Desarrollo de procedimientos de medida basados en la cromatografía líquida de alta resolución

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Adaptada de Skoog<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0260">22</a>." ] ] ] "textoCompleto" => "IntroducciónLa cromatografía líquida de alta resolución o high-performance liquid chromatography (HPLC) es un principio de medida que permite separar los componentes de una muestra (analitos) en función de su distribución entre dos fases inmiscibles entre sí: una fase estacionaria (un sólido o un líquido adsorbido sobre un soporte sólido) y una fase móvil (un líquido). En este tipo de cromatografía, para que tenga lugar el proceso físico-químico de separación, la muestra es inyectada en el seno de la fase móvil, en la que es soluble, e impulsada a una elevada presión a través de una columna que contiene la fase estacionaria. Una vez separados los diferentes analitos en el sistema cromatográfico (eluatos), y en función de sus propiedades fisico-químicas, estos pueden ser identificados o cuantificados empleando alguno de los múltiples sistemas de detección existentes.Debido a la elevada capacidad para separar, aislar, identificar y cuantificar que presenta la HPLC, los procedimientos de medida basados en esta tecnología (de ahora en adelante, procedimientos cromatográficos) llevan años aplicándose en los centros de investigación, en la industria farmacéutica, en las empresas del diagnóstico in vitro o en los laboratorios clínicos para el desarrollo de nuevos fármacos o para la identificación o la medición de nuevas propiedades biológicas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0155">1,2</a>. En los últimos años, la aplicación de la HPLC en los laboratorios clínicos ha adquirido un papel más relevante debido, principalmente, a la aparición de sistemas de medida que combinan la HPLC con sistemas de detección específicos y con una elevada capacidad de detección como son los espectrómetros de masas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0165">3–6</a>. Pese a ello, en la actualidad, son pocos los laboratorios clínicos españoles que emplean procedimientos cromatográficos debido, principalmente, a la falta de total automatización de los mismos, a la necesidad de personal que previamente haya sido específicamente habilitado para su manejo y a su relativo elevado coste. Adicionalmente, existen un número reducido de empresas que desarrollan procedimientos cromatográficos para el diagnóstico in vitro y con la marca «CE», lo que obliga en muchos casos a los laboratorios clínicos a realizar el desarrollo y la validación de los mismos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0185">7</a>.Objeto y campo de aplicaciónEl objeto de este documento es describir el proceso que deben realizar los laboratorios clínicos para el desarrollo de los procedimientos cromatográficos.El campo de aplicación de este documento abarca los procedimientos cromatográficos que permiten la medición de propiedades biológicas correspondientes a escalas racionales (propiedades «cuantitativas») y que utilicen como principio de medida la HPLC acoplada a cualquier sistema de detección.En este documento son aplicables los términos y definiciones relacionados con la cromatografía recogidos en las diferentes guías internacionales de la Federación Internacional de Química Pura y Aplicada (IUPAC)<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0190">8–11</a>, el Instituto para la Normalización de Laboratorios Clínicos (CLSI)<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0210">12,13</a>, la Agencia Europea del Medicamento (EMA)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0220">14</a> y la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA)<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0225">15</a>.Desarrollo de procedimientos de medida cromatográficosExisten diferentes aspectos que deben considerarse en el desarrollo de un procedimiento cromatográfico que se inicia con la recogida de información sobre el analito a estudiar hasta el proceso final de validación del mismo<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230">16–25</a>. En este apartado se describen las principales etapas necesarias para el desarrollo de un procedimiento cromatográfico.Descripción y recopilación de información relacionada con el analitoEl primer aspecto a considerar es recoger toda la información relacionada con el analito a estudiar, como la estructura química, la masa molar, la polaridad, la solubilidad y la constante de disociación ácida (pKa), entre otros. Esta información es importante para la selección de las condiciones cromatográficas y el tipo de sistema de detección a emplear.El conocimiento de la masa molar del analito es imprescindible cuando se trabaja con la HPLC acoplada a la espectrometría de masas (HPLC-MS) o a la espectrometría de masas en tándem (HPLC-MS/MS), ya que se basan principalmente en la obtención de iones a partir de moléculas en fase gaseosa que son posteriormente separados según su relación masa/carga.Existen diversos recursos en Internet (webs) que permiten conocer las principales propiedades fisico-químicas de un analito. Son un ejemplo:<ul class="elsevierStyleList" id="lis0005"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0005">-La base de datos PubChem del Instituto Nacional de la Salud de los Estados Unidos: <a id="intr0005" class="elsevierStyleInterRef" href="https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/">https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/</a></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0010">-La base de datos ChemSpider de la Real Sociedad de Química: <a id="intr0010" class="elsevierStyleInterRef" href="http://www.chemspider.com/">http://www.chemspider.com/</a></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0015">-Las bases de datos ChEMBL y ChEBI del Instituto Europeo de Bioinformática: <a id="intr0015" class="elsevierStyleInterRef" href="https://www.ebi.ac.uk/chembl/">https://www.ebi.ac.uk/chembl/</a></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0020">-<a id="intr0020" class="elsevierStyleInterRef" href="http://www.ebi.ac.uk/chebi/downloadsForward.do">http://www.ebi.ac.uk/chebi/downloadsForward.do</a></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0025">-La base de datos ZINC de la Universidad de California, San Francisco, Estados Unidos: <a id="intr0025" class="elsevierStyleInterRef" href="http://zinc.docking.org/">http://zinc.docking.org/</a></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0030">-La base de datos de fármacos Drug bank: <a id="intr0030" class="elsevierStyleInterRef" href="http://www.drugbank.ca/">http://www.drugbank.ca/</a></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0035">-La base de datos de fármacos ACToR de la Agencia de Protección Ambiental de Estados Unidos: <a id="intr0035" class="elsevierStyleInterRef" href="http://actor.epa.gov/actor/faces/ACToRHome.jsp">http://actor.epa.gov/actor/faces/ACToRHome.jsp</a></li></ul>Especificación y establecimiento de objetivosAntes de iniciar el desarrollo de un procedimiento cromatográfico, el laboratorio clínico debe decidir el objetivo de las mediciones. Este aspecto es fundamental para escoger el tipo de separación cromatográfica a utilizar, así como para conocer si el procedimiento a desarrollar será más o menos complejo y costoso. Los principales aspectos a considerar son<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230">16–21</a>:<ul class="elsevierStyleList" id="lis0010"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0040">-Decidir si el procedimiento va a ser empleado para la caracterización o cuantificación de uno o varios analitos de una muestra desconocida.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0045">-Establecer si el objetivo principal va a ser la medición de la concentración del analito o solo conocer la presencia del mismo en una muestra determinada («determinación cualitativa»).</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0050">-Determinar el número de analitos a estudiar.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0055">-Decidir si será necesario separar todos los componentes de la muestra.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0060">-Conocer con qué tipo de especímenes se va a trabajar (p. ej.: plasma, orina, suero, etc.).</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0065">-Conocer la carga de trabajo aproximada de las muestras que van a ser procesadas.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0070">-Establecer la periodicidad del procesamiento de las muestras (p. ej.: diaria, quincenal, mensual, etc.).</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0075">-Tener en cuenta el tipo de cromatógrafo líquido de alta eficacia y el sistema de detección con el que cuenta el laboratorio.</li></ul>Preparación y tratamiento de la muestraEl tratamiento y la preparación de las muestras biológicas es un proceso esencial. Su importancia radica en la necesidad de concentrarla o eliminar los distintos componentes de la muestra que pueden interferir y obtener así, una apropiada separación y eficacia cromatográficas. La presencia de proteínas, lípidos, sales y componentes celulares pueden interferir en la medición de la magnitud en estudio (obtención de señales erróneas en el detector y picos cromatográficos asimétricos, resolución inapropiada de picos cromatográficos, falta de reproducibilidad de los tiempos de retención, una menor capacidad de detección, etc.), así como condicionar el buen funcionamiento del sistema cromatográfico (obstrucción del inyector, fritas (p. ej. ubicadas en la entrada de la columna), detector, cánulas, tubos, válvulas, etc.)<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0215">13,14,17–21</a>.Los principales procedimientos de preparación de la muestra son la filtración, la centrifugación, la dilución e inyección, la precipitación de proteínas, la extracción líquido-líquido y la extracción en fase sólida. La elección de un procedimiento u otro dependerá del tipo de muestra biológica con la que se trabaje y de las propiedades físico-químicas del analito, siendo incluso necesario, algunas veces, la combinación de dos o más de estos procedimientos.Pese a las ventajas que supone la aplicación de estos procedimientos, la mayoría de ellos pueden dar lugar a una pérdida parcial del analito y, por otro lado, no todos permiten eliminar totalmente los diferentes interferentes de la muestra.Dilución e inyecciónEs el procedimiento más simple y se suele emplear para las muestras biológicas relativamente poco complejas (orina, líquido cefalorraquídeo). Consiste en diluir la muestra con un disolvente adecuado e inyectar la muestra diluida en el sistema cromatográfico. Este procedimiento permite reducir el posible efecto negativo de los distintos interferentes de la muestra sobre la medición de la magnitud en estudio pero, al no eliminarlos, pueden acumularse en el sistema cromatográfico y provocar un mal funcionamiento del mismo a lo largo del tiempo.Precipitación de proteínasEs el procedimiento más empleado debido a su simplicidad y al reducido número de reactivos que requiere. Consiste en adicionar un reactivo químico particular que reduce notablemente la solubilidad de las proteínas en la muestra haciendo que precipiten. Posteriormente, este precipitado es eliminado por filtración o centrifugación dejando un sobrenadante que es inyectado directamente al sistema cromatográfico. Adicionalmente, si se requiere, el sobrenadante puede ser diluido con un tampón o un disolvente apropiado (habitualmente la fase móvil) o evaporado (p. ej. empleando nitrógeno) hasta la sequedad y seguidamente diluido con un tampón o un disolvente apropiado.Dependiendo del reactivo de precipitación utilizado, de las condiciones experimentales y de las propiedades fisico-químicas de los componentes de la muestra, se pueden llegar a eliminar hasta el 98% de las proteínas de la muestra.El procedimiento de precipitación de proteínas más ampliamente utilizado se basa en la adición de un disolvente orgánico (principalmente acetonitrilo o metanol) a la muestra en una proporción determinada —4:1, 3:1 (la más empleada), 2:1—. También se usan otros reactivos químicos (p. ej.: ácido tricloroacético, hidróxido de zinc, sulfato de zinc o cloruro de magnesio), individualmente o conjuntamente con disolventes orgánicos.Hay que tener presente que en este procedimiento también se diluye el analito y, además, no se eliminan todos los componentes de la muestra (únicamente se eliminan la mayoría de las proteínas y los componentes celulares), quedando en el sobrenadante otros componentes —sales y lípidos— que pueden interferir en la medición de la magnitud biológica o en el buen funcionamiento del sistema cromatográfico. En determinados casos, puede ser necesario realizar otros procedimientos de extracción que permitan reducir estos componentes biológicos.Extracción líquido-líquidoLa extracción líquido-líquido es un procedimiento de preparación de la muestra que se fundamenta en la transferencia del analito entre dos líquidos inmiscibles (fase acuosa y fase orgánica), la cual depende de su solubilidad entre ambos líquidos. De modo general, a la muestra que contiene el analito (fase acuosa) se adiciona un líquido orgánico inmiscible (fase orgánica) que actúa como extractante. Después de un periodo de agitación, el analito se distribuye entre las dos fases hasta alcanzar una situación de equilibrio. Seguidamente, se deja reposar el sistema el tiempo necesario para que se produzca la separación de las fases o bien se centrifuga. La transferencia del analito se rige por la ley de distribución de Nernst que establece que, a presión y temperatura constantes, la relación de concentración de un analito entre dos fases inmiscibles es constante. Esta ley se materializa con la constante de distribución (KD):<elsevierMultimedia ident="eq0005"></elsevierMultimedia>donde [A]o representa la concentración de analito en la fase orgánica y [A]a la concentración de analito en la fase acuosa. Cada analito tiene un valor característico de KD para un par de disolventes concretos. Cuanto mayor es la KD, mayor es la eficacia de la extracción, de modo que a la hora de desarrollar un procedimiento líquido-líquido se debe tener una idea clara de la polaridad del analito y de los disolventes empleados. Si un analito es poco soluble en agua, su extracción se verá más favorecida por el empleo de disolventes apolares que empleando disolventes polares. Los disolventes orgánicos que suelen utilizarse son hexano, diclorometano, 1,2-dicloroetano, metil-tert-butil éter, entre otros.En este procedimiento también se diluye el analito, aunque puede concentrarse mediante evaporación del disolvente orgánico y reconstitución posterior con un disolvente apropiado. Además, no se eliminan todos los componentes de la muestra (únicamente se eliminan componentes celulares, las sales y algunas proteínas) quedando en el sobrenadante otros componentes como los lípidos, que pueden interferir en la medición de la magnitud biológica.Extracción en fase sólidaLa extracción en fase sólida o extracción sólido-líquido es un procedimiento en el que el analito se separa en función de la afinidad relativa entre la matriz de la muestra y un sólido que contiene una fase sólida (sorbente). La interacción sorbente-analito puede responder a diferentes mecanismos físico-químicos, entre los que cabe destacar la adsorción, partición, intercambio iónico, exclusión molecular, afinidad o una combinación de ellos. Esta situación permite que la extracción en fase sólida sea muy versátil y selectiva.Generalmente, comprende cinco etapas:<ul class="elsevierStyleList" id="lis0015"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0080">-Activación o acondicionamiento de la fase sólida. Consiste en la solvatación del sólido empleando un disolvente orgánico.