el <span class="elsevierStyleItalic">Timp-3</span> (58%). Incluso se ha comprobado que el tratamiento de algunas líneas celulares con 5-aza-2'-deoxicitidina (agente desmetilante) restauró la expresión del ARNm del gen E-caderina<span class="elsevierStyleSup">19</span> y del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span><span class="elsevierStyleSup">20</span>. Por el contrario, otros estudios no han evidenciado diferencias en la expresión de <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> y <span class="elsevierStyleItalic">hMSH3</span> en líneas celulares de CCR tratadas con este agente<span class="elsevierStyleSup">13</span>. En cuanto al gen <span class="elsevierStyleItalic">VHL</span>, la hipermetilación de su promotor únicamente aparece en el CCR de tipo células claras<span class="elsevierStyleSup">18</span>.</p><p class="elsevierStylePara">Hasta donde sabemos, el presente estudio analiza por primera vez la relación entre la hipermetilación del promotor del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> y el CCR esporádico empleando muestras de tejido tumoral humano. Concretamente, centramos nuestro estudio en el gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span>, ya que no se ha demostrado hipermetilación en el promotor de otros genes MMR como <span class="elsevierStyleItalic"> hMSH2</span><span class="elsevierStyleSup">20</span>. Con una técnica basada en el uso de enzimas de restricción no hemos detectado metilación bialélica en el gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> en ninguna de las 65 muestras analizadas, lo que coincide con datos publicados en estudios previos con líneas celulares de CCR<span class="elsevierStyleSup">14</span>. Aunque existen diferentes técnicas de análisis del estado de metilación (basadas, por ejemplo, en la modificación del ADN mediante tratamiento con bisulfito), requieren mayor cantidad de ADN y presentan mayor complejidad metodológica que la empleada en el presente estudio. Además, la técnica basada en digestiones enzimáticas es rápida, sencilla y fiable<span class="elsevierStyleSup">21</span>. La presencia de un producto de amplificación minoritario en algunos de los ADN digeridos con <span class="elsevierStyleItalic">Hpa</span>II puede deberse tanto a digestión parcial como a metilación monoalélica. El análisis llevado a cabo sobre ADN genómico purificado a partir de muestras de sangre de individuos sanos, en los que el promotor del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> no está metilado, mostró también la existencia de una banda que representa aproximadamente el 10% de la obtenida cuando no se digiere el ADN previamente a la amplificación. Este resultado indica que la banda minoritaria es el resultado de una digestión incompleta del ADN por la enzima <span class="elsevierStyleItalic">Hpa</span>II, ya que, si se tratara de metilación monoalélica, debería representar aproximadamente el 50% de la banda control.</p><p class="elsevierStylePara">En conclusión, nuestros resultados indican que la metilación del promotor del gen <span class="elsevierStyleItalic">hMLH1</span> no está implicada en la patogenia del CCR esporádico. Por tanto, es necesario analizar la existencia de mutaciones en otros genes, la presencia de inestabilidad de microsatélites o de pérdida de heterocigosis para determinar si la alteración de los genes MMR desempeña algún papel en la patogenia del CCR.</p>" "pdfFichero" => "2v126n12a13086325pdf001.pdf" "tienePdf" => true "PalabrasClave" => array:2 [ "en" => array:1 [ 0 => array:4 [ "clase" => "keyword" "titulo" => "Keywords" "identificador" => "xpalclavsec223299" "palabras" => array:4 [ 0 => "Methylation" 1 => "Renal cell carcinoma" 2 => "hMLH1 gene" 3 => "Mismatch repair genes" ] ] ] "es" => array:1 [ 0 => array:4 [ "clase" => "keyword" "titulo" => "Palabras clave" "identificador" => "xpalclavsec223298" "palabras" => array:4 [ 0 => "Metilación" 1 => "Carcinoma de células renales" 2 => "hMLH1" 3 => "Genes reparadores alterados" ] ] ] ] "tieneResumen" => true "resumen" => array:2 [ "en" => array:1 [ "resumen" => "Background and objective: Epigenetic inactivation is a gene function abnormality that produces no changes in the DNA sequence, with the most frequent epigenetic alteration being hypermethylation of CpG islands in the promoter regions of the genes. Based on recent indications of a potential relationship between mismatch repair genes and renal cell carcinoma (RCC), we were interested in investigating the existence of promoter hypermethylation of the hMLH1 gene in tumor DNA samples from patients with sporadic RCC. Material and method: Sixty-five tumor tissue specimens were collected consecutively. The DNA was first obtained and purified, then digested with the restriction enzymes Hpa II and Msp I, followed by polimerase chain reaction amplification of 3 promoter regions of the hMLH1 gene, agarose gel electrophoresis, and densitometric analysis of the images of the amplified bands. Results: Mean patient age was 63.7 years. The most frequent cell type was clear cell carcinoma (67.7%). 73.9% of tumors were diagnosed in stages below pT2, 9.3% had gland involvement and 20%, distant metastasis. No somatic hypermethylation was detected in the promoter region of the hMLH1 gene in any of the patients studied. Conclusions: Our data indicate that promoter hypermethylation of the hMLH1 gene is not implicated in the pathogenesis of sporadic RCC, and therefore the existence of another type of mutation, microsatellite instability and/or loss of heterozygosity should be examined to determine the possible role of this gene in sporadic RCC." ] "es" => array:1 [ "resumen" => "Fundamento y objetivo: La metilación de los islotes CpG (secuencias del genoma ricas en guanina y citosina) presentes en las regiones promotoras constituye la forma de inactivación epigenética más común y es una alteración en el mecanismo de regulación de los genes que no requiere cambios en la secuencia del ADN. Se ha descrito hipermetilación del promotor del gen hMLH1 en algunas líneas celulares procedentes de carcinoma de células renales (CCR). Nuestro objetivo ha sido determinar la existencia de hipermetilación en el promotor del gen hMLH1 en muestras de ADN tumoral de pacientes con CCR esporádico. Material y método: Se recogieron consecutivamente 65 muestras de tejido tumoral procedente de pacientes diagnosticados de CCR. Tras la obtención y purificación del ADN se procedió a su digestión con las enzimas de restricción HpaII y MspI, seguido de amplificación mediante reacción en cadena de la polimerasa de 3 regiones del promotor del gen hMLH1, electroforesis en gel de agarosa y análisis densitométrico de las bandas amplificadas. Resultados: La edad media de los pacientes fue de 63,7 años. El tipo celular más frecuente fue el carcinoma de células claras (67,7%). Un 73,9% de los tumores se diagnosticaron en estadios inferiores a pT2, un 9,3% tenían afectación ganglionar y un 20%, metástasis a distancia. No se detectó hipermetilación somática en la región promotora del gen hMLH1 en ninguno de los pacientes estudiados. Conclusiones: La hipermetilación del promotor del gen hMLH1 no parece intervenir en la patogenia del CCR esporádico, y es necesario analizar la existencia de otro tipo de mutaciones, inestabilidad de microsatélites y/o pérdida de heterocigosis para determinar el posible papel de este gen en la patogenia del CCR esporádico." ] ] "multimedia" => array:6 [ 0 => array:8 [ "identificador" => "tbl1" "etiqueta" => "Fig. 1" "tipo" => "MULTIMEDIATABLA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "copyright" => "Elsevier España" "tabla" => array:1 [ "tablatextoimagen" => array:1 [ 0 => array:1 [ "tablaImagen" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagenFichero" => "2v126n12-13086325tab01.gif" "imagenAlto" => 171 "imagenAncho" => 766 "imagenTamanyo" => 29895 ] ] ] ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "Localización de los 4 sitios de metilación estudiados en el promotor del gen hMLH1. 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