En 1893, el patológo alemán Schmorl4 describió por primera vez la presencia de células trofoblásticas en los pulmones y en la circulación sanguínea de gestantes muertas por eclampsia, hallazgo que no fue confirmado hasta 1959 por Douglas et al5. El aislamiento de trofoblastos en sangre periférica materna se publicó 25 años después6. Estas células alcanzan la circulación materna en las primeras semanas de gestación, desaparecen entre las semanas 10 y 12, y presentan una morfología multinuclear característica que facilita su identificación pero dificulta el análisis del material genético por hibridación in situ fluorescente (FISH). Por otra parte, dado su origen placentario, no reflejan el cariotipo real del feto en el 1% de los casos en que existe un mosaicismo7, a lo que se añade la dificultad para desarrollar anticuerpos monoclonales específicos para estas células8.

En 1969, Walknowska et al9 aislaron linfocitos fetales en sangre de mujeres portadoras de fetos varones, primera evidencia de la presencia de estas células fetales en sangre periférica materna. En los años setenta del siglo pasado, se confirmó este hallazgo, pero la detección de cromatina Y en gestantes portadoras de fetos femeninos originó la falta de consenso sobre la utilidad de los métodos citogenéticos para este fin. La citometría de flujo permitió aislar linfocitos fetales en sangre materna basándose en las diferencias existentes entre antígenos leucocitarios humanos (HLA) de la madre y el feto10, sin alcanzar el 100% de sensibilidad y especificidad. Se postuló que la pérdida de especificidad podía deberse al aislamiento de células fetales de un embarazo anterior o de un aborto espontáneo. En 1996, Bianchi et al11 observaron linfocitos fetales de varón en sangre materna varios años después del parto, lo que representa un gran inconveniente para la utilización de este tipo celular como base para el diagnóstico prenatal. Otra limitación importante es la necesidad de disponer de anticuerpos anti-HLA específicos para cada individuo, lo que requiere no sólo el estudio del HLA paterno sino también que haya diferencias en el HLA de la pareja.

En 1990, Bianchi et al12 aislaron eritroblastos fetales en sangre materna mediante anticuerpos monoclonales que reconocían el receptor de la transferrina (CD71). A partir de este momento, muchos grupos de trabajo se centraron en el estudio de estas células como fuente de tejido fetal.

El eritroblasto posee características que lo convierten en el candidato ideal para el diagnóstico prenatal no invasivo. En primer lugar, su identificación morfológica es sencilla y, al ser una célula nucleada, contiene toda la información genética del feto. Por otra parte, su corta vida media (25–35 días) y su limitada capacidad proliferativa hacen poco probable el aislamiento de eritroblastos fetales de embarazos previos. Además, posee diversos marcadores celulares que facilitan su aislamiento e identificación. Por último, los eritroblastos forman una fracción importante de las células de la serie roja en la sangre fetal, con un valor máximo a las 8 semanas13, aunque son poco abundantes en la sangre periférica adulta.

El paso de eritroblastos fetales a la circulación materna se produce a partir de la sexta semana de gestación. Una cuestión muy debatida ha sido la edad gestacional óptima para su aislamiento. Se ha descrito un aumento del número de eritroblastos fetales en el segundo trimestre de gestación14, así como su porcentaje al pasar del segundo al tercer trimestre de gestación15. Otros autores, en cambio, han observado un descenso16. Recientemente, Hyoda et al17 han descrito la presencia de eritroblastos fetales en sangre materna hasta el momento del parto, así como su rápida desaparición después del nacimiento. La apoptosis sería la principal causa de la eliminación de las células fetales tras el parto; su persistencia en la sangre materna, una vez concluido el embarazo, se ha atribuido a progenitores resistentes a la apoptosis o a una regulación deficiente de ésta18.

Otro punto controvertido es el porcentaje de eritroblastos fetales en sangre materna. Aunque normalmente no se detectan eritroblastos en sangre periférica de adultos sanos, su presencia durante el embarazo es un hecho constatado. Se ha descrito que entre un 74y un 85% de los eritroblastos aislados en sangre materna son de origen fetal19,20. Sin embargo, la disparidad de resultados entre los diferentes estudios es llamativa, la mayoría de los cuales describen porcentajes mucho más bajos, de un 5021, un 20%22 o incluso inferiores al 5%23,24. No hay, pues, consenso sobre la proporción de eritroblastos fetales en sangre materna, aunque algunos autores estiman que es del orden de 1célula/ml de sangre materna25.