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0085">-Equilibrado de la fase sólida. En esta etapa se emplea un disolvente similar a la matriz de la muestra que permite eliminar el exceso de disolvente acondicionador.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0090">-Adición de la muestra para conseguir la retención del analito por la fase sólida. En este paso aquellos potenciales interferentes que no presentan afinidad alguna por la fase sólida son descartados y eliminados.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0095">-Lavado de la fase sólida. En esta etapa se usa un disolvente o mezcla de disolventes para la eliminación selectiva de los interferentes que hayan podido quedar retenidos débilmente a la fase sólida.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0100">-Elución del analito. Mediante la adición de un disolvente adecuado se consigue debilitar la interacción y unión del analito a la fase sólida permitiendo la recuperación selectiva del mismo.</li></ul>En este procedimiento no se produce una dilución de la muestra (o lo hace en una proporción baja) y permite eliminar prácticamente la totalidad de los interferentes, proporcionando una mayor reproducibilidad que el resto de los procedimientos de extracción descritos.Selección del tipo de cromatografía líquida y la modalidad de trabajoPara llevar a cabo una adecuada separación y eficacia cromatográficas, se requiere que exista un equilibrio entre las fuerzas intermoleculares de los tres participantes activos en el proceso de separación: el analito, la fase móvil y la fase estacionaria. Por consiguiente, cuando se desarrolla un procedimiento cromatográfico, se debe seleccionar el tipo de cromatografía líquida (de adsorción, de reparto, de intercambio iónico, de exclusión molecular o de afinidad) atendiendo a cuáles son las interacciones que existen entre el analito y las diferentes fases<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0260">22,23</a>.En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">figura 1</a> se muestra un esquema relacionado con la selección del tipo de cromatografía líquida en función de las propiedades físico-químicas del analito.<elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia>En la cromatografía de reparto, existen dos modalidades cromatográficas de trabajo, la cromatografía en fase normal y la cromatografía en fase inversa. La cromatografía en fase normal se caracteriza por utilizar una fase móvil apolar o poco polar y una fase estacionaria polar. En esta modalidad, los analitos más polares quedan más retenidos en la fase estacionaria mientras que los menos polares eluyen primero. Por el contrario, en la cromatografía en fase inversa se emplean fases móviles polares y fases estacionarias apolares o poco polares. En este caso, los analitos más polares eluyen en primer lugar mientras que los menos polares quedan más retenidos.La cromatografía de reparto en la modalidad de fase inversa, al ser más versátil que otros tipos de cromatografías debido a su mecanismo de separación, actualmente es la más utilizada en las ciencias de laboratorio clínico y la que debería emplearse cuando se pretende desarrollar un procedimiento cromatográfico. Sin embargo, para la separación de ciertos analitos —que presentan unas propiedades físico-químicas muy específicas y diferenciadas— es aconsejable emplear otros tipos de cromatografía:<ul class="elsevierStyleList" id="lis0020"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0105">•Para analitos con elevada masa molar (p. ej., macromoléculas como enzimas y proteínas), es aconsejable utilizar la cromatografía de exclusión molecular, aunque esta dará lugar a una menor resolución cromatográfica.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0110">•Para analitos que son iones inorgánicos (p. ej., hierro, zinc, nitritos, nitratos) o analitos fácilmente ionizables (p. ej., aminas biógenas, hemoglobinas), es preferible emplear la cromatografía de intercambio iónico.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0115">•Para analitos que presentan varios estereoisómeros y presentan una polaridad elevada, es preferible emplear la cromatografía de adsorción.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0120">•Para analitos que no pueden ser separados por otros tipos de cromatografía o bien son susceptibles de ser separados mediante reacciones biológicas específicas del tipo antígeno-anticuerpo (p. ej., inmunoglobulinas), enzima-sustrato (p. ej., enzimas), entre otras, es preferible emplear la cromatografía de afinidad.</li></ul>Elección del sistema de detección cromatográficoLa elección del sistema cromatográfico dependerá, entre otros factores, de la naturaleza química del analito a estudiar (es decir, de sus propiedades físico-químicas), de las posibles interferencias que puedan existir después del proceso de preparación de la muestra, de la capacidad de detección (detectabilidad) que se requiera y de los detectores cromatográficos disponibles en el laboratorio clínico<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230">16–24</a>.Siempre que sea posible, el laboratorio clínico debería seleccionar detectores cromatográficos con elevada versatilidad, tales como los de absorción molecular, los de índice de refracción y los espectrómetros de masas. Generalmente, los detectores cromatográficos de absorción molecular suelen ser los más empleados dada la naturaleza orgánica de los analitos que se estudian en los laboratorios<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230">16–24</a>. Además, suelen tener un coste asumible. En el caso de que los analitos no absorban la radiación electromagnética o presenten una baja absorción (p. ej.: glúcidos, ácidos grasos y algunos lípidos), es recomendable utilizar los detectores de índice de refracción. Este tipo de detectores presentan una menor sensibilidad metrológica, capacidad de detección y selectividad que los de absorción, y su coste suele ser similar. Además, estos no permiten trabajar en la modalidad en gradiente.De todos estos detectores, el más versátil y selectivo es el espectrómetro de masas ya que, al basarse en la medición de propiedades de la materia como la masa y la carga, permite prácticamente la detección de cualquier tipo de analito. Su principal desventaja es su elevado coste<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230">16–24</a>.Además de los detectores mencionados, existen otros que son más selectivos, sensibles y con una mayor capacidad de detección (aunque menos que los espectrómetros de masas), como son los detectores de fluorescencia y los electroquímicos. Los detectores de fluorescencia son los que presentan mayor sensibilidad y capacidad de detección<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230">16–24</a>. No obstante, para poder utilizar un detector de fluorescencia es necesario que los analitos presenten la capacidad de emitir fluorescencia o bien, que la emitan cuando se les hace reaccionar con otras sustancias químicas. Los detectores electroquímicos es recomendable emplearlos cuando se estudian analitos con propiedades oxidantes o reductoras, como por ejemplo las aminas biógenas (catecolaminas, metanefrinas, vanilmandelato, 5-hidroxiindolilacetato, entre otras). Este tipo de detectores han de ser utilizados con precaución ya que presentan una elevada sensibilidad y suelen ser susceptibles a interferencias eléctricas producidas por la propia fuente de alimentación eléctrica. El coste de los detectores fluorimétricos y electroquímicos suele ser similar o ligeramente superior a los de absorción o de índice de refracción<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230">16–24</a>.Optimización de la separación cromatográficaDurante el proceso de optimización de la separación cromatográfica, además de la necesidad de conocer las propiedades físico-químicas del analito, deben considerarse diferentes aspectos relacionados con la fase móvil y la fase estacionaria<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230">16–21</a> que se describen a continuación.Composición de la fase móvilEl conocimiento de la polaridad del analito permite seleccionar los disolventes a emplear en la fase móvil. Así, la selección de la fase móvil debe llevarse a cabo en base a su solubilidad con el analito. Además, el analito no debe reaccionar con ninguna de las sustancias que componen el disolvente.Existe una estrecha relación entre el tiempo de retención o elución de los analitos con la composición de la fase móvil como consecuencia del efecto de la polaridad. De hecho, en la HPLC de reparto de fase inversa, el tiempo de elución de los analitos puede ser alterado modificando la polaridad de la fase móvil, es decir, variando el tipo de disolventes a utilizar y el porcentaje empleado de cada uno de ellos. Esta es la manera más sencilla para intentar mejorar la resolución cromatográfica de dos componentes de una muestra cuyos picos cromatográficos se solapan, o para disminuir el tiempo global de separación de los componentes cuando estos presentan tiempos de retención muy diferentes.Un adecuado punto de partida para optimizar la separación cromatográfica sería emplear una mezcla de agua y un disolvente orgánico polar (metanol o acetonitrilo), con una mayor proporción de agua (p. ej.: cercano al 100%), y observar cómo varían los tiempos de elución y la resolución de los analitos al disminuir la proporción acuosa y aumentar la proporción del disolvente orgánico.pH de la fase móvilEl ajuste del pH de la fase móvil y el conocimiento del pKa del analito tienen un papel muy importante para establecer las condiciones cromatográficas iniciales y su posterior optimización. La selección de un pH adecuado dará lugar a que el analito esté o no ionizado y, a menudo, esta situación conducirá a la obtención de picos simétricos, estrechos y puntiagudos en el proceso cromatográfico. La obtención de este tipo de picos es necesaria cuando la cromatografía es utilizada con una finalidad cuantitativa, ya que permitirá obtener mejores propiedades metrológicas (límites de detección y cuantificación más bajos, menores valores de imprecisión y sesgo), así como tiempos de retención cromatográficos reproducibles.Las soluciones tampón deben añadirse a la fase móvil cuando el analito es un compuesto con propiedades iónicas. En la HPLC de reparto de fase inversa, los analitos de una muestra se separan en función de su polaridad de forma que los menos polares son más retenidos por la columna y viceversa. Cuando se ioniza un analito, aumenta su polaridad y, en consecuencia, presentará una menor retención en la columna. Los analitos de naturaleza ácida se ionizan cuando el pH es superior a su pKa y los analitos de naturaleza básica, cuando el pH es inferior a su pKa. Así, se obtendrá una mayor retención en la columna para los analitos ácidos cuando se trabaje a pH ácido y por debajo de su pKa; y una mayor retención también a pH básico y por encima de su pKa para los analitos básicos. La relación entre el analito ionizado y no ionizado —a un pH determinado— puede conocerse mediante la ecuación de Henderson-Hasselbach.Teniendo en cuenta todas estas consideraciones, para obtener una mayor retención del analito y, en consecuencia, unos picos cromatográficos aceptables y una reproducibilidad adecuada, debe ajustarse el pH de la fase móvil dos unidades por debajo del pKa del analito, si este es de naturaleza ácida, y dos unidades por encima del pKa del analito si es de naturaleza básica. En estas condiciones, el 99% del analito no estará ionizado.Las principales soluciones tampón y sus correspondientes pKa (a 25°C) se muestran en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a> El efecto óptimo de amortiguación de cada tampón se obtiene para el intervalo de pH comprendido entre pKa±1.<elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia>Un aspecto a tener en cuenta durante la selección de una solución tampón es el sistema de detección con el que se va a trabajar. Si se emplea un sistema de absorción molecular en la zona del espectro visible, cualquiera de las soluciones tampón mencionadas puede ser utilizada, pero si se trabaja en la zona del ultravioleta, las soluciones tampón de citrato no son recomendables a no ser que se trabaje a longitudes de onda por encima de 230nm. De todos los tampones citados, los tampones fosfato son los más ampliamente empleados en la HPLC acoplada a la espectrometría de absorción molecular, dadas sus propiedades absortivas y amortiguadoras. Por otra parte, si se emplean sistemas de detección basados en la espectrometría de masas, deben utilizarse tampones volátiles (p. ej.: acetato de amonio, formiato de amonio y trietilamina) y evitar el uso de tampones no volátiles (p. ej.: fosfato y citrato).Otra consideración importante es la concentración de tampón a utilizar. La solución tampón debe presentar una concentración suficientemente elevada como para poder controlar el pH de la fase móvil, pero no excesiva para evitar la posible precipitación de las sales del tampón en presencia de disolventes orgánicos. Habitualmente, una concentración apropiada de la solución tampón es aquella que está comprendida entre 10mmol/l y 50mmol/l. Los tampones fosfato, a concentraciones elevadas, deben evitarse ya que pueden precipitar. Este hecho se acentúa si se emplea una proporción elevada de disolvente orgánico en la fase móvil (> 50%).Modalidad de elución de la fase móvilPor norma general, una elución isocrática —que mantiene constante la composición de la fase móvil durante todo el proceso cromatográfico— da lugar a separaciones cromatográficas más reproducibles que una elución en gradiente —que varía la composición de la fase móvil durante el proceso cromatográfico—. A pesar de ello, trabajar en la modalidad de elución isocrática presenta una serie de desventajas como son su bajo «poder de separación» —el número de analitos que pueden ser separados en un mismo proceso cromatográfico— y la obtención de picos cromatográficos más anchos en aquellos analitos que son más retenidos en la columna, afectando a la resolución cromatográfica. La elución isocrática se emplea para separaciones simples —de uno o pocos componentes— reservando la elución en gradiente para separaciones de mezclas más complejas, ya que permite aumentar significativamente el «poder de separación» como consecuencia de un aumento de la eficiencia cromatográfica (disminución de la anchura del pico), además de permitir disminuir el tiempo de la cromatografía y reducir el consumo de los disolventes que conforman la fase móvil.Un adecuado punto de partida para optimizar la separación cromatográfica sería emplear la modalidad de elución isocrática, a no ser que se requiera separar un número elevado de analitos o bien reducir significativamente el tiempo de la cromatografía, en cuyo caso se debería trabajar en la modalidad de elución en gradiente.Influencia de la temperatura de la fase móvilLa mayoría de los sistemas cromatográficos incluyen un compartimento específico para columnas que permite seleccionar la temperatura de trabajo de la fase móvil. La temperatura influye considerablemente en diferentes parámetros cromatográficos como la solubilidad, la difusividad, la viscosidad y la polaridad de la fase móvil.A elevadas temperaturas (>40°C), la viscosidad de la fase móvil se reduce y la velocidad de difusión aumenta, provocando que la tasa de transferencia de masa del analito entre la fase estacionaria y la fase móvil se incremente y, consecuentemente, la eficacia, la resolución y la separación cromatográficas. Así, se puede trabajar con flujos de fase móvil ligeramente mayores que con los que se trabajaría a temperatura ambiente, hecho que permite acortar sustancialmente el tiempo de análisis sin perder eficacia.Un punto de partida adecuado para optimizar la separación cromatográfica sería trabajar a temperatura ambiente (25-30°C) y observar cómo varían los tiempos de elución y la resolución de los analitos al incrementar la temperatura (p. ej.: de 5°C en 5°C) y el flujo de la fase móvil (p.ej.: de 0,1mL/min en 0,1mL/min).Selección de la fase estacionariaLa selección del tipo de columna depende de la naturaleza físico-química del analito que se pretende separar, del tipo y modalidad de HPLC utilizadas y de cuál sea la finalidad de la separación cromatográfica.Para la correcta selección de una columna analítica deberían considerarse los siguientes aspectos:1. Selección del tamaño de poro. La selección del tamaño de poro dependerá de la masa molar del analito. Debe seleccionarse un relleno de columna con un tamaño de poro comprendido entre 60Å y 150Å si la masa molar del analito es inferior a, aproximadamente, 2.000g/mol. En caso contrario, debe utilizarse un relleno de columna con un tamaño de poro entre 200Å y 300Å.2. Selección del empaquetado químico. En la actualidad, existe una gran variedad de columnas comerciales disponibles con diferentes tipos de empaquetados químicos (<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0010">tabla 2</a>). En la HPLC de reparto en fase inversa, un buen punto de partida podría ser emplear empaquetados químicos del tipo C18 o C8. Si los analitos de la muestra no se separan adecuadamente, se deberían utilizar las columnas de CN y fenilo. Estas pueden ofrecer diferencias significativas en selectividad frente a las fases alquílicas lineales a la hora de efectuar la separación. En general, los analitos con elevada masa molar, como las proteínas, se separan mejor en columnas de fase inversa con empaquetados químicos de cadena corta (C3, CN) y los péptidos y los analitos con baja-media masa molar, se separan mejor en columnas con empaquetados químicos de cadenas más largas (C8, C18).