La enfermedad celiaca (EC) es una intolerancia permanente a los componentes del gluten que causa una enteropatía crónica en individuos genéticamente predispuestos1. En la patogénesis de la enfermedad intervienen factores ambientales (gluten) y genéticos (HLA-DQ2 y HLA-DQ8) y está mediada por mecanismos inmunológicos (respuesta linfocitaria T intestinal)2. Es una enfermedad muy prevalente, con frecuencia asintomática, por lo que aún hoy existen muchos casos sin diagnosticar y otros muchos que se diagnostican en edades muy avanzadas.

Según los criterios modificados de la ESPGHAN3, para la confirmación del diagnóstico de la EC se requiere, al menos, una biopsia intestinal en la que se demuestre la presencia de la lesión histológica característica de EC. Esta varía desde una lesión infiltrativa con incremento de los linfocitos intraepiteliales (LIE) hasta la atrofia vellositaria total con hiperplasia criptal, aumentando gradualmente según la severidad de la afectación4. Algunos autores5,6 proponen que la presencia de cambios histológicos leves, sin atrofia, pueden considerarse como las etapas tempranas de la EC, y el incremento en el número de LIE, por tanto, un hallazgo histopatológico característico de la EC4. Diversos estudios han demostrado el aumento de LIE en pacientes celiacos por métodos histológicos7-9. Mediante estudios inmunohistoquímicos se describió el predominio de linfocitos T con receptor TCRγδ10-17.

Los estudios acerca de la población de LIE en pacientes con EC, por lo general, se han realizado en un número relativamente pequeño de pacientes, casi siempre en niños, y con métodos inmunohistoquímicos en la mayoría de los casos. La citometría de flujo es una técnica más rápida, sensible, cuantitativa y objetiva que las técnicas histológicas e inmunohistoquímicas; la introducción de marcadores específicos de LIE como la integrina CD103 permite diferenciar esta población de los linfocitos de lámina propia18. En recientes estudios con citometría de flujo, además de demostrar el aumento de la población de LIE con receptor TCRγδ10, se describió una nueva subpoblación de LIE de naturaleza natural killer (LIE NK-like con fenotipo CD45+CD3-CD7+)19 que disminuye drásticamente en los pacientes con EC activa20–22.

Nos planteamos como objetivo evaluar la utilidad diagnóstica del estudio de los LIE en la EC infantil y del adulto. Para ello, se cuantificó la población de LIE y las subpoblaciones de estos (LIE TCR(δ y LIE NK-like) por citometría de flujo en una serie amplia de pacientes con criterios diagnósticos de EC y en grupos control de edades similares. Se establecieron unos puntos de corte para cada grupo de edad y se analizó la especificidad, sensibilidad, CR+, CR−, VPP y VPN de cada parámetro aislado y en conjunto.

Las muestras de biopsia del intestino delgado se obtuvieron en los niños mediante cápsula de Watson y en los adultos mediante endoscopia digestiva alta. En el momento de la realización de la biopsia todos los casos permanecían sin restricción dietética. Los resultados del estudio histológico fueron clasificados según los criterios modificados de Marsh4 en 4 tipos: sin lesión intestinal (Marsh 0), lesión infiltrativa con arquitectura normal y aumento de linfocitos en la mucosa (Marsh 1), hiperplasia criptal (Marsh 2) y la atrofia vellositaria de distintos grados (parcial o Marsh 3a, subtotal o Marsh 3b y total o Marsh 3c).

Las muestras de biopsia para el estudio del inmunofenotipaje de LIE se procesan antes de transcurrir dos horas de su extracción (para evitar la desepitelización espontánea) siguiendo, con ligeras modificaciones, el protocolo descrito por Madrigal23. Las muestras se incuban, a temperatura ambiente, durante una hora y con agitación suave en un medio RPMI enriquecido con un 5% de FCS (Fetal calf serum), al que se añade EDTA 1mM y DDT 1mM que provocan la rotura de las uniones intercelulares y la liberación de los LIE y los enterocitos. La suspensión celular resultante se recoge por centrifugación, se lava con suero salino y se incuba 30 minutos a 4°C con un panel de anticuerpos monoclonales conjugados a distintos fluorocromos para marcar los distintos tipos de linfocitos: anti-CD103-FITC, anti-CD45-PerCP-Cy5.5, anti-TCRγδ-PE y anti-CD3-APC, todos ellos de Becton-Dickinson (San José, California, EE. UU.). Se analizan mediante el software CellQuest en un citómetro de flujo modelo Facscalibur, de Becton-Dickinson (San José, California, EE. UU.), con capacidad para detectar cuatro fluorescencias.

