El estrés oxidativo ocurre cuando hay un desequilibrio entre la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) y la actividad antioxidante celular. La sobreproducción de ROS causa daño oxidativo en las principales macromoléculas, altera la homeostasis y conlleva la aparición de diferentes patologías. En la actualidad no existe un tratamiento totalmente efectivo para contrarrestar estas enfermedades implicadas con el estrés oxidativo, por lo cual es necesario indagar en nuevas alternativas de tratamientos que supriman las ROS generadas. Una alternativa prometedora es el uso de extractos vegetales, que ha demostrado un potente efecto antioxidante. Las células eficientes para el estudio de enfermedades patológicas relacionadas con las especies reactivas de oxígeno son los linfocitosT, los cuales comparten sistemas con las neuronas, como el sistema dopaminérgico, la señalización de muerte y la supervivencia. Los linfocitos in vitro son un modelo óptimo para la evaluación de mecanismos oxidativos.
ObjetivoDeterminar el efecto protector del extracto etanólico de propóleo frente al daño oxidativo inducido con peróxido de hidrógeno (H2O2) en linfocitos humanos in vitro mediante conteo de linfocitos.
ResultadosEl análisis estadístico con ANOVA demuestra que las concentraciones de 0,0225 y 0,045mg/ml del extracto etanólico de propóleo presentan actividad protectora frente al daño celular provocado por H2O2.
ConclusiónEl presente estudio propone al extracto etanólico de propóleo como un potencial farmacológico, útil para tratamientos contra las patologías autoinmunes.
Oxidative stress occurs when there is an imbalance between the production of reactive oxygen species (ROS) and cellular antioxidant activity. Overproduction of ROS causes oxidative damage to major macromolecules, alters homeostasis and leads to the generation of different pathologies. At present, there is no totally effective treatment to counteract these diseases involved with oxidative stress, so it is necessary to investigate new treatment alternatives that suppress the ROS generated. One promising alternative is the use of plant extracts, which have demonstrated a potent antioxidant effect. Efficient cells for the study of pathological diseases related to reactive oxygen species are Tlymphocytes, which share systems with neurons such as: the dopaminergic system, death signaling and survival. In vitro lymphocytes are an optimal model for the evaluation of oxidative mechanisms.
ObjectiveTo determine the protective effect of ethanolic extract of propolis against oxidative damage induced by hydrogen peroxide (H2O2) in human lymphocytes in vitro, by means of the cell viability test with trypan blue.
ResultsAnova test shows that the concentrations of 0.0225 and 0.045mg/mL of ethanolic extract of propolis, present protective activity against cell damage caused by H2O2.
ConclusionThis study proposes the ethanolic extract of propolis as a potential pharmacological, useful for treatments against autoimmune disorders.
El estrés oxidativo es el mecanismo subyacente que se presenta cuando hay desequilibrio en la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS), y este proceso conduce a la disfunción celular y finalmente a la muerte1. Las ROS corresponden principalmente al radical hidroxilo (OH–) y al peróxido de hidrógeno (H2O2)2. Algunas de las principales especies reactivas de oxígeno, como el radical superóxido (O2–) y el peróxido de hidrógeno, son subproductos del metabolismo y se forman a partir de fuentes endógenas y exógenas2. La sobreproducción de estas moléculas conlleva la alteración de la homeostasis y daño oxidativo al ADN, los lípidos, los hidratos de carbono y las proteínas2; por tanto, la acumulación de ROS desempeña un papel importante en la mediación de muerte celular programada por apoptosis y compromete la viabilidad celular1. En este sentido, el estrés oxidativo generado por ROS se ha estudiado en varios procesos patológicos, como enfermedades autoinmunes, cáncer, envejecimiento y diabetes mellitus3, debido a que se considera que es un modulador clave en el desarrollo inicial de las enfermedades autoinmunes4,5.