En condiciones normales, la placenta establece una barrera fetomaterna, de forma que se transfiere un número reducido de células fetales a la circulación materna. La baja proporción de eritroblastos fetales en sangre materna hace necesarios métodos de enriquecimiento y purificación como etapas previas al análisis genético.

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  Enriquecimiento celular. El método más utilizado es la centrifugación en gradiente de densidad discontinuo26, ya sea simple (1077g/l27 o 1119g/l28), doble (1077/1119g/l29) o triple30. Proporciona un buen rendimiento pero una pureza baja, ya que se aísla un elevado número de células mononucleadas de la serie blanca. Además, la distribución de los eritroblastos en el gradiente de densidad está afectada por el tiempo transcurrido entre la recogida de la muestra y su procesamiento31.

  Otra opción es la lisis selectiva de las células de la serie roja con cloruro de amonio32. Los eritroblastos fetales son menos susceptibles a la lisis que los eritrocitos adultos, lo que permite eliminar un gran número de células maternas contaminantes. No obstante, durante la lisis celular los eritroblastos fetales presentan alteraciones de membrana que dificultan su posterior análisis33.

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  Purificación celular. Para la purificación de eritroblastos se han utilizado técnicas, como la separación celular mediante citometría de flujo (FACS)10,12, la separación celular activada magnéticamente (MACS)23,34, la micromanipulación de células individuales35, la separación por flujo de carga (CFS)36, el aislamiento con partículas inmunomagnéticas37, la suspensión líquida de micropartículas de hierro con separación magnética38 o la separación en columnas con avidina39.

Los métodos más utilizados (FACS y MACS) se basan en las diferencias antigénicas entre las células de interés y las células contaminantes. Hasta el momento no se han descubierto antígenos de superficie específicos de eritroblastos fetales, por lo que el uso de anticuerpos anti-CD71 (comerciales40 o no comerciales31,41,42) ha sido la alternativa más frecuente.

Para aumentar la especificidad del método, se propuso la combinación con otros anticuerpos, como la glicoforina A (GPA), una sialoproteína que se expresa en todas las células de la serie roja. Sin embargo, el anticuerpo anti-GPA produce aglutinación de los eritrocitos, dificultando el análisis de los eritroblastos aislados43.

Otros anticuerpos utilizados son el anti-CD36, que reconoce el receptor de la trombospondina25, o los anti-CD45 y anti-CD32, que permiten el marcaje de las células contaminantes para su posterior eliminación29,37.

Por otra parte, se ha propuesto el marcaje de la cadena gamma de la hemoglobina fetal o la cadena épsilon de la hemoglobina embrionaria44. Sin embargo, durante el embarazo se estimula la síntesis de una pequeña cantidad de hemoglobina fetal en las células maternas, reduciendo la especificidad del método y limitando su aplicación. De Graaf et al32 describieron el origen materno del 20% de los eritroblastos que expresan hemoglobina fetal. La hemoglobina embrionaria sólo se expresa en los eritroblastos fetales pero no se detecta a partir de la semana 14 de gestación45.

Por último, se ha descrito la utilización de una lectina que se une específicamente a los residuos de galactosa presentes en la superficie celular del eritroblasto46.

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  Análisis genético. Los métodos más utilizados para determinar el origen fetal de los eritroblastos aislados han sido la FISH y la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

Dada su sensibilidad y su especificidad elevadas, la PCR permite detectar secuencias específicas del cromosoma Y47, y demostrar así el origen fetal de la célula si el feto es varón. El análisis genético por PCR puede aplicarse a células individuales seleccionadas mediante microdisección48. Esta estrategia es eficaz pero requiere experiencia del operador, es laboriosa y conlleva pérdidas celulares hasta de un 18%.

La FISH con sondas específicas para los cromosomas X, Y, 21, 13 y 18 permite determinar el origen fetal de los eritroblastos aislados (en caso de feto varón) e identificar las aneuploidías más frecuentes49,50. Krabchi et al51. describieron la identificación y la cuantificación de células fetales en sangre materna de gestantes portadoras de un feto con síndrome de Down, mediante marcaje in situ cebado (primed in situ labelling [PRINS]), técnica que utiliza un oligonucleótido cebador que se fija al ADN cromosómico.