Se adquirieron en cada caso el número de eventos totales necesarios para conseguir 6.000 eventos en la ventana de linfocitos realizada el histograma de CD45 frente a SSC (Side Scatter Characteristics). Se selecciona la población de LIE por la coexpresión de CD45 y CD103 y se determina la proporción de estos que coexpresan CD3 y TCRγδ (población LIE TCR(δ) y los negativos para CD3 (población LIE NK-like).

En la tabla 2 se resumen los parámetros estadísticos analizados para los valores de LIE totales, LIE TCRγδ y LIE NK-like en cada grupo en estudio. El porcentaje de LIE totales se calculó respecto al número total de células extraídas del epitelio (mayoritariamente células epiteliales) y el porcentaje de LIE TCRγδ y LIE NK-like se calcularon con respecto a estos LIE.

Linfocitos intraepiteliales totales

En la figura 1 se muestra la densidad de esta población celular en los distintos grupos de estudio. Los pacientes con EC presentan unos valores medios en población infantil y en población adulta significativamente más altos que en el grupo control de edad similar (p<0,0001), como se detalla en la tabla 2. Sin embargo, se observan variaciones individuales en cada grupo con superposición en algunos casos entre pacientes celiacos y el grupo control tanto en niños como en adultos (fig. 1).

Figura 1.

Medianas, rangos e intercuartiles de los porcentajes de los linfocitos intraepiteliales (LIE) totales con respecto al total de células epiteliales en los pacientes con enfermedad celiaca (EC) y los controles no EC tanto en población infantil como adulta.

(0,07MB).

Linfocitos intraepiteliales TCRγδ

Como muestra la figura 2, los valores medios de la densidad de los LIE TCRγδ, que se detallan en la tabla 2, fueron significativamente más elevados en los pacientes celiacos que en los controles en ambas poblaciones de edad (p<0,0001). La media del porcentaje de LIE TCRγδ fue de 11,5% (mediana 11,5%) en el grupo control infantil y de 8,5% (mediana 6,2%) en el grupo control adulto. Como ocurre con los LIE totales, se observa cierto solapamiento entre los grupos de celiacos y sus respectivos grupos control de ambas poblaciones de edad.

Figura 2.

Medianas, rangos e intercuartiles de los porcentajes de los LIE TCRγδ con respecto al porcentaje de LIE totales en los pacientes con enfermedad celiaca (EC) y los controles no celiacos tanto en población infantil como adulta.

(0,07MB).

Linfocitos intraepiteliales NK-like

Como muestra la figura 3, los enfermos celiacos tenían valores medios (4,74±9,25% en niños y 2,08±2,62% en adultos) significativamente menores (p<0,0001) que sus grupos control. La figura 3 muestra la existencia de superposición de la densidad de LIE-NK like entre los enfermos celiacos y sus respectivos grupos control, como sucedía con las otras dos poblaciones de LIE.

Figura 3.

Medianas, rangos e intercuartiles de los porcentajes de los LIE NK-like con respecto al porcentaje de LIE totales en los pacientes con enfermedad celiaca (EC) y los controles no celiacos tanto en población infantil como adulta.

(0,08MB).

La demostración de la lesión de la mucosa intestinal sigue siendo una condición imprescindible («gold standard») en el diagnóstico de la EC3. Sin embargo, la lesión histológica no es totalmente característica de la EC24; por otra parte, la afectación parcheada de la mucosa se ha reconocido como causa de falsos negativos de la histología25. En el presente trabajo se aborda la utilidad del estudio de los linfocitos de la mucosa intestinal por citometría de flujo como herramienta diagnóstica de la EC, estudiando retrospectivamente una serie amplia de casos de pacientes pediátricos y adultos con EC activa. Ya en 1971, Ferguson et al7 mostraron que en la afectación de la mucosa intestinal de la EC se produce un aumento del número de LIE; posteriormente se ha demostrado por distintos métodos, sobre todo inmunohistoquímicos, un aumento de los LIE TCRγδ en los pacientes celiacos10-14, y más recientemente, ha cobrado interés una población de linfocitos de fenotipo NK-like (CD45+, CD3−, CD56+−, CD7+)26, definida por citometría de flujo, presentes, normalmente, en la mucosa intestinal y que disminuye en los pacientes celiacos. Nuestros resultados confirman estos hallazgos empleando la citometría de flujo de cuatro fluorescencias como método de cuantificación, técnica que permite el análisis simultáneo de seis características celulares y el análisis de un número elevado de células, además de rapidez, sensibilidad, objetividad y reproducibilidad de los resultados. Nuestro estudio, además del método, aporta el que se realiza sobre una muestra muy amplia y homogénea de pacientes celiacos activos, que incluye la EC infantil y las formas del adulto. Nuestros resultados demuestran que el linfograma intraepitelial (LIE totales, LIE TCRγδ y LIE NK-like) está alterado de forma muy característica en la enfermedad celiaca activa con un aumento de los LIE totales y LIE TCRγδ y una depleción de la densidad de LIE NK-like, y que esto es así tanto en la EC infantil, como ya demostraron otros autores22, como en una amplia muestra de pacientes adultos con EC, población sobre la que recientemente también se ha publicado un trabajo27.