Hoy en día, los modelos basados en células han demostrado ser una herramienta útil para alcanzar resultados sobre mecanismos subyacentes a las enfermedades autoinmunes6, al ser ensayos más económicos y accesibles que modelos in vivo4; por ejemplo, para la evaluación del estrés oxidativo en el cultivo celular se puede emplear peróxido de hidrógeno, que estimula la liberación excesiva de especies reactivas de oxígeno y apoptosis6. Así, este modelo simula el daño oxidativo que ocurre en las patologías autoinmunes4, lo que permite estudiar las moléculas con capacidad antioxidante y antiapoptótica7. Los extractos vegetales son una alternativa para el tratamiento del estrés oxidativo celular en patologías autoinmunes, gracias a la presencia de compuestos que presentan propiedades antioxidantes, citoprotectoras y antiinflamatorias8. El extracto etanólico de propóleo, en particular, ha demostrado actividad antioxidante, por la alta concentración de polifenoles9. A partir de lo anterior, este trabajo busca determinar el efecto protector del extracto etanólico de propóleo frente al daño oxidativo inducido con peróxido de hidrógeno (H2O2) en células mononucleares de sangre periférica cultivadas in vitro, mediante el conteo celular con azul tripán.
Materiales y métodosPreparación del extracto etanólico de propóleoLas muestras de propóleo provienen de Restrepo, Valle del Cauca. Se recolectaron en enero de 2022. El propóleo fue extraído con etanol al 95%. El extracto etanólico de propóleo (EPP) estuvo en baño maría por 24h.
Aislamiento de linfocitos T de sangre periféricaLos linfocitos humanos de sangre periférica fueron colectados cumpliendo los siguientes criterios de inclusión: donante voluntaria, mujer sana, no gestantes, de 20-25 años, sin antecedentes de enfermedades autoinmunes ni consumo de sustancias psicoactivas o antibióticos reciente. A partir de la sangre extraída por venopunción, se realizó el aislamiento de linfocitos humanos, utilizando un gradiente de gravedad con Ficoll-Paque (Cytiva 17-1440-02). El pellet se diluyó en medio RPMI 1640 (R-8758 Sigma-Aldrich), que contiene un 10% de suero fetal bovino (16000036 Gibco), un 1% de gentamicina y un 1% de L-glutamina. Se mezclaron 50μl de la suspensión celular (pellet con medio completo) con 50μl de azul tripán al 0,1%. Se realizó el conteo celular en la cámara de Neubauer. Se sembraron 5×106 células por mililitro, en cada de 2ml (GIBCO LC1010).
Citotoxicidad de las concentraciones del extracto etanólico de propóleoPara determinar la citotoxicidad de las concentraciones del extracto etanólico de propóleo (EEP) en los linfocitos, las células fueron tratadas con 0,35, 0,175, 0,09, 0,045, 0,0225, 0,010 y 0,005mg/ml de propóleo, utilizando como control positivo agua y como control negativo H2O2. Una vez determinadas las dosis no citotóxicas, se seleccionaron las dosis 0,045 y 0,0225mg/ml de tripán para evaluar la capacidad protectora del EEP frente al estrés oxidativo causado por el peróxido de hidrógeno (H2O2) en los linfocitos in vitro.
Capacidad protectora del EEP contra el estrés oxidativo causado por peróxido de hidrógeno (H2O2) en los linfocitos in vitroPara cada cultivo de 5×106 células por mililitro (2 de ml volumen final) se evaluaron dos tratamientos: en el primero, las células fueron tratadas con 0,045mg/ml del extracto y 0,0225mg/ml etanólico de propóleo, tras lo cual fueron incubadas durante 30min. Transcurrido este tiempo se adicionaron 15μl de peróxido de hidrógeno a 1μM, usando como control positivo agua y como control negativo H2O2. En el segundo tratamiento, las células se trataron con 0,045mg/ml del extracto y 0,0225mg/ml etanólico de propóleo, y se incubaron durante 60min; igualmente, transcurrido este tiempo se adicionaron 15μl de peróxido de hidrógeno a 1μM.
Análisis estadísticoLos resultados se evaluaron mediante análisis de varianza (ANOVA unifactorial), a fin de determinar la citotoxicidad en las concentraciones del extracto etanólico de propóleo, y prueba de varianza (multifactorial) para calcular si existe relación entre las concentraciones y el tiempo de tratamiento. Los valores de p<0,05 se consideran significativamente diferentes. Con posterioridad, se aplicó la prueba de comparación múltiple de Tukey (p<0,05).