<elsevierMultimedia ident="tbl0010"></elsevierMultimedia>3. Selección del tamaño de partícula. El tamaño de partícula estándar es de 5μm aunque también pueden utilizarse tamaños entre 1,3μm y 3,0μm. Si es necesario realizar una separación cromatográfica más rápida o con una mayor resolución y eficacia es preferible utilizar columnas con un tamaño de partícula de 3,0μm o menor. Cabe destacar que las columnas con un tamaño de partícula menor de 3,0μm operan a una presión<300bar y pueden utilizarse en la mayoría de cromatógrafos líquidos. En cambio, si el tamaño de partícula de la columna es<2,0μm, se alcanzan presiones ≥ 400bar y se precisan cromatógrafos líquidos que permitan soportar estas elevadas presiones.4. Diámetro interno de la columna. El diámetro interno de la columna define cuánto material (masa o volumen) se puede inyectar en la columna. Cuanto menor sea el diámetro, menor será la cantidad de material que se pueda inyectar manteniendo una aceptable resolución. Las columnas más empleadas presentan un diámetro interno de 4,6mm. Cabe destacar que las columnas con un diámetro interno menor proporcionan una mayor capacidad de detección y, por consiguiente, suelen utilizarse en la HPLC acoplada a la espectrometría de masas o en procedimientos cromatográficos desarrollados con un volumen de muestra limitado.5. Longitud de la columna. Las columnas más utilizadas presentan una longitud de 100mm, 150mm o 250mm conjuntamente con un tamaño de partícula de 5μm. Estas condiciones proporcionan tiempos de cromatografía comprendidos entre 20-30min. Si se desea acortar el tiempo de cromatografía, se deben emplear columnas con una longitud menor (30mm, 50mm o 75mm) pero con un tamaño de partícula ≤ 3,5μm.Preparación de soluciones y materiales diversosReactivos y disolventesUn aspecto esencial cuando se trabaja con procedimientos cromatográficos es que los reactivos genéricos y disolventes que se emplean para preparar la fase móvil, los materiales de calibración o de control, los estándares internos y otras soluciones, presenten una elevada pureza (calidad HPLC o HPLC-MS). De no ser así, se puede comprometer la medición de la magnitud en estudio (separación, resolución y eficacias cromatográficas inapropiadas que pueden dar lugar, principalmente, a una menor reproducibilidad y capacidad de detección), así como condicionar el buen funcionamiento del sistema cromatográfico (obstrucción de cánulas, fritas, tubos, válvulas, inyectores, detectores, etc.).Materiales de calibración y materiales de controlSiempre que sea posible, es recomendable que se utilicen materiales de calibración y de control comerciales y que su preparación se realice siguiendo las instrucciones y recomendaciones descritas por el fabricante. Por otra parte, los materiales de calibración deben presentar valores trazables a una referencia adecuada<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0275">25</a>. Desafortunadamente, son pocas las empresas del diagnóstico in vitro que fabrican y disponen de este tipo de materiales para sistemas cromatográficos por lo que, en estos casos, los laboratorios clínicos deberán preparar sus propios materiales de calibración y de control.PreparaciónSi el laboratorio ha de preparar los materiales de calibración y control, debe utilizar<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0215">13,15,22,23,25</a>:<ul class="elsevierStyleList" id="lis0025"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0125">-Un material de pureza conocida y que, si es posible, sea trazable a una referencia de la mayor calidad metrológica posible.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0130">-Una mezcla del líquido biológico en estudio (plasma, suero, orina, etc.) pero que no contenga el analito en cuestión (material de blanco).</li></ul>Cabe destacar que si el analito es un componente biológico, como material de blanco se podría utilizar una solución de cloruro de sodio 154mmol/l y albúmina 50g/l, una solución salina comercial o agua calidad HPLC o HPLC-MS, siempre y cuando se conozca que el efecto matriz es mínimo o despreciable. Si existe un efecto matriz significativo, es recomendable utilizar una mezcla del líquido biológico (plasma, suero, orina, etc.) y aplicar un procedimiento que permita compensar el efecto matriz existente, por ejemplo, mediante el procedimiento de la adición estándar.El número mínimo recomendable de materiales de calibración a preparar es de seis (sin contar los materiales de blanco o calibradores 0) y con valores que cubran el intervalo de medida en estudio.El número mínimo recomendable de materiales de control a preparar es de tres. Dos de los materiales deben presentar valores por debajo («control bajo») y por encima («control alto») del intervalo de referencia, intervalo terapéutico o valor de decisión clínica (valor discriminante), y el tercer material debe presentar un valor intermedio o cercano al valor discriminante («control medio»). Además, el «control bajo» debe presentar un valor aproximadamente tres veces el del límite de cuantificación.Para minimizar errores, es recomendable que el procedimiento de preparación de los materiales de calibración y de control se realice de la siguiente manera:<ul class="elsevierStyleList" id="lis0030"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0135">1)Preparar el material de blanco a partir de una mezcla de muestras de pacientes presuntamente sanos (se recomienda utilizar un mínimo de 10 muestras). Una vez realizada la mezcla, debe verificarse que en la misma no existe el analito. Esta verificación se puede llevar a cabo utilizando la información clínica de cada uno de los pacientes empleados así como, procesando la muestra en el sistema cromatográfico.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0140">2)Preparar dos soluciones primarias del analito, una para los materiales de calibración y otra para los materiales de control, en un disolvente apropiado (agua, metanol, acetonitrilo, dimetisulfóxido, entre otros, dependiendo de la solubilidad del analito). Es necesario que las dos soluciones se preparen a partir de pesadas diferentes.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0145">3)Preparar diferentes soluciones de trabajo (seis para los materiales de calibración y tres para los materiales de control) a partir de la correspondiente solución primaria del analito y del material de blanco. En algunos casos, debido a que los diferentes disolventes orgánicos utilizados en la preparación de la solución primaria pueden provocar la precipitación del material de blanco empleado, es preferible realizar distintas soluciones secundarias (seis para los materiales de calibración y tres para los materiales de control), en agua calidad HPLC o HPLC-MS, y preparar las soluciones de trabajo a partir de estas soluciones secundarias y el material de blanco.</li></ul>Siempre que sea posible, deberían prepararse nuevas soluciones de trabajo para los materiales de calibración y de control cada vez que se realice la medición de la magnitud en estudio, a menos que se pueda garantizar que estas son estables en unas condiciones de almacenamiento determinadas (p. ej.: a -80°C).Valores asignados. Trazabilidad e incertidumbre de medidaSi el laboratorio clínico prepara los materiales de calibración, es responsable de asegurar la trazabilidad metrológica de los valores asignados hasta las referencias de mayor jerarquía metrológica asequibles y de calcular la incertidumbre de los valores asignados. Para ello, debe usar la información relacionada con su preparación. Además, la preparación debe realizarse utilizando instrumentos de medida (pipetas, matraces aforados, balanzas analíticas, entre otros) adecuadamente calibrados.La Comisión de Metrología y Sistemas Analíticos dispone de recomendaciones relacionadas con la utilización de calibradores con trazabilidad metrológica<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0275">25</a>, la calibración de instrumentos de medida<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0280">26,27</a> y de cómo debe estimarse la incertidumbre de medida<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0290">28</a>.En el <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0165">Material suplementario 1</a> se muestra un ejemplo práctico de cómo realizar la preparación de los materiales de calibración y de control, el cálculo de la incertidumbre de medida de los valores asignados a los mismos, así como la información relativa a la trazabilidad de los resultados de medida.Soluciones de patrones internosLa utilización de patrones internos es una práctica común en HPLC cuando se utilizan los sistemas cromatográficos con una finalidad cuantitativa<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0260">22–24</a>. Un patrón interno es una sustancia que se añade a todas las muestras, materiales de calibración y materiales de control en una cantidad conocida constante, permitiendo compensar o reducir algunos errores que se puedan producir en el procedimiento de medida (p. ej.: errores atribuibles a la preparación de la muestra) o bien que puedan afectar al sistema cromatográfico (errores en el pipeteo de muestras por parte del muestreador automático, compensación de fluctuaciones en la señal analítica que puedan producirse en el detector, compensación de un posible efecto matriz, entre otros).Idealmente, un patrón interno debería cumplir las siguientes características<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0215">13–15,22,23</a>:<ul class="elsevierStyleList" id="lis0035"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0150">-No encontrarse en la muestra a estudiar.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0155">-Presentar una composición y estructura química similar a la del analito. En la HPLC-MS o HPLC-MS/MS, siempre que sea posible, debería utilizarse el propio analito marcado con isótopos estables (2H, 13C, 15N, entre otros).</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0160">-Presentar una elevada pureza. Además, se deberían conocer cuáles son sus impurezas.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0165">-Ser suficientemente estable en solución como para garantizar que no se degradará durante los procesos de preparación de la muestra y de separación cromatográfica.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0170">-Proporcionar una señal suficiente en el detector cromatográfico.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0175">-Presentar una resolución cromatográfica claramente diferenciada del analito. Esta característica no es necesaria si se emplea un espectrómetro de masas como detector cromatográfico.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0180">-Eluir después del analito, de tal manera que permita confirmar que la separación cromatográfica se ha producido correctamente. Si se utiliza un espectrómetro de masas como detector cromatográfico, es suficiente —incluso necesario la mayoría de las veces— que el analito eluya al mismo tiempo de retención que el patrón interno.</li></ul>Siempre que sea posible, es recomendable que se empleen patrones internos comerciales y que su preparación se realice siguiendo las instrucciones y recomendaciones descritas por el fabricante. En caso contrario, su preparación puede realizarse de la siguiente manera<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0215">13–15,22,23</a>:<ul class="elsevierStyleList" id="lis0040"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0185">1)Preparar una solución primaria de patrón interno en un disolvente apropiado (agua, metanol, acetonitrilo, dimetilsulfóxido, entre otros, dependiendo de la solubilidad del mismo).</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0190">2)Preparar, a partir de la solución primaria, una solución de trabajo de patrón interno, en un disolvente apropiado, que produzca una señal analítica suficiente y estable en el detector cromatográfico. Es recomendable preparar una solución de trabajo a una concentración similar a la que tendría el analito a valores fisiológicos, dentro del intervalo de referencia o terapéutico o cercanos al valor discriminante.</li></ul>Siempre que sea posible, se debería preparar una solución de trabajo de patrón interno nueva cada vez que se realice la medición de la magnitud en estudio, a no ser que se pueda garantizar que esta es estable en unas condiciones de almacenamiento determinadas (p. ej.: a -80°C).En el <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0165">Material suplementario 2</a> se muestra un ejemplo práctico de cómo llevar a la selección de un patrón interno y cómo realizar la preparación de la solución de trabajo del patrón interno.CalibraciónLos principales procedimientos de calibración empleados en la HPLC son los del patrón externo, del patrón interno (el más utilizado), de normalización de áreas y de la adición estándar<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0260">22–24</a>.El proceso de calibración y la obtención de la curva de calibración está sujeto a una serie de condiciones<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0215">13–15</a>:<ul class="elsevierStyleList" id="lis0045"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0195">-La curva de calibración debe estar definida por un mínimo de seis materiales de calibración. Adicionalmente, han de prepararse dos materiales de blanco, uno que no contenga ni el analito en estudio ni el estándar interno (si se emplea), y otro que solo contenga el estándar interno (si se utiliza).</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0200">-El material de calibración que presenta el valor más bajo de la magnitud en estudio (calibrador 1) debe presentar un valor cercano al límite de cuantificación.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0205">-El material de calibración que presenta el valor más alto de la magnitud en estudio (calibrador 6) debe coincidir con el límite superior del intervalo de medida previamente seleccionado.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0210">-Los materiales de calibración y los materiales de blanco deben procesarse por duplicado.