Se observó solapamiento entre los valores del linfograma entre los grupos control y de pacientes con EC. Los puntos de corte que mejor sensibilidad y especificidad ofrecían a partir de la curva ROC fueron, en la población celiaca infantil, > 14,2%, > 16,5% y<10,1% para los LIE totales, LIE TCRγδ y LIE NK-like, respectivamente. Para los adultos con EC estos puntos de corte fueron: LIE > 14,2%, LIE TCRγδ > 16,1% y LIE NK-like < 4,4%, puntos similares a los obtenidos por Olivencia et al27. Algunos falsos negativos de los LIE totales pueden explicarse por la pérdida de células en el proceso de extracción a causa de problemas preanalíticos (más de dos horas de su extracción). El solapamiento de algunos valores por la presencia de falsos positivos podría estar relacionado con la selección de los grupos control que incluye individuos con sintomatología digestiva. Se sabe que la infiltración de la mucosa intestinal por linfocitos no es un hecho específico de la EC26, sino común a otras alteraciones inflamatorias de la mucosa. Además, la elevación de la proporción de linfocitos T con receptor TCRγδ también se ha descrito en otras patologías distintas como intolerancia a proteínas de la leche y otras alergias alimentarias28,29 y enfermedad de Crohn12; en cambio, la disminución de la población de LIE NK-like solo se ha visto en la EC, hasta el momento27. De los 25 niños no celiacos, 11 tuvieron algún falso positivo para alguno de los parámetros del linfograma; tres de ellos debido a los valores de LIE NK-like (4,6, 9,7 y 10,0%), todos mayores de tres años. Según el estudio de Camarero y colaboradores30, en los niños sanos mayores de tres años la densidad de LIE NK-like es significativamente más baja que los menores de tres años y similar a la de los adultos; si se aplica el mismo punto de corte de los adultos sanos (> 4,4%), estos tres niños tendrían valores de LIE NK-like normales. El tamaño de nuestra muestra control infantil y su distribución por edades no nos permitió realizar este análisis.

En la mayoría de los estudios, el diagnóstico de EC se establece cuando la lesión es de grado Marsh 3 y el EMA es positivo27, mientras que en nuestro estudio se han incluido como EC a los pacientes genéticamente predispuestos que presentaban desde una lesión de grado Marsh 1 con clínica sugestiva y algún marcador serológico positivo (AGA-IgA y/o ATGT-IgA y/o EMA-IgA)5 considerados por otros autores como formas latentes o potenciales o simplemente una sensibilización al gluten9,18.

Los resultados presentados permiten confirmar que la cuantificación de las poblaciones de LIE analizadas definen un linfograma característico de la EC activa. Analizando los tres parámetros en conjunto la especificidad y el VPP son del 100% o cercanos al 100%; ningún niño del grupo control presentó los tres parámetros con valores patológicos y solo dos adultos no celiacos resultaron falsos positivos a todo el linfograma. Estos podrían tratarse de EC latentes o potenciales, pero no se les pudo hacer un seguimiento para comprobar esta hipótesis, hecho este que sería muy interesante confirmar en trabajos futuros. Las alteraciones en el linfograma de los LIE al diagnóstico parecen ser extensivas a otras etapas o formas (DSG, EC latentes o potenciales, dermatitis herpetiforme) de la enfermedad18, en las que los marcadores serológicos y la alteración histológica se normalizan.

Aunque no mostrado en este trabajo, la caracterización fenotípica de los LIE por citometría de flujo permite detectar fenotipos aberrantes asociados a la EC refractaria tipo II31 y diagnosticar precozmente la trasformación a linfoma T asociado a enteropatía (caso no publicado).

En el presente trabajo se han establecido los valores de corte para los tres parámetros analizados del linfograma intraepitelial que permiten diagnosticar con una especificidad y cercana al 100% la EC en el niño y en el adulto. Los valores de CP+ y CP− obtenidos muestran a estos parámetros como muy útiles en el diagnóstico de EC activa infantil y del adulto, destacando el valor de los LIE NK-like como parámetro aislado. Por lo tanto, el análisis de las poblaciones de LIE por medio de la citometría de flujo es una nueva herramienta muy útil en el diagnóstico en la EC. Este análisis complementa al estudio histológico clásico aportándole mayor especificidad; particularmente útil en el diagnóstico diferencial con otras enteropatías que cursan con atrofia vellositaria y en aquellos casos en los que la biopsia es dudosa o falsamente negativa por la afectación parcheada de la mucosa.

Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.