ResultadosCitotoxicidad de las concentraciones del extracto etanólico de propóleoSe evalúa la citotoxicidad de siete concentraciones de EEP (0,35, 0,175, 0,09, 0,045, 0,0225, 0,010 y 0,005mg/ml) mediante conteo celular con el azul de tripán. Los resultados para las siete concentraciones con el análisis de varianza indicaron que no se presentó ningún efecto citotóxico entre las concentraciones evaluadas, como se muestra en la figura 1. Se seleccionaron las concentraciones de 0,045 y 0,0225mg/ml, las cuales presentaban un mayor número de células.
Las concentraciones de 0,045 y 0,0225mg/ml en los linfocitos in vitro se evaluaron en dos tiempos: a 60min y a 90min. Los resultados de la concentración de 0,045mg/ml del EEP indicaron que a los 60min no hubo diferencia en el número de células vivas entre el tratamiento y los controles negativo (H2O) y positivo (H2O2). Los resultados del análisis estadístico, así como los datos descriptivos, evidencian que el número de células es significativamente mayor en los cultivos tratados con el extracto etanólico de propóleo a los 90min que en los cultivos no tratados (fig. 2).
Con respecto al tratamiento con 0,0225mg/ml en los linfocitos in vitro, los resultados muestran que para los dos tiempos hubo diferencia significativa entre el tratamiento y el control positivo (H2O2). En la figura 3 se observan los resultados del análisis post hoc; se determinó que el número de células es significativamente mayor en los cultivos tratados con el extracto de propóleo a 0,025mg/ml a los 90min y a los 60min.
Discusión
En este estudio se determinó el efecto protector del extracto etanólico de propóleo (EEP) en los linfocitos de sangre periférica inducidos a estrés oxidativo con peróxido de hidrógeno (H2O2). Es un estudio novedoso, debido a que la actividad del propóleo es específica para cada muestra; depende directamente de la ubicación geográfica, de las condiciones climáticas y de la especie vegetal10. Este es el primer estudio sobre la capacidad protectora del propóleo del municipio de Restrepo, Valle del Cauca. Los resultados de análisis de varianza indicaron que ninguna de las siete concentraciones evaluadas del EEP es citotóxica para los linfocitos y que las concentraciones de 0,045 y 0,0225mg/ml presentan un efecto protector contra el daño oxidativo inducido por H2O2. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Woźniak11, en los cuales los extractos de propóleo a concentración de 0,05mg/ml protegían significativamente a las células del daño oxidativo. A su vez, El-Guendouz et al.12 evaluaron los componentes (fenoles y flavonoides) y las actividades antioxidantes de 24 muestras de propóleo de diferentes regiones de Marruecos, y como resultado demostraron una fuerte correlación entre los componentes y la actividad antioxidante del extracto etanólico de propóleo para eliminar radicales libres.
Un estudio realizado por Nascimento et al.13 evaluó la actividad antioxidante del propóleo Rojo Alagoas, y evidenció que la actividad antioxidante fue del 80% con respecto al secuestro de peróxido de hidrógeno. Mohammedi14, por su parte, determinó que la capacidad del propóleo para inhibir la producción de peróxido de hidrógeno es el resultado de los altos niveles de fenoles presentes en los propóleos. En nuestro estudio encontramos que los linfocitos humanos tratados durante 60 minutos con las concentraciones de 0,0225mg/ml y 0,045mg/ml del extracto etanólico de propóleo original de Restrepo, Valle del Cauca, muestran una capacidad para proteger a los linfocitos in vitro del estrés oxidativo inducido por peróxido de hidrógeno (H2O2), evidenciando un mayor número de células frente a las células que no fueron tratadas (fig. 4). A partir de lo anterior, podemos sugerir que el extracto etanólico de propóleo es una alternativa potencial en la búsqueda de tratamientos terapéuticos contra enfermedades autoinmunes, por su capacidad de aumentar la supervivencia en células sometidas a estrés oxidativo.
Consideraciones éticas
La ejecución del estudio se realizó de conformidad con las pautas éticas internacionales y fue avalado por el comité de ética de la Universidad Libre, Seccional Cali, asegurando la protección de los derechos y el bienestar de los participantes. A los individuos que proporcionaron muestras sanguíneas se les solicitó que otorgaran su consentimiento mediante un documento de información detallada, con participación completamente voluntaria, y la información fue manejada de manera confidencial. Todos los datos mostrados en las figuras y las tablas incluidas en el manuscrito son propiedad de los autores.
FinanciaciónEste trabajo no ha recibido ningún tipo de financiación.
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