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0215">-Siempre que sea posible, la curva de calibración debe estar representada por la ecuación de una línea recta.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0220">-Se puede utilizar cualquier algoritmo matemático que permita ajustar la curva de calibración (regresión lineal, polinómica, múltiple, recíproca, logarítmica, exponencial, entre otros).</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0225">-Los valores obtenidos en los materiales de blanco no deben considerarse durante la realización del ajuste matemático que representará la curva de calibración.</li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0230">-Para cada material de calibración procesado, debe calcularse la diferencia relativa porcentual entre el valor obtenido mediante el ajuste matemático (valor obtenido) y su correspondiente valor asignado dividido por el valor asignado. Esta diferencia debe estar comprendida entre±15%, excepto para el calibrador 1 (calibrador con un valor cercano al límite de cuantificación) donde esta diferencia puede estar comprendida entre±20%. Como mínimo, para el 75% de los materiales de calibración procesados debe cumplirse esta condición. Además, entre los duplicados de un mismo material de calibración, al menos uno de ellos debe cumplir este requisito.</li></ul>Si alguno de los materiales de calibración no cumple estas condiciones, el valor obtenido para el mismo debe eliminarse, volver a realizar el ajuste de la curva de calibración, calcular de nuevo las distintas diferencias relativas porcentuales y comprobar el cumplimiento de dichas condiciones.Validación del procedimiento de medida desarrolladoUna vez desarrollado el procedimiento cromatográfico, el laboratorio clínico debe llevar a cabo una validación del mismo antes de ser utilizado con muestras de pacientes, con el objeto de confirmar que este será adecuado para sus aplicaciones clínicas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0295">29,30</a>.En el <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0165">Material suplementario 3</a>, se muestra un ejemplo que contiene los principales aspectos a considerar en el desarrollo de un procedimiento cromatográfico." "textoCompletoSecciones" => array:1 [ "secciones" => array:4 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "sec0005" "titulo" => "Introducción" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "sec0010" "titulo" => "Objeto y campo de aplicación" ] 2 => array:3 [ "identificador" => "sec0015" "titulo" => "Desarrollo de procedimientos de medida cromatográficos" "secciones" => array:11 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "sec0020" "titulo" => "Descripción y recopilación de información relacionada con el analito" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "sec0025" "titulo" => "Especificación y establecimiento de objetivos" ] 2 => array:3 [ "identificador" => "sec0030" "titulo" => "Preparación y tratamiento de la muestra" "secciones" => array:2 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "sec0035" "titulo" => "Dilución e inyección" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "sec0040" "titulo" => "Precipitación de proteínas" ] ] ] 3 => array:2 [ "identificador" => "sec0045" "titulo" => "Extracción líquido-líquido" ] 4 => array:2 [ "identificador" => "sec0050" "titulo" => "Extracción en fase sólida" ] 5 => array:2 [ "identificador" => "sec0055" "titulo" => "Selección del tipo de cromatografía líquida y la modalidad de trabajo" ] 6 => array:2 [ "identificador" => "sec0060" "titulo" => "Elección del sistema de detección cromatográfico" ] 7 => array:3 [ "identificador" => "sec0065" "titulo" => "Optimización de la separación cromatográfica" "secciones" => array:5 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "sec0070" "titulo" => "Composición de la fase móvil" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "sec0075" "titulo" => "pH de la fase móvil" ] 2 => array:2 [ "identificador" => "sec0080" "titulo" => "Modalidad de elución de la fase móvil" ] 3 => array:2 [ "identificador" => "sec0085" "titulo" => "Influencia de la temperatura de la fase móvil" ] 4 => array:2 [ "identificador" => "sec0090" "titulo" => "Selección de la fase estacionaria" ] ] ] 8 => array:3 [ "identificador" => "sec0120" "titulo" => "Preparación de soluciones y materiales diversos" "secciones" => array:3 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "sec0125" "titulo" => "Reactivos y disolventes" ] 1 => array:3 [ "identificador" => "sec0130" "titulo" => "Materiales de calibración y materiales de control" "secciones" => array:2 [ 0 => array:2 [ "identificador" => "sec0135" "titulo" => "Preparación" ] 1 => array:2 [ "identificador" => "sec0140" "titulo" => "Valores asignados. Trazabilidad e incertidumbre de medida" ] ] ] 2 => array:2 [ "identificador" => "sec0145" "titulo" => "Soluciones de patrones internos" ] ] ] 9 => array:2 [ "identificador" => "sec0150" "titulo" => "Calibración" ] 10 => array:2 [ "identificador" => "sec0155" "titulo" => "Validación del procedimiento de medida desarrollado" ] ] ] 3 => array:1 [ "titulo" => "Bibliografía" ] ] ] "pdfFichero" => "main.pdf" "tienePdf" => true "apendice" => array:1 [ 0 => array:1 [ "seccion" => array:1 [ 0 => array:4 [ "apendice" => "<elsevierMultimedia ident="upi0005"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="upi0010"></elsevierMultimedia><elsevierMultimedia ident="upi0015"></elsevierMultimedia>" "etiqueta" => "Anexo A" "titulo" => "Material suplementario" "identificador" => "sec0165" ] ] ] ] "multimedia" => array:7 [ 0 => array:7 [ "identificador" => "fig0005" "etiqueta" => "Figura 1" "tipo" => "MULTIMEDIAFIGURA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "figura" => array:1 [ 0 => array:4 [ "imagen" => "gr1.jpeg" "Alto" => 1780 "Ancho" => 1649 "Tamanyo" => 174420 ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "Tipos de cromatografía líquida a emplear en función de la masa molar y la polaridad del analito. Adaptada de Skoog<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0260">22</a>." ] ] 1 => array:8 [ "identificador" => "tbl0005" "etiqueta" => "Tabla 1" "tipo" => "MULTIMEDIATABLA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "detalles" => array:1 [ 0 => array:3 [ "identificador" => "at1" "detalle" => "Tabla " "rol" => "short" ] ] "tabla" => array:1 [ "tablatextoimagen" => array:1 [ 0 => array:2 [ "tabla" => array:1 [ 0 => """ <table border="0" frame="\n \t\t\t\t\tvoid\n \t\t\t\t" class=""><thead title="thead"><tr title="table-row"><th class="td" title="table-head " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Solución tampón \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">pKa \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Longitud de onda (nm) de absorción \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry " rowspan="2" align="left" valign="top">Formiato de amonio</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">3,8 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " rowspan="2" align="left" valign="top">210</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">9,2 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry " rowspan="2" align="left" valign="top">Acetato de amonio</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">4,8 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " rowspan="2" align="left" valign="top">210</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">9,2 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Ácido cítrico/citrato monobásico \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">3,1 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " rowspan="3" align="left" valign="top">230</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Citrato monobásico/citrato dibásico \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">4,7 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Citrato dibásico/citrato tribásico \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">5,4 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Ácido fosfórico/dihidrógeno fosfato \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">2,1 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " rowspan="3" align="left" valign="top"><200</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Dihidrógeno fosfato/hidrógeno fosfato \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">7,2 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Hidrógeno fosfato/fosfato \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">12,3 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Tricloroacetato/ácido tricloroacético \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top"><2,0 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">210 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Formiato/ácido fórmico \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">3,8 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">210 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Acetato/ácido acético \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">4,8 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">210 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Tris-(hidroximetil)-aminometano/ ion Tris-(hidroximetilinio)-aminometano \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">8,3 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">220 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Amoniaco/amonio \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">9,2 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">210 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Ácido bórico/borato \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">9,2 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">210 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Trietilamina/ion trietilaminio \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">10,8 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">200 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Pirrolidina/ion pirrolidinio \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">11,3 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">200 \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr></tbody></table> """ ] "imagenFichero" => array:1 [ 0 => "xTab1789182.png" ] ] ] ] "descripcion" => array:1 [ "es" => "Principales soluciones tampón y sus correspondiente pKa y límites de absorción UV (ennm)" ] ] 2 => array:8 [ "identificador" => "tbl0010" "etiqueta" => "Tabla 2" "tipo" => "MULTIMEDIATABLA" "mostrarFloat" => true "mostrarDisplay" => false "detalles" => array:1 [ 0 => array:3 [ "identificador" => "at2" "detalle" => "Tabla " "rol" => "short" ] ] "tabla" => array:1 [ "tablatextoimagen" => array:1 [ 0 => array:2 [ "tabla" => array:1 [ 0 => """ <table border="0" frame="\n \t\t\t\t\tvoid\n \t\t\t\t" class=""><thead title="thead"><tr title="table-row"><th class="td" title="table-head " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Tipos de empaquetados químicos \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Tipo de cromatografía \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Modalidad de trabajo \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">C18 (octadecilo, «ODS») \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Reparto \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Fase inversa \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">C8 (octilo) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Reparto \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Fase inversa \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">C6 (hexilo) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Reparto \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Fase inversa \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">C4 (butilo) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Reparto \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Fase inversa \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">C1 (trimetilsililo) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Reparto \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Fase inversa \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">«Fenilo» \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Reparto \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Fase inversa \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">PFP (pentafluorofenilo) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Reparto \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Fase inversa \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">CONH2 (amida) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Reparto \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Fase inversa \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry " rowspan="2" align="left" valign="top">CN (ciano)</td><td class="td" title="table-entry " rowspan="2" align="left" valign="top">Reparto</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Fase inversa \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Fase normal \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry " rowspan="2" align="left" valign="top">NH2 (amino)</td><td class="td" title="table-entry " rowspan="2" align="left" valign="top">Reparto</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Fase inversa \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Fase normal \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry " rowspan="2" align="left" valign="top">NH(CH3)2 (dimetilamina)</td><td class="td" title="table-entry " rowspan="2" align="left" valign="top">Reparto</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Fase inversa \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Fase normal \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry " rowspan="2" align="left" valign="top">Poliestireno</td><td class="td" title="table-entry " rowspan="2" align="left" valign="top">Reparto</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Fase inversa \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Fase normal \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Sílice \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Reparto \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Fase normal \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">(OH)2 (diol) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Reparto \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Fase normal \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">NR4 (amina cuaternaria) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Intercambio iónico \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">– \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">SO3 (ácido sulfónico) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Intercambio iónico \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">– \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">CH3NH2 (metilamina) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Intercambio iónico \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">– \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">COOH (ácido carboxílico) \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Intercambio iónico \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">– \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry " rowspan="2" align="left" valign="top">Polímeros/sílice específicos</td><td class="td" title="table-entry " align="left" valign="top">Afinidad \t\t\t\t\t\t\n \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry " rowspan="2" align="left" valign="top">–</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; 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Documento de comisión/grupo de trabajo

Development of measurement procedures based on high-performance liquid chromatography

Raúl Rigo Bonnin

Autor para correspondencia

raulr@bellvitgehospital.cat

Autor para correspondencia.