El cultivo selectivo de células precursoras eritroides en sangre materna podría incrementar el número de células fetales disponibles52 y permitir el análisis de las células en metafase para la detección de anomalías cromosómicas53. Sin embargo, estos resultados no fueron reproducidos por otros investigadores54,55.

En los últimos años, se han descrito métodos para el reconocimiento de los eritroblastos fetales basados en su morfología característica (núcleo compacto, condensación asimétrica de la cromatina y patrón de tinción característico con la cadena gamma de la hemoglobina fetal)56. La automatización de este método (análisis microscópico y tratamiento de imágenes) permitiría el análisis de un gran número de células, y facilitar la identificación de los eritroblastos fetales en sangre materna sin necesidad de enriquecimiento celular.

El aislamiento de eritroblastos fetales en sangre materna ha demostrado potencial utilidad para la detección de aneuploidías20,49,57,58, el estudio del estado RhD fetal59, el diagnóstico de enfermedades genéticas mendelianas como la distrofia muscular de Duchenne60, el diagnóstico de hemoglobinopatías61 o la detección de complicaciones obstétricas62,63.

En 1997, Bianchi et al47 demostraron que el número de eritroblastos en sangre materna es superior en gestantes con fetos con síndrome de Down. Falcidia et al64 describieron un recuento de eritroblastos 6 veces superior en gestantes con fetos con trisomía 21. Este fenómeno no se observa en otras anomalías cromosómicas, como las trisomías 13 y 18. En Estados Unidos, el estudio NIFTY (National Institutes of Health Fetal Cell Study) valoró la eficacia del aislamiento de células fetales en sangre materna, y describió una sensibilidad del 41% para la detección del sexo fetal y del 74%, para el diagnóstico de aneuploidías fetales65. Este estudio evidenció que el sistema MACS proporciona mejor recuperación y mayor detección de células fetales que FACS.

El número de eritroblastos también aumenta en sangre materna en casos de crecimiento intrauterino retardado o polihidramnios. Este aumento podría estar asociado a alteraciones estructurales de la placenta66,67.

La hipertensión gestacional es una de las complicaciones obstétricas más frecuentes. Aproximadamente, el 20% de las pacientes con hipertensión gestacional presentan criterios de preeclampsia, una de las principales causas de morbimortalidad materna y fetal. En 1994, Ganshirt et al68 describieron un aumento del número de eritroblastos en 43 gestantes con preeclampsia respecto a un grupo control formado por 222 embarazadas sin complicaciones obstétricas. Este hallazgo se confirmó en gestantes portadoras de fetos varones, lo que afirma que una gran proporción de los eritroblastos aislados eran de origen fetal69. Aunque se desconoce la etiología de la enfermedad, parece que los mecanismos responsables de la patogenia se producen en una fase temprana del embarazo, probablemente durante la implantación70,71, y se ha descrito un aumento del número de eritroblastos en gestantes con un Doppler uterino alterado, a partir de la semana 20 de gestación, e incluso antes de que la enfermedad se manifieste clínicamente72. Álvarez et al73 observaron un aumento del número de eritroblastos en gestantes que posteriormente desarrollaron preeclampsia, si bien los eritroblastos aislados eran mayoritariamente de origen materno y no fetal.

Las investigaciones llevadas a cabo hasta ahora manifiestan la escasez de células fetales en sangre materna, por lo que se requieren métodos de enriquecimiento laboriosos, y la ausencia de marcadores específicos para su identificación. Actualmente, no se dispone, en la práctica clínica, de un método de cribado o de diagnóstico prenatal no invasivo basado en el aislamiento de eritroblastos fetales en sangre materna.

En 1997, Lo et al3 demostraron la presencia de ADN fetal en la circulación materna mediante la detección de secuencias del cromosoma Y en plasma materno. La PCR a tiempo real permitió la cuantificación de secuencias de ADN fetal con una sensibilidad y una especificidad próximas al 100%, y reveló que la concentración de ADN en plasma materno es mucho más alta de lo que cabría esperar si todo el ADN fetal detectado procediese de la fracción celular fetal existente en la circulación materna.