, Francesca Canalias Reverter, Sara Esteve Poblador, Francisco Javier Gella Tomás, Bernardino González de la Presa, Rosa M. López Martínez

Comisión de Metrología y Sistemas Analíticos, Comité Científico, Sociedad Española de Medicina de Laboratorio (SEQCML), España

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          "es" => "<p id="spar0005" class="elsevierStyleSimplePara elsevierViewall">Tipos de cromatograf&#237;a l&#237;quida a emplear en funci&#243;n de la masa molar y la polaridad del analito&#46; Adaptada de Skoog<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0260"><span class="elsevierStyleSup">22</span></a>&#46;</p>"
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    "textoCompleto" => "<span class="elsevierStyleSections"><span id="sec0005" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0005">Introducci&#243;n</span><p id="par0005" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La cromatograf&#237;a l&#237;quida de alta resoluci&#243;n o <span class="elsevierStyleItalic">high-performance liquid chromatography</span> &#40;HPLC&#41; es un principio de medida que permite separar los componentes de una muestra &#40;analitos&#41; en funci&#243;n de su distribuci&#243;n entre dos fases inmiscibles entre s&#237;&#58; una fase estacionaria &#40;un s&#243;lido o un l&#237;quido adsorbido sobre un soporte s&#243;lido&#41; y una fase m&#243;vil &#40;un l&#237;quido&#41;&#46; En este tipo de cromatograf&#237;a&#44; para que tenga lugar el proceso f&#237;sico-qu&#237;mico de separaci&#243;n&#44; la muestra es inyectada en el seno de la fase m&#243;vil&#44; en la que es soluble&#44; e impulsada a una elevada presi&#243;n a trav&#233;s de una columna que contiene la fase estacionaria&#46; Una vez separados los diferentes analitos en el sistema cromatogr&#225;fico &#40;eluatos&#41;&#44; y en funci&#243;n de sus propiedades fisico-qu&#237;micas&#44; estos pueden ser identificados o cuantificados empleando alguno de los m&#250;ltiples sistemas de detecci&#243;n existentes&#46;</p><p id="par0010" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Debido a la elevada capacidad para separar&#44; aislar&#44; identificar y cuantificar que presenta la HPLC&#44; los procedimientos de medida basados en esta tecnolog&#237;a &#40;de ahora en adelante&#44; <span class="elsevierStyleItalic">procedimientos cromatogr&#225;ficos</span>&#41; llevan a&#241;os aplic&#225;ndose en los centros de investigaci&#243;n&#44; en la industria farmac&#233;utica&#44; en las empresas del diagn&#243;stico <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> o en los laboratorios cl&#237;nicos para el desarrollo de nuevos f&#225;rmacos o para la identificaci&#243;n o la medici&#243;n de nuevas propiedades biol&#243;gicas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0155"><span class="elsevierStyleSup">1&#44;2</span></a>&#46; En los &#250;ltimos a&#241;os&#44; la aplicaci&#243;n de la HPLC en los laboratorios cl&#237;nicos ha adquirido un papel m&#225;s relevante debido&#44; principalmente&#44; a la aparici&#243;n de sistemas de medida que combinan la HPLC con sistemas de detecci&#243;n espec&#237;ficos y con una elevada capacidad de detecci&#243;n como son los espectr&#243;metros de masas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0165"><span class="elsevierStyleSup">3&#8211;6</span></a>&#46; Pese a ello&#44; en la actualidad&#44; son pocos los laboratorios cl&#237;nicos espa&#241;oles que emplean procedimientos cromatogr&#225;ficos debido&#44; principalmente&#44; a la falta de total automatizaci&#243;n de los mismos&#44; a la necesidad de personal que previamente haya sido espec&#237;ficamente habilitado para su manejo y a su relativo elevado coste&#46; Adicionalmente&#44; existen un n&#250;mero reducido de empresas que desarrollan procedimientos cromatogr&#225;ficos para el diagn&#243;stico <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> y con la marca &#171;CE&#187;&#44; lo que obliga en muchos casos a los laboratorios cl&#237;nicos a realizar el desarrollo y la validaci&#243;n de los mismos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0185"><span class="elsevierStyleSup">7</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0010">Objeto y campo de aplicaci&#243;n</span><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El objeto de este documento es describir el proceso que deben realizar los laboratorios cl&#237;nicos para el desarrollo de los procedimientos cromatogr&#225;ficos&#46;</p><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El campo de aplicaci&#243;n de este documento abarca los procedimientos cromatogr&#225;ficos que permiten la medici&#243;n de propiedades biol&#243;gicas correspondientes a escalas racionales &#40;propiedades &#171;cuantitativas&#187;&#41; y que utilicen como principio de medida la HPLC acoplada a cualquier sistema de detecci&#243;n&#46;</p><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En este documento son aplicables los t&#233;rminos y definiciones relacionados con la cromatograf&#237;a recogidos en las diferentes gu&#237;as internacionales de la Federaci&#243;n Internacional de Qu&#237;mica Pura y Aplicada &#40;IUPAC&#41;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0190"><span class="elsevierStyleSup">8&#8211;11</span></a>&#44; el Instituto para la Normalizaci&#243;n de Laboratorios Cl&#237;nicos &#40;CLSI&#41;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0210"><span class="elsevierStyleSup">12&#44;13</span></a>&#44; la Agencia Europea del Medicamento &#40;EMA&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0220"><span class="elsevierStyleSup">14</span></a> y la Administraci&#243;n de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos &#40;FDA&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0225"><span class="elsevierStyleSup">15</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0015">Desarrollo de procedimientos de medida cromatogr&#225;ficos</span><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Existen diferentes aspectos que deben considerarse en el desarrollo de un procedimiento cromatogr&#225;fico que se inicia con la recogida de informaci&#243;n sobre el analito a estudiar hasta el proceso final de validaci&#243;n del mismo<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">16&#8211;25</span></a>&#46; En este apartado se describen las principales etapas necesarias para el desarrollo de un procedimiento cromatogr&#225;fico&#46;</p><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0020">Descripci&#243;n y recopilaci&#243;n de informaci&#243;n relacionada con el analito</span><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El primer aspecto a considerar es recoger toda la informaci&#243;n relacionada con el analito a estudiar&#44; como la estructura qu&#237;mica&#44; la masa molar&#44; la polaridad&#44; la solubilidad y la constante de disociaci&#243;n &#225;cida &#40;pKa&#41;&#44; entre otros&#46; Esta informaci&#243;n es importante para la selecci&#243;n de las condiciones cromatogr&#225;ficas y el tipo de sistema de detecci&#243;n a emplear&#46;</p><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El conocimiento de la masa molar del analito es imprescindible cuando se trabaja con la HPLC acoplada a la espectrometr&#237;a de masas &#40;HPLC-MS&#41; o a la espectrometr&#237;a de masas en t&#225;ndem &#40;HPLC-MS&#47;MS&#41;&#44; ya que se basan principalmente en la obtenci&#243;n de iones a partir de mol&#233;culas en fase gaseosa que son posteriormente separados seg&#250;n su relaci&#243;n masa&#47;carga&#46;</p><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Existen diversos recursos en Internet &#40;webs&#41; que permiten conocer las principales propiedades fisico-qu&#237;micas de un analito&#46; Son un ejemplo&#58;<ul class="elsevierStyleList" id="lis0005"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0005"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La base de datos <span class="elsevierStyleItalic">PubChem</span> del Instituto Nacional de la Salud de los Estados Unidos&#58; <a id="intr0005" class="elsevierStyleInterRef" href="https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/">https&#58;&#47;&#47;pubchem&#46;ncbi&#46;nlm&#46;nih&#46;gov&#47;</a></p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0010"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La base de datos <span class="elsevierStyleItalic">ChemSpider</span> de la Real Sociedad de Qu&#237;mica&#58; <a id="intr0010" class="elsevierStyleInterRef" href="http://www.chemspider.com/">http&#58;&#47;&#47;www&#46;chemspider&#46;com&#47;</a></p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0015"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las bases de datos <span class="elsevierStyleItalic">ChEMBL</span> y <span class="elsevierStyleItalic">ChEBI</span> del Instituto Europeo de Bioinform&#225;tica&#58; <a id="intr0015" class="elsevierStyleInterRef" href="https://www.ebi.ac.uk/chembl/">https&#58;&#47;&#47;www&#46;ebi&#46;ac&#46;uk&#47;chembl&#47;</a></p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0020"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><a id="intr0020" class="elsevierStyleInterRef" href="http://www.ebi.ac.uk/chebi/downloadsForward.do">http&#58;&#47;&#47;www&#46;ebi&#46;ac&#46;uk&#47;chebi&#47;downloadsForward&#46;do</a></p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0025"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La base de datos <span class="elsevierStyleItalic">ZINC</span> de la Universidad de California&#44; San Francisco&#44; Estados Unidos&#58; <a id="intr0025" class="elsevierStyleInterRef" href="http://zinc.docking.org/">http&#58;&#47;&#47;zinc&#46;docking&#46;org&#47;</a></p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0030"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La base de datos de f&#225;rmacos <span class="elsevierStyleItalic">Drug bank</span>&#58; <a id="intr0030" class="elsevierStyleInterRef" href="http://www.drugbank.ca/">http&#58;&#47;&#47;www&#46;drugbank&#46;ca&#47;</a></p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0035"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La base de datos de f&#225;rmacos <span class="elsevierStyleItalic">ACToR</span> de la Agencia de Protecci&#243;n Ambiental de Estados Unidos&#58; <a id="intr0035" class="elsevierStyleInterRef" href="http://actor.epa.gov/actor/faces/ACToRHome.jsp">http&#58;&#47;&#47;actor&#46;epa&#46;gov&#47;actor&#47;faces&#47;ACToRHome&#46;jsp</a></p></li></ul></p></span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0025">Especificaci&#243;n y establecimiento de objetivos</span><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Antes de iniciar el desarrollo de un procedimiento cromatogr&#225;fico&#44; el laboratorio cl&#237;nico debe decidir el objetivo de las mediciones&#46; Este aspecto es fundamental para escoger el tipo de separaci&#243;n cromatogr&#225;fica a utilizar&#44; as&#237; como para conocer si el procedimiento a desarrollar ser&#225; m&#225;s o menos complejo y costoso&#46; Los principales aspectos a considerar son<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">16&#8211;21</span></a>&#58;<ul class="elsevierStyleList" id="lis0010"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0040"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0090" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Decidir si el procedimiento va a ser empleado para la caracterizaci&#243;n o cuantificaci&#243;n de uno o varios analitos de una muestra desconocida&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0045"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Establecer si el objetivo principal va a ser la medici&#243;n de la concentraci&#243;n del analito o solo conocer la presencia del mismo en una muestra determinada &#40;&#171;determinaci&#243;n cualitativa&#187;&#41;&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0050"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Determinar el n&#250;mero de analitos a estudiar&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0055"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Decidir si ser&#225; necesario separar todos los componentes de la muestra&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0060"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Conocer con qu&#233; tipo de espec&#237;menes se va a trabajar &#40;p&#46; ej&#46;&#58; plasma&#44; orina&#44; suero&#44; etc&#46;&#41;&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0065"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Conocer la carga de trabajo aproximada de las muestras que van a ser procesadas&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0070"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Establecer la periodicidad del procesamiento de las muestras &#40;p&#46; ej&#46;&#58; diaria&#44; quincenal&#44; mensual&#44; etc&#46;&#41;&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0075"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0125" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Tener en cuenta el tipo de cromat&#243;grafo l&#237;quido de alta eficacia y el sistema de detecci&#243;n con el que cuenta el laboratorio&#46;</p></li></ul></p></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0030">Preparaci&#243;n y tratamiento de la muestra</span><p id="par0130" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El tratamiento y la preparaci&#243;n de las muestras biol&#243;gicas es un proceso esencial&#46; Su importancia radica en la necesidad de concentrarla o eliminar los distintos componentes de la muestra que pueden interferir y obtener as&#237;&#44; una apropiada separaci&#243;n y eficacia cromatogr&#225;ficas&#46; La presencia de prote&#237;nas&#44; l&#237;pidos&#44; sales y componentes celulares pueden interferir en la medici&#243;n de la magnitud en estudio &#40;obtenci&#243;n de se&#241;ales err&#243;neas en el detector y picos cromatogr&#225;ficos asim&#233;tricos&#44; resoluci&#243;n inapropiada de picos cromatogr&#225;ficos&#44; falta de reproducibilidad de los tiempos de retenci&#243;n&#44; una menor capacidad de detecci&#243;n&#44; etc&#46;&#41;&#44; as&#237; como condicionar el buen funcionamiento del sistema cromatogr&#225;fico &#40;obstrucci&#243;n del inyector&#44; fritas &#40;p&#46; ej&#46; ubicadas en la entrada de la columna&#41;&#44; detector&#44; c&#225;nulas&#44; tubos&#44; v&#225;lvulas&#44; etc&#46;&#41;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0215"><span class="elsevierStyleSup">13&#44;14&#44;17&#8211;21</span></a>&#46;</p><p id="par0135" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los principales procedimientos de preparaci&#243;n de la muestra son la filtraci&#243;n&#44; la centrifugaci&#243;n&#44; la diluci&#243;n e inyecci&#243;n&#44; la precipitaci&#243;n de prote&#237;nas&#44; la extracci&#243;n l&#237;quido-l&#237;quido y la extracci&#243;n en fase s&#243;lida&#46; La elecci&#243;n de un procedimiento u otro depender&#225; del tipo de muestra biol&#243;gica con la que se trabaje y de las propiedades f&#237;sico-qu&#237;micas del analito&#44; siendo incluso necesario&#44; algunas veces&#44; la combinaci&#243;n de dos o m&#225;s de estos procedimientos&#46;</p><p id="par0140" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Pese a las ventajas que supone la aplicaci&#243;n de estos procedimientos&#44; la mayor&#237;a de ellos pueden dar lugar a una p&#233;rdida parcial del analito y&#44; por otro lado&#44; no todos permiten eliminar totalmente los diferentes interferentes de la muestra&#46;</p><span id="sec0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0035">Diluci&#243;n e inyecci&#243;n</span><p id="par0145" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Es el procedimiento m&#225;s simple y se suele emplear para las muestras biol&#243;gicas relativamente poco complejas &#40;orina&#44; l&#237;quido cefalorraqu&#237;deo&#41;&#46; Consiste en diluir la muestra con un disolvente adecuado e inyectar la muestra diluida en el sistema cromatogr&#225;fico&#46; Este procedimiento permite reducir el posible efecto negativo de los distintos interferentes de la muestra sobre la medici&#243;n de la magnitud en estudio pero&#44; al no eliminarlos&#44; pueden acumularse en el sistema cromatogr&#225;fico y provocar un mal funcionamiento del mismo a lo largo del tiempo&#46;</p></span><span id="sec0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0040">Precipitaci&#243;n de prote&#237;nas</span><p id="par0150" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Es el procedimiento m&#225;s empleado debido a su simplicidad y al reducido n&#250;mero de reactivos que requiere&#46; Consiste en adicionar un reactivo qu&#237;mico particular que reduce notablemente la solubilidad de las prote&#237;nas en la muestra haciendo que precipiten&#46; Posteriormente&#44; este precipitado es eliminado por filtraci&#243;n o centrifugaci&#243;n dejando un sobrenadante que es inyectado directamente al sistema cromatogr&#225;fico&#46; Adicionalmente&#44; si se requiere&#44; el sobrenadante puede ser diluido con un tamp&#243;n o un disolvente apropiado &#40;habitualmente la fase m&#243;vil&#41; o evaporado &#40;p&#46; ej&#46; empleando nitr&#243;geno&#41; hasta la sequedad y seguidamente diluido con un tamp&#243;n o un disolvente apropiado&#46;</p><p id="par0155" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Dependiendo del reactivo de precipitaci&#243;n utilizado&#44; de las condiciones experimentales y de las propiedades fisico-qu&#237;micas de los componentes de la muestra&#44; se pueden llegar a eliminar hasta el 98&#37; de las prote&#237;nas de la muestra&#46;</p><p id="par0160" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El procedimiento de precipitaci&#243;n de prote&#237;nas m&#225;s ampliamente utilizado se basa en la adici&#243;n de un disolvente org&#225;nico &#40;principalmente acetonitrilo o metanol&#41; a la muestra en una proporci&#243;n determinada &#8212;4&#58;1&#44; 3&#58;1 &#40;la m&#225;s empleada&#41;&#44; 2&#58;1&#8212;&#46; Tambi&#233;n se usan otros reactivos qu&#237;micos &#40;p&#46; ej&#46;&#58; &#225;cido tricloroac&#233;tico&#44; hidr&#243;xido de zinc&#44; sulfato de zinc o cloruro de magnesio&#41;&#44; individualmente o conjuntamente con disolventes org&#225;nicos&#46;</p><p id="par0165" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Hay que tener presente que en este procedimiento tambi&#233;n se diluye el analito y&#44; adem&#225;s&#44; no se eliminan todos los componentes de la muestra &#40;&#250;nicamente se eliminan la mayor&#237;a de las prote&#237;nas y los componentes celulares&#41;&#44; quedando en el sobrenadante otros componentes &#8212;sales y l&#237;pidos&#8212; que pueden interferir en la medici&#243;n de la magnitud biol&#243;gica o en el buen funcionamiento del sistema cromatogr&#225;fico&#46; En determinados casos&#44; puede ser necesario realizar otros procedimientos de extracci&#243;n que permitan reducir estos componentes biol&#243;gicos&#46;</p></span></span><span id="sec0045" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0045">Extracci&#243;n l&#237;quido-l&#237;quido</span><p id="par0170" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La extracci&#243;n l&#237;quido-l&#237;quido es un procedimiento de preparaci&#243;n de la muestra que se fundamenta en la transferencia del analito entre dos l&#237;quidos inmiscibles &#40;fase acuosa y fase org&#225;nica&#41;&#44; la cual depende de su solubilidad entre ambos l&#237;quidos&#46; De modo general&#44; a la muestra que contiene el analito &#40;fase acuosa&#41; se adiciona un l&#237;quido org&#225;nico inmiscible &#40;fase org&#225;nica&#41; que act&#250;a como extractante&#46; Despu&#233;s de un periodo de agitaci&#243;n&#44; el analito se distribuye entre las dos fases hasta alcanzar una situaci&#243;n de equilibrio&#46; Seguidamente&#44; se deja reposar el sistema el tiempo necesario para que se produzca la separaci&#243;n de las fases o bien se centrifuga&#46; La transferencia del analito se rige por la ley de distribuci&#243;n de Nernst que establece que&#44; a presi&#243;n y temperatura constantes&#44; la relaci&#243;n de concentraci&#243;n de un analito entre dos fases inmiscibles es constante&#46; Esta ley se materializa con la constante de distribuci&#243;n &#40;K<span class="elsevierStyleInf"><span class="elsevierStyleItalic">D</span></span>&#41;&#58;<elsevierMultimedia ident="eq0005"></elsevierMultimedia></p><p id="par0175" class="elsevierStylePara elsevierViewall">donde &#91;A&#93;<span class="elsevierStyleInf"><span class="elsevierStyleItalic">o</span></span> representa la concentraci&#243;n de analito en la fase org&#225;nica y &#91;A&#93;<span class="elsevierStyleInf"><span class="elsevierStyleItalic">a</span></span> la concentraci&#243;n de analito en la fase acuosa&#46; Cada analito tiene un valor caracter&#237;stico de K<span class="elsevierStyleInf"><span class="elsevierStyleItalic">D</span></span> para un par de disolventes concretos&#46; Cuanto mayor es la <span class="elsevierStyleItalic">K</span><span class="elsevierStyleInf"><span class="elsevierStyleItalic">D</span></span>&#44; mayor es la eficacia de la extracci&#243;n&#44; de modo que a la hora de desarrollar un procedimiento l&#237;quido-l&#237;quido se debe tener una idea clara de la polaridad del analito y de los disolventes empleados&#46; Si un analito es poco soluble en agua&#44; su extracci&#243;n se ver&#225; m&#225;s favorecida por el empleo de disolventes apolares que empleando disolventes polares&#46; Los disolventes org&#225;nicos que suelen utilizarse son hexano&#44; diclorometano&#44; 1&#44;2-dicloroetano&#44; metil-tert-butil &#233;ter&#44; entre otros&#46;</p><p id="par0180" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En este procedimiento tambi&#233;n se diluye el analito&#44; aunque puede concentrarse mediante evaporaci&#243;n del disolvente org&#225;nico y reconstituci&#243;n posterior con un disolvente apropiado&#46; Adem&#225;s&#44; no se eliminan todos los componentes de la muestra &#40;&#250;nicamente se eliminan componentes celulares&#44; las sales y algunas prote&#237;nas&#41; quedando en el sobrenadante otros componentes como los l&#237;pidos&#44; que pueden interferir en la medici&#243;n de la magnitud biol&#243;gica&#46;</p></span><span id="sec0050" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0050">Extracci&#243;n en fase s&#243;lida</span><p id="par0185" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La extracci&#243;n en fase s&#243;lida o extracci&#243;n s&#243;lido-l&#237;quido es un procedimiento en el que el analito se separa en funci&#243;n de la afinidad relativa entre la matriz de la muestra y un s&#243;lido que contiene una fase s&#243;lida &#40;sorbente&#41;&#46; La interacci&#243;n sorbente-analito puede responder a diferentes mecanismos f&#237;sico-qu&#237;micos&#44; entre los que cabe destacar la adsorci&#243;n&#44; partici&#243;n&#44; intercambio i&#243;nico&#44; exclusi&#243;n molecular&#44; afinidad o una combinaci&#243;n de ellos&#46; Esta situaci&#243;n permite que la extracci&#243;n en fase s&#243;lida sea muy vers&#225;til y selectiva&#46;</p><p id="par0190" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Generalmente&#44; comprende cinco etapas&#58;<ul class="elsevierStyleList" id="lis0015"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0080"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0195" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Activaci&#243;n o acondicionamiento de la fase s&#243;lida&#46; Consiste en la solvataci&#243;n del s&#243;lido empleando un disolvente org&#225;nico&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0085"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0200" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Equilibrado de la fase s&#243;lida&#46; En esta etapa se emplea un disolvente similar a la matriz de la muestra que permite eliminar el exceso de disolvente acondicionador&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0090"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0205" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Adici&#243;n de la muestra para conseguir la retenci&#243;n del analito por la fase s&#243;lida&#46; En este paso aquellos potenciales interferentes que no presentan afinidad alguna por la fase s&#243;lida son descartados y eliminados&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0095"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0210" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Lavado de la fase s&#243;lida&#46; En esta etapa se usa un disolvente o mezcla de disolventes para la eliminaci&#243;n selectiva de los interferentes que hayan podido quedar retenidos d&#233;bilmente a la fase s&#243;lida&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0100"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0215" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Eluci&#243;n del analito&#46; Mediante la adici&#243;n de un disolvente adecuado se consigue debilitar la interacci&#243;n y uni&#243;n del analito a la fase s&#243;lida permitiendo la recuperaci&#243;n selectiva del mismo&#46;</p></li></ul></p><p id="par0220" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En este procedimiento no se produce una diluci&#243;n de la muestra &#40;o lo hace en una proporci&#243;n baja&#41; y permite eliminar pr&#225;cticamente la totalidad de los interferentes&#44; proporcionando una mayor reproducibilidad que el resto de los procedimientos de extracci&#243;n descritos&#46;</p></span><span id="sec0055" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0055">Selecci&#243;n del tipo de cromatograf&#237;a l&#237;quida y la modalidad de trabajo</span><p id="par0225" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para llevar a cabo una adecuada separaci&#243;n y eficacia cromatogr&#225;ficas&#44; se requiere que exista un equilibrio entre las fuerzas intermoleculares de los tres participantes activos en el proceso de separaci&#243;n&#58; el analito&#44; la fase m&#243;vil y la fase estacionaria&#46; Por consiguiente&#44; cuando se desarrolla un procedimiento cromatogr&#225;fico&#44; se debe seleccionar el tipo de cromatograf&#237;a l&#237;quida &#40;de adsorci&#243;n&#44; de reparto&#44; de intercambio i&#243;nico&#44; de exclusi&#243;n molecular o de afinidad&#41; atendiendo a cu&#225;les son las interacciones que existen entre el analito y las diferentes fases<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0260"><span class="elsevierStyleSup">22&#44;23</span></a>&#46;</p><p id="par0230" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">figura 1</a> se muestra un esquema relacionado con la selecci&#243;n del tipo de cromatograf&#237;a l&#237;quida en funci&#243;n de las propiedades f&#237;sico-qu&#237;micas del analito&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia><p id="par0235" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En la cromatograf&#237;a de reparto&#44; existen dos modalidades cromatogr&#225;ficas de trabajo&#44; la cromatograf&#237;a en fase normal y la cromatograf&#237;a en fase inversa&#46; La cromatograf&#237;a en fase normal se caracteriza por utilizar una fase m&#243;vil apolar o poco polar y una fase estacionaria polar&#46; En esta modalidad&#44; los analitos m&#225;s polares quedan m&#225;s retenidos en la fase estacionaria mientras que los menos polares eluyen primero&#46; Por el contrario&#44; en la cromatograf&#237;a en fase inversa se emplean fases m&#243;viles polares y fases estacionarias apolares o poco polares&#46; En este caso&#44; los analitos m&#225;s polares eluyen en primer lugar mientras que los menos polares quedan m&#225;s retenidos&#46;</p><p id="par0240" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La cromatograf&#237;a de reparto en la modalidad de fase inversa&#44; al ser m&#225;s vers&#225;til que otros tipos de cromatograf&#237;as debido a su mecanismo de separaci&#243;n&#44; actualmente es la m&#225;s utilizada en las ciencias de laboratorio cl&#237;nico y la que deber&#237;a emplearse cuando se pretende desarrollar un procedimiento cromatogr&#225;fico&#46; Sin embargo&#44; para la separaci&#243;n de ciertos analitos &#8212;que presentan unas propiedades f&#237;sico-qu&#237;micas muy espec&#237;ficas y diferenciadas&#8212; es aconsejable emplear otros tipos de cromatograf&#237;a&#58;<ul class="elsevierStyleList" id="lis0020"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0105"><span class="elsevierStyleLabel">&#8226;</span><p id="par0245" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para analitos con elevada masa molar &#40;p&#46; ej&#46;&#44; macromol&#233;culas como enzimas y prote&#237;nas&#41;&#44; es aconsejable utilizar la cromatograf&#237;a de exclusi&#243;n molecular&#44; aunque esta dar&#225; lugar a una menor resoluci&#243;n cromatogr&#225;fica&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0110"><span class="elsevierStyleLabel">&#8226;</span><p id="par0250" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para analitos que son iones inorg&#225;nicos &#40;p&#46; ej&#46;&#44; hierro&#44; zinc&#44; nitritos&#44; nitratos&#41; o analitos f&#225;cilmente