Se ha detectado ADN fetal en plasma materno a partir de la quinta semana de gestación74. La concentración de ADN total parece aumentar significativamente durante el embarazo75,76, aproximadamente un 29,3% en cada semana de gestación77, pero el ADN fetal supone tan sólo un 5–7% del total78. Tras el parto, el ADN fetal desaparece de la circulación materna en cuestión de minutos79. Botezatu et al75 proponen como posible mecanismo el aclaramiento renal del ADN fetal, dado que se ha detectado en orina de mujeres embarazadas portadoras de un feto varón.

Actualmente, se conoce poco sobre las características biológicas y moleculares del ADN fetal presente en la circulación materna. Un descubrimiento interesante es que el tamaño del ADN fetal es más pequeño que el materno, lo que podría utilizarse como un posible método de enriquecimiento del ADN fetal77.

La degradación de las células fetales intactas presentes en la circulación materna es uno de los posibles mecanismos de liberación de ADN fetal a la circulación materna. Un elevado número de células fetales presentan apoptosis, por interacción con el sistema inmunitario materno80, lo que explicaría el aumento del número de eritroblastos y de la cantidad de ADN fetal en gestantes con preeclampsia o con fetos con aneuploidías. Sin embargo, dado el bajo porcentaje de eritroblastos fetales en sangre materna, estas células difícilmente pueden ser el único origen del ADN fetal en plasma materno. La correlación entre la concentración de ADN fetal en plasma materno tanto con la edad gestacional como con la concentración de hormona gonadotropina coriónica humana (hCG), así como la detección de secuencias de ADN fetal días después de la implantación y la elevación de las concentraciones de dicho ADN fetal en gestantes con preeclampsia, sugieren un origen placentario del ADN fetal en plasma materno, probablemente también por apoptosis de la células trofoblásticas. Por otra parte, la detección de secuencias de ADN fetal en otros fluidos como el líquido amniótico81, la orina materna y líquidos cefalorraquídeo y peritoneal maternos82,83 ha llevado a considerar la posibilidad de una transferencia directa de ADN. Es muy probable que los 3 mecanismos coexistan y que la placenta aporte la mayor parte del ADN fetal libre en plasma.

Hay diferencias importantes entre los métodos descritos para el análisis del ADN en plasma materno lo que explica la falta de homogeneidad en los resultados publicados. En 2004, se describió un protocolo para la comparación de la detección de ADN fetal entre diferentes laboratorios84. Las sensibilidades variaban entre el 31,4 y el 97,1% para la detección de secuencias de ADN del gen SRY con especificidades del 92,8–100%. En dicho estudio se consideraron parámetros críticos para la calidad de los resultados el retraso en el procesamiento de las muestras y la eficacia del proceso de extracción de ADN. El tratamiento inadecuado de las muestras puede conducir a la lisis de células residuales de origen materno en el plasma, que interfieren en la cuantificación de las secuencias de ADN fetal.

En general, las aplicaciones clínicas de la detección de ADN fetal en el plasma materno se basan en la cuantificación de secuencias de ADN fetal o en la detección de secuencias exclusivas del feto. Muchas de las complicaciones del embarazo se asocian a un aumento de la cantidad de ADN fetal en la circulación materna. La principal limitación es la necesidad de marcadores fetales independientes del sexo, como polimorfismos de ADN85, marcadores epigenéticos fetales86 o ARNm de genes expresados en la placenta87. Sin embargo, la determinación no invasiva de enfermedades mendelianas, como la talasemia o la fibrosis quística, parece cada vez más cercana88.

La primera aplicación del análisis de ADN fetal en plasma materno fue la detección del sexo fetal, de utilidad para el diagnóstico de enfermedades ligadas al cromosoma X3,89,90. La detección de secuencias específicas del cromosoma Y se ha utilizado también para estudiar la posible relación entre la concentración de ADN fetal y la presencia de complicaciones asociadas al embarazo o de trisomías fetales. Se ha descrito un aumento de la concentración de ADN fetal en plasma materno en casos de trisomía 2191, hiperemesis gravídica92, placenta invasiva93 o preeclampsia94, donde el aumento de la concentración de ADN fetal parece producirse incluso antes de la manifestación clínica de la enfermedad y se correlaciona con la gravedad95. La determinación del sexo fetal en las primeras semanas de gestación también es útil en los embarazos con riesgo de hiperplasia adrenal congénita96, puesto que permite iniciar una terapia con dexametasona que evita la virilización de los genitales externos femeninos.