ionizables &#40;p&#46; ej&#46;&#44; aminas bi&#243;genas&#44; hemoglobinas&#41;&#44; es preferible emplear la cromatograf&#237;a de intercambio i&#243;nico&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0115"><span class="elsevierStyleLabel">&#8226;</span><p id="par0255" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para analitos que presentan varios estereois&#243;meros y presentan una polaridad elevada&#44; es preferible emplear la cromatograf&#237;a de adsorci&#243;n&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0120"><span class="elsevierStyleLabel">&#8226;</span><p id="par0260" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para analitos que no pueden ser separados por otros tipos de cromatograf&#237;a o bien son susceptibles de ser separados mediante reacciones biol&#243;gicas espec&#237;ficas del tipo ant&#237;geno-anticuerpo &#40;p&#46; ej&#46;&#44; inmunoglobulinas&#41;&#44; enzima-sustrato &#40;p&#46; ej&#46;&#44; enzimas&#41;&#44; entre otras&#44; es preferible emplear la cromatograf&#237;a de afinidad&#46;</p></li></ul></p></span><span id="sec0060" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0060">Elecci&#243;n del sistema de detecci&#243;n cromatogr&#225;fico</span><p id="par0265" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La elecci&#243;n del sistema cromatogr&#225;fico depender&#225;&#44; entre otros factores&#44; de la naturaleza qu&#237;mica del analito a estudiar &#40;es decir&#44; de sus propiedades f&#237;sico-qu&#237;micas&#41;&#44; de las posibles interferencias que puedan existir despu&#233;s del proceso de preparaci&#243;n de la muestra&#44; de la capacidad de detecci&#243;n &#40;detectabilidad&#41; que se requiera y de los detectores cromatogr&#225;ficos disponibles en el laboratorio cl&#237;nico<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">16&#8211;24</span></a>&#46;</p><p id="par0270" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Siempre que sea posible&#44; el laboratorio cl&#237;nico deber&#237;a seleccionar detectores cromatogr&#225;ficos con elevada versatilidad&#44; tales como los de absorci&#243;n molecular&#44; los de &#237;ndice de refracci&#243;n y los espectr&#243;metros de masas&#46; Generalmente&#44; los detectores cromatogr&#225;ficos de absorci&#243;n molecular suelen ser los m&#225;s empleados dada la naturaleza org&#225;nica de los analitos que se estudian en los laboratorios<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">16&#8211;24</span></a>&#46; Adem&#225;s&#44; suelen tener un coste asumible&#46; En el caso de que los analitos no absorban la radiaci&#243;n electromagn&#233;tica o presenten una baja absorci&#243;n &#40;p&#46; ej&#46;&#58; gl&#250;cidos&#44; &#225;cidos grasos y algunos l&#237;pidos&#41;&#44; es recomendable utilizar los detectores de &#237;ndice de refracci&#243;n&#46; Este tipo de detectores presentan una menor sensibilidad metrol&#243;gica&#44; capacidad de detecci&#243;n y selectividad que los de absorci&#243;n&#44; y su coste suele ser similar&#46; Adem&#225;s&#44; estos no permiten trabajar en la modalidad en gradiente&#46;</p><p id="par0275" class="elsevierStylePara elsevierViewall">De todos estos detectores&#44; el m&#225;s vers&#225;til y selectivo es el espectr&#243;metro de masas ya que&#44; al basarse en la medici&#243;n de propiedades de la materia como la masa y la carga&#44; permite pr&#225;cticamente la detecci&#243;n de cualquier tipo de analito&#46; Su principal desventaja es su elevado coste<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">16&#8211;24</span></a>&#46;</p><p id="par0280" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Adem&#225;s de los detectores mencionados&#44; existen otros que son m&#225;s selectivos&#44; sensibles y con una mayor capacidad de detecci&#243;n &#40;aunque menos que los espectr&#243;metros de masas&#41;&#44; como son los detectores de fluorescencia y los electroqu&#237;micos&#46; Los detectores de fluorescencia son los que presentan mayor sensibilidad y capacidad de detecci&#243;n<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">16&#8211;24</span></a>&#46; No obstante&#44; para poder utilizar un detector de fluorescencia es necesario que los analitos presenten la capacidad de emitir fluorescencia o bien&#44; que la emitan cuando se les hace reaccionar con otras sustancias qu&#237;micas&#46; Los detectores electroqu&#237;micos es recomendable emplearlos cuando se estudian analitos con propiedades oxidantes o reductoras&#44; como por ejemplo las aminas bi&#243;genas &#40;catecolaminas&#44; metanefrinas&#44; vanilmandelato&#44; 5-hidroxiindolilacetato&#44; entre otras&#41;&#46; Este tipo de detectores han de ser utilizados con precauci&#243;n ya que presentan una elevada sensibilidad y suelen ser susceptibles a interferencias el&#233;ctricas producidas por la propia fuente de alimentaci&#243;n el&#233;ctrica&#46; El coste de los detectores fluorim&#233;tricos y electroqu&#237;micos suele ser similar o ligeramente superior a los de absorci&#243;n o de &#237;ndice de refracci&#243;n<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">16&#8211;24</span></a>&#46;</p></span><span id="sec0065" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0065">Optimizaci&#243;n de la separaci&#243;n cromatogr&#225;fica</span><p id="par0285" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Durante el proceso de optimizaci&#243;n de la separaci&#243;n cromatogr&#225;fica&#44; adem&#225;s de la necesidad de conocer las propiedades f&#237;sico-qu&#237;micas del analito&#44; deben considerarse diferentes aspectos relacionados con la fase m&#243;vil y la fase estacionaria<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0230"><span class="elsevierStyleSup">16&#8211;21</span></a> que se describen a continuaci&#243;n&#46;</p><span id="sec0070" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0070">Composici&#243;n de la fase m&#243;vil</span><p id="par0290" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El conocimiento de la polaridad del analito permite seleccionar los disolventes a emplear en la fase m&#243;vil&#46; As&#237;&#44; la selecci&#243;n de la fase m&#243;vil debe llevarse a cabo en base a su solubilidad con el analito&#46; Adem&#225;s&#44; el analito no debe reaccionar con ninguna de las sustancias que componen el disolvente&#46;</p><p id="par0295" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Existe una estrecha relaci&#243;n entre el tiempo de retenci&#243;n o eluci&#243;n de los analitos con la composici&#243;n de la fase m&#243;vil como consecuencia del efecto de la polaridad&#46; De hecho&#44; en la HPLC de reparto de fase inversa&#44; el tiempo de eluci&#243;n de los analitos puede ser alterado modificando la polaridad de la fase m&#243;vil&#44; es decir&#44; variando el tipo de disolventes a utilizar y el porcentaje empleado de cada uno de ellos&#46; Esta es la manera m&#225;s sencilla para intentar mejorar la resoluci&#243;n cromatogr&#225;fica de dos componentes de una muestra cuyos picos cromatogr&#225;ficos se solapan&#44; o para disminuir el tiempo global de separaci&#243;n de los componentes cuando estos presentan tiempos de retenci&#243;n muy diferentes&#46;</p><p id="par0300" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Un adecuado punto de partida para optimizar la separaci&#243;n cromatogr&#225;fica ser&#237;a emplear una mezcla de agua y un disolvente org&#225;nico polar &#40;metanol o acetonitrilo&#41;&#44; con una mayor proporci&#243;n de agua &#40;p&#46; ej&#46;&#58; cercano al 100&#37;&#41;&#44; y observar c&#243;mo var&#237;an los tiempos de eluci&#243;n y la resoluci&#243;n de los analitos al disminuir la proporci&#243;n acuosa y aumentar la proporci&#243;n del disolvente org&#225;nico&#46;</p></span><span id="sec0075" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0075">pH de la fase m&#243;vil</span><p id="par0305" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El ajuste del pH de la fase m&#243;vil y el conocimiento del pKa del analito tienen un papel muy importante para establecer las condiciones cromatogr&#225;ficas iniciales y su posterior optimizaci&#243;n&#46; La selecci&#243;n de un pH adecuado dar&#225; lugar a que el analito est&#233; o no ionizado y&#44; a menudo&#44; esta situaci&#243;n conducir&#225; a la obtenci&#243;n de picos sim&#233;tricos&#44; estrechos y puntiagudos en el proceso cromatogr&#225;fico&#46; La obtenci&#243;n de este tipo de picos es necesaria cuando la cromatograf&#237;a es utilizada con una finalidad cuantitativa&#44; ya que permitir&#225; obtener mejores propiedades metrol&#243;gicas &#40;l&#237;mites de detecci&#243;n y cuantificaci&#243;n m&#225;s bajos&#44; menores valores de imprecisi&#243;n y sesgo&#41;&#44; as&#237; como tiempos de retenci&#243;n cromatogr&#225;ficos reproducibles&#46;</p><p id="par0310" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las soluciones tamp&#243;n deben a&#241;adirse a la fase m&#243;vil cuando el analito es un compuesto con propiedades i&#243;nicas&#46; En la HPLC de reparto de fase inversa&#44; los analitos de una muestra se separan en funci&#243;n de su polaridad de forma que los menos polares son m&#225;s retenidos por la columna y viceversa&#46; Cuando se ioniza un analito&#44; aumenta su polaridad y&#44; en consecuencia&#44; presentar&#225; una menor retenci&#243;n en la columna&#46; Los analitos de naturaleza &#225;cida se ionizan cuando el pH es superior a su pKa y los analitos de naturaleza b&#225;sica&#44; cuando el pH es inferior a su pKa&#46; As&#237;&#44; se obtendr&#225; una mayor retenci&#243;n en la columna para los analitos &#225;cidos cuando se trabaje a pH &#225;cido y por debajo de su pKa&#59; y una mayor retenci&#243;n tambi&#233;n a pH b&#225;sico y por encima de su pKa para los analitos b&#225;sicos&#46; La relaci&#243;n entre el analito ionizado y no ionizado &#8212;a un pH determinado&#8212; puede conocerse mediante la ecuaci&#243;n de Henderson-Hasselbach&#46;</p><p id="par0315" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Teniendo en cuenta todas estas consideraciones&#44; para obtener una mayor retenci&#243;n del analito y&#44; en consecuencia&#44; unos picos cromatogr&#225;ficos aceptables y una reproducibilidad adecuada&#44; debe ajustarse el pH de la fase m&#243;vil dos unidades por debajo del pKa del analito&#44; si este es de naturaleza &#225;cida&#44; y dos unidades por encima del pKa del analito si es de naturaleza b&#225;sica&#46; En estas condiciones&#44; el 99&#37; del analito no estar&#225; ionizado&#46;</p><p id="par0320" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las principales soluciones tamp&#243;n y sus correspondientes pKa &#40;a 25<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#41; se muestran en la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">tabla 1</a> El efecto &#243;ptimo de amortiguaci&#243;n de cada tamp&#243;n se obtiene para el intervalo de pH comprendido entre pKa<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#177;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>1&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia><p id="par0325" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Un aspecto a tener en cuenta durante la selecci&#243;n de una soluci&#243;n tamp&#243;n es el sistema de detecci&#243;n con el que se va a trabajar&#46; Si se emplea un sistema de absorci&#243;n molecular en la zona del espectro visible&#44; cualquiera de las soluciones tamp&#243;n mencionadas puede ser utilizada&#44; pero si se trabaja en la zona del ultravioleta&#44; las soluciones tamp&#243;n de citrato no son recomendables a no ser que se trabaje a longitudes de onda por encima de 230<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>nm&#46; De todos los tampones citados&#44; los tampones fosfato son los m&#225;s ampliamente empleados en la HPLC acoplada a la espectrometr&#237;a de absorci&#243;n molecular&#44; dadas sus propiedades absortivas y amortiguadoras&#46; Por otra parte&#44; si se emplean sistemas de detecci&#243;n basados en la espectrometr&#237;a de masas&#44; deben utilizarse tampones vol&#225;tiles &#40;p&#46; ej&#46;&#58; acetato de amonio&#44; formiato de amonio y trietilamina&#41; y evitar el uso de tampones no vol&#225;tiles &#40;p&#46; ej&#46;&#58; fosfato y citrato&#41;&#46;</p><p id="par0330" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Otra consideraci&#243;n importante es la concentraci&#243;n de tamp&#243;n a utilizar&#46; La soluci&#243;n tamp&#243;n debe presentar una concentraci&#243;n suficientemente elevada como para poder controlar el pH de la fase m&#243;vil&#44; pero no excesiva para evitar la posible precipitaci&#243;n de las sales del tamp&#243;n en presencia de disolventes org&#225;nicos&#46; Habitualmente&#44; una concentraci&#243;n apropiada de la soluci&#243;n tamp&#243;n es aquella que est&#225; comprendida entre 10<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mmol&#47;l y 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mmol&#47;l&#46; Los tampones fosfato&#44; a concentraciones elevadas&#44; deben evitarse ya que pueden precipitar&#46; Este hecho se acent&#250;a si se emplea una proporci&#243;n elevada de disolvente org&#225;nico en la fase m&#243;vil &#40;&#62; 50&#37;&#41;&#46;</p></span><span id="sec0080" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0080">Modalidad de eluci&#243;n de la fase m&#243;vil</span><p id="par0335" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Por norma general&#44; una eluci&#243;n isocr&#225;tica &#8212;que mantiene constante la composici&#243;n de la fase m&#243;vil durante todo el proceso cromatogr&#225;fico&#8212; da lugar a separaciones cromatogr&#225;ficas m&#225;s reproducibles que una eluci&#243;n en gradiente &#8212;que var&#237;a la composici&#243;n de la fase m&#243;vil durante el proceso cromatogr&#225;fico&#8212;&#46; A pesar de ello&#44; trabajar en la modalidad de eluci&#243;n isocr&#225;tica presenta una serie de desventajas como son su bajo &#171;poder de separaci&#243;n&#187; &#8212;el n&#250;mero de analitos que pueden ser separados en un mismo proceso cromatogr&#225;fico&#8212; y la obtenci&#243;n de picos cromatogr&#225;ficos m&#225;s anchos en aquellos analitos que son m&#225;s retenidos en la columna&#44; afectando a la resoluci&#243;n cromatogr&#225;fica&#46; La eluci&#243;n isocr&#225;tica se emplea para separaciones simples &#8212;de uno o pocos componentes&#8212; reservando la eluci&#243;n en gradiente para separaciones de mezclas m&#225;s complejas&#44; ya que permite aumentar significativamente el &#171;poder de separaci&#243;n&#187; como consecuencia