El marcador más utilizado para la cuantificación de ADN de varón en plasma materno ha sido el gen SRY. En el primer trimestre de gestación, la concentración de ADN fetal en sangre materna es cercana al límite de detección de la técnica, por lo que se pueden observar falsos negativos. Sin embargo, la amplificación de secuencia multicopia del gen DYS14 ha permitido obtener límites de detección 10 veces inferiores a los descritos con secuencias del gen SRY97.

La cuantificación de ADN fetal en plasma materno se ha propuesto como método de diagnóstico prenatal en los casos de aneuploidía. No obstante, el ADN fetal representa menos del 10% del ADN circulante en plasma materno, lo que dificulta la detección de loci fetales o polimorfismos. Recientemente, se han desarrollado métodos para la detección de aneuploidías basados en la variación alélica entre la madre y el feto. Estos métodos determinan la dosis cromosómica fetal mediante el análisis de ratios alélicas de variantes genéticas, si el feto es heterocigoto para el locus detectado98. La primera demostración empleando marcadores de metilación de ADN utilizó las secuencias hipometiladas de SERPINB5, localizadas en el cromosoma 18, como dianas específicas del feto99. La determinación de la ratio alélica de un polimorfismo de un único nucleótido (SNP) en el promotor hipometilado de SERPINB5 en fetos heterozigotos se conoce como ratio alélica epigenética. Con el reconocimiento de marcadores de metilación de ADN en el cromosoma 21100, esta alternativa podría aplicarse para la detección prenatal no invasiva de la trisomía 21. Dhallan et al101 han utilizado alelos específicos fetales para la detección de esta trisomía. Sin embargo, estos métodos sólo se pueden aplicar a ciertas poblaciones, ya que dependen de la presencia de poliformismos genéticos en loci específicos. Algunos investigadores proponen la utilización de métodos universales que permitan la cuantificación digital de ADN fetal.102,103 Fan et al104 han desarrollado un método para la cuantificación digital de ADN basado en una secuenciación y mapeo del cromosoma de origen y en la enumeración de los fragmentos por cromosoma, para el diagnóstico de las trisomías 21, 13 y 18.

Otras aplicaciones de la detección de ADN fetal en la circulación materna son la determinación del estado RhD fetal105, el diagnóstico de la acondroplasia106, la distrofia miotónica107, la betatalasemia108 o la enfermedad de Huntington109. De todas ellas, la más extendida en la actualidad es el diagnóstico no invasivo del RhD fetal en gestantes con riesgo de enfermedad hemolítica del recién nacido. Esto permite seleccionar embarazos que requieren una monitorización más exhaustiva, además de racionalizar la administración de la terapia anti-D, lo que requiere que el diagnóstico se realice precozmente110. Estudios recientes han obtenido una sensibilidad del 99%, con una especificidad del 99,9% para la detección de fetos D-positivos en la semana 28 de gestación, lo que significa que el diagnóstico del Rh fetal a gran escala ya es viable111,112.

En el año 2000 se demostró la presencia de ARN fetal en plasma materno en gestantes con un feto varón113. Este hecho supuso el punto de partida para la detección de ácidos nucleicos en plasma materno con independencia del sexo fetal y de la existencia de polimorfismos genéticos. En la búsqueda de un marcador fetal independiente del sexo, Ng et al114 desarrollaron un método para la cuantificación de ARN en plasma que pone en evidencia la inesperada estabilidad del ARN circulante y demuestra que la placenta es una fuente importante del ARN fetal presente en la circulación materna. La detección de secuencias de ARNm específicas de la placenta supone una alternativa a la cuantificación de ADN fetal para el diagnóstico de aneuploidías. Este método presenta la ventaja de que estas secuencias no se expresan en los tejidos maternos, por lo que son específicas del feto. Lo et al115 han desarrollado un método para la detección de secuencias de ARNm del gen PLAC4, localizado en el cromosoma 21 para la detección de esta aneuploidía.