de un aumento de la eficiencia cromatogr&#225;fica &#40;disminuci&#243;n de la anchura del pico&#41;&#44; adem&#225;s de permitir disminuir el tiempo de la cromatograf&#237;a y reducir el consumo de los disolventes que conforman la fase m&#243;vil&#46;</p><p id="par0340" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Un adecuado punto de partida para optimizar la separaci&#243;n cromatogr&#225;fica ser&#237;a emplear la modalidad de eluci&#243;n isocr&#225;tica&#44; a no ser que se requiera separar un n&#250;mero elevado de analitos o bien reducir significativamente el tiempo de la cromatograf&#237;a&#44; en cuyo caso se deber&#237;a trabajar en la modalidad de eluci&#243;n en gradiente&#46;</p></span><span id="sec0085" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0085">Influencia de la temperatura de la fase m&#243;vil</span><p id="par0345" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La mayor&#237;a de los sistemas cromatogr&#225;ficos incluyen un compartimento espec&#237;fico para columnas que permite seleccionar la temperatura de trabajo de la fase m&#243;vil&#46; La temperatura influye considerablemente en diferentes par&#225;metros cromatogr&#225;ficos como la solubilidad&#44; la difusividad&#44; la viscosidad y la polaridad de la fase m&#243;vil&#46;</p><p id="par0350" class="elsevierStylePara elsevierViewall">A elevadas temperaturas &#40;&#62;40<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#41;&#44; la viscosidad de la fase m&#243;vil se reduce y la velocidad de difusi&#243;n aumenta&#44; provocando que la tasa de transferencia de masa del analito entre la fase estacionaria y la fase m&#243;vil se incremente y&#44; consecuentemente&#44; la eficacia&#44; la resoluci&#243;n y la separaci&#243;n cromatogr&#225;ficas&#46; As&#237;&#44; se puede trabajar con flujos de fase m&#243;vil ligeramente mayores que con los que se trabajar&#237;a a temperatura ambiente&#44; hecho que permite acortar sustancialmente el tiempo de an&#225;lisis sin perder eficacia&#46;</p><p id="par0355" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Un punto de partida adecuado para optimizar la separaci&#243;n cromatogr&#225;fica ser&#237;a trabajar a temperatura ambiente &#40;25-30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#41; y observar c&#243;mo var&#237;an los tiempos de eluci&#243;n y la resoluci&#243;n de los analitos al incrementar la temperatura &#40;p&#46; ej&#46;&#58; de 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C en 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#41; y el flujo de la fase m&#243;vil &#40;p&#46;ej&#46;&#58; de 0&#44;1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mL&#47;min en 0&#44;1<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mL&#47;min&#41;&#46;</p></span><span id="sec0090" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0090">Selecci&#243;n de la fase estacionaria</span><p id="par0360" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La selecci&#243;n del tipo de columna depende de la naturaleza f&#237;sico-qu&#237;mica del analito que se pretende separar&#44; del tipo y modalidad de HPLC utilizadas y de cu&#225;l sea la finalidad de la separaci&#243;n cromatogr&#225;fica&#46;</p><p id="par0365" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para la correcta selecci&#243;n de una columna anal&#237;tica deber&#237;an considerarse los siguientes aspectos&#58;</p><p id="par0620" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">1&#46; Selecci&#243;n del tama&#241;o de poro&#46;</span> La selecci&#243;n del tama&#241;o de poro depender&#225; de la masa molar del analito&#46; Debe seleccionarse un relleno de columna con un tama&#241;o de poro comprendido entre 60<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#8491; y 150<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#8491; si la masa molar del analito es inferior a&#44; aproximadamente&#44; 2&#46;000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>g&#47;mol&#46; En caso contrario&#44; debe utilizarse un relleno de columna con un tama&#241;o de poro entre 200<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#8491; y 300<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#8491;&#46;</p><p id="par0625" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">2&#46; Selecci&#243;n del empaquetado qu&#237;mico&#46;</span> En la actualidad&#44; existe una gran variedad de columnas comerciales disponibles con diferentes tipos de empaquetados qu&#237;micos &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0010">tabla 2</a>&#41;&#46; En la HPLC de reparto en fase inversa&#44; un buen punto de partida podr&#237;a ser emplear empaquetados qu&#237;micos del tipo C18 o C8&#46; Si los analitos de la muestra no se separan adecuadamente&#44; se deber&#237;an utilizar las columnas de CN y fenilo&#46; Estas pueden ofrecer diferencias significativas en selectividad frente a las fases alqu&#237;licas lineales a la hora de efectuar la separaci&#243;n&#46; En general&#44; los analitos con elevada masa molar&#44; como las prote&#237;nas&#44; se separan mejor en columnas de fase inversa con empaquetados qu&#237;micos de cadena corta &#40;C3&#44; CN&#41; y los p&#233;ptidos y los analitos con baja-media masa molar&#44; se separan mejor en columnas con empaquetados qu&#237;micos de cadenas m&#225;s largas &#40;C8&#44; C18&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0010"></elsevierMultimedia><p id="par0630" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">3&#46; Selecci&#243;n del tama&#241;o de part&#237;cula&#46;</span> El tama&#241;o de part&#237;cula est&#225;ndar es de 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m aunque tambi&#233;n pueden utilizarse tama&#241;os entre 1&#44;3<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m y 3&#44;0<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m&#46; Si es necesario realizar una separaci&#243;n cromatogr&#225;fica m&#225;s r&#225;pida o con una mayor resoluci&#243;n y eficacia es preferible utilizar columnas con un tama&#241;o de part&#237;cula de 3&#44;0<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m o menor&#46; Cabe destacar que las columnas con un tama&#241;o de part&#237;cula menor de 3&#44;0<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m operan a una presi&#243;n<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>300<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>bar y pueden utilizarse en la mayor&#237;a de cromat&#243;grafos l&#237;quidos&#46; En cambio&#44; si el tama&#241;o de part&#237;cula de la columna es<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#60;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>2&#44;0<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m&#44; se alcanzan presiones &#8805; 400<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>bar y se precisan cromat&#243;grafos l&#237;quidos que permitan soportar estas elevadas presiones&#46;</p><p id="par0635" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">4&#46; Di&#225;metro interno de la columna&#46;</span> El di&#225;metro interno de la columna define cu&#225;nto material &#40;masa o volumen&#41; se puede inyectar en la columna&#46; Cuanto menor sea el di&#225;metro&#44; menor ser&#225; la cantidad de material que se pueda inyectar manteniendo una aceptable resoluci&#243;n&#46; Las columnas m&#225;s empleadas presentan un di&#225;metro interno de 4&#44;6<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm&#46; Cabe destacar que las columnas con un di&#225;metro interno menor proporcionan una mayor capacidad de detecci&#243;n y&#44; por consiguiente&#44; suelen utilizarse en la HPLC acoplada a la espectrometr&#237;a de masas o en procedimientos cromatogr&#225;ficos desarrollados con un volumen de muestra limitado&#46;</p><p id="par0640" class="elsevierStylePara elsevierViewall"><span class="elsevierStyleItalic">5&#46; Longitud de la columna&#46;</span> Las columnas m&#225;s utilizadas presentan una longitud de 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm&#44; 150<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm o 250<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm conjuntamente con un tama&#241;o de part&#237;cula de 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m&#46; Estas condiciones proporcionan tiempos de cromatograf&#237;a comprendidos entre 20-30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>min&#46; Si se desea acortar el tiempo de cromatograf&#237;a&#44; se deben emplear columnas con una longitud menor &#40;30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm&#44; 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm o 75<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm&#41; pero con un tama&#241;o de part&#237;cula &#8804; 3&#44;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m&#46;</p></span></span><span id="sec0120" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0095">Preparaci&#243;n de soluciones y materiales diversos</span><span id="sec0125" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0100">Reactivos y disolventes</span><p id="par0395" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Un aspecto esencial cuando se trabaja con procedimientos cromatogr&#225;ficos es que los reactivos gen&#233;ricos y disolventes que se emplean para preparar la fase m&#243;vil&#44; los materiales de calibraci&#243;n o de control&#44; los est&#225;ndares internos y otras soluciones&#44; presenten una elevada pureza &#40;calidad HPLC o HPLC-MS&#41;&#46; De no ser as&#237;&#44; se puede comprometer la medici&#243;n de la magnitud en estudio &#40;separaci&#243;n&#44; resoluci&#243;n y eficacias cromatogr&#225;ficas inapropiadas que pueden dar lugar&#44; principalmente&#44; a una menor reproducibilidad y capacidad de detecci&#243;n&#41;&#44; as&#237; como condicionar el buen funcionamiento del sistema cromatogr&#225;fico &#40;obstrucci&#243;n de c&#225;nulas&#44; fritas&#44; tubos&#44; v&#225;lvulas&#44; inyectores&#44; detectores&#44; etc&#46;&#41;&#46;</p></span><span id="sec0130" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0105">Materiales de calibraci&#243;n y materiales de control</span><p id="par0400" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Siempre que sea posible&#44; es recomendable que se utilicen materiales de calibraci&#243;n y de control comerciales y que su preparaci&#243;n se realice siguiendo las instrucciones y recomendaciones descritas por el fabricante&#46; Por otra parte&#44; los materiales de calibraci&#243;n deben presentar valores trazables a una referencia adecuada<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0275"><span class="elsevierStyleSup">25</span></a>&#46; Desafortunadamente&#44; son pocas las empresas del diagn&#243;stico <span class="elsevierStyleItalic">in vitro</span> que fabrican y disponen de este tipo de materiales para sistemas cromatogr&#225;ficos por lo que&#44; en estos casos&#44; los laboratorios cl&#237;nicos deber&#225;n preparar sus propios materiales de calibraci&#243;n y de control&#46;</p><span id="sec0135" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0110">Preparaci&#243;n</span><p id="par0405" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Si el laboratorio ha de preparar los materiales de calibraci&#243;n y control&#44; debe utilizar<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0215"><span class="elsevierStyleSup">13&#44;15&#44;22&#44;23&#44;25</span></a>&#58;<ul class="elsevierStyleList" id="lis0025"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0125"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0410" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Un material de pureza conocida y que&#44; si es posible&#44; sea trazable a una referencia de la mayor calidad metrol&#243;gica posible&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0130"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0415" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Una mezcla del l&#237;quido biol&#243;gico en estudio &#40;plasma&#44; suero&#44; orina&#44; etc&#46;&#41; pero que no contenga el analito en cuesti&#243;n &#40;material de blanco&#41;&#46;</p></li></ul></p><p id="par0420" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Cabe destacar que si el analito es un componente biol&#243;gico&#44; como material de blanco se podr&#237;a utilizar una soluci&#243;n de cloruro de sodio 154<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mmol&#47;l y alb&#250;mina 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>g&#47;l&#44; una soluci&#243;n salina comercial o agua calidad HPLC o HPLC-MS&#44; siempre y cuando se conozca que el efecto matriz es m&#237;nimo o despreciable&#46; Si existe un efecto matriz significativo&#44; es recomendable utilizar una mezcla del l&#237;quido biol&#243;gico &#40;plasma&#44; suero&#44; orina&#44; etc&#46;&#41; y aplicar un procedimiento que permita compensar el efecto matriz existente&#44; por ejemplo&#44; mediante el procedimiento de la adici&#243;n est&#225;ndar&#46;</p><p id="par0425" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El n&#250;mero m&#237;nimo recomendable de materiales de calibraci&#243;n a preparar es de seis &#40;sin contar los materiales de blanco o calibradores 0&#41; y con valores que cubran el intervalo de medida en estudio&#46;</p><p id="par0430" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El n&#250;mero m&#237;nimo recomendable de materiales de control a preparar es de tres&#46; Dos de los materiales deben presentar valores por debajo &#40;&#171;control bajo&#187;&#41; y por encima &#40;&#171;control alto&#187;&#41; del intervalo de referencia&#44; intervalo terap&#233;utico o valor de decisi&#243;n cl&#237;nica &#40;valor discriminante&#41;&#44; y el tercer material debe presentar un valor intermedio o cercano al valor discriminante &#40;&#171;control medio&#187;&#41;&#46; Adem&#225;s&#44; el &#171;control bajo&#187; debe presentar un valor aproximadamente tres veces el del l&#237;mite de cuantificaci&#243;n&#46;</p><p id="par0435" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para minimizar errores&#44; es recomendable que el procedimiento de preparaci&#243;n de los materiales de calibraci&#243;n y de control se realice de la siguiente manera&#58;<ul class="elsevierStyleList" id="lis0030"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0135"><span class="elsevierStyleLabel">1&#41;</span><p id="par0440" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Preparar el material de blanco a partir de una mezcla de muestras de pacientes presuntamente sanos &#40;se recomienda utilizar un m&#237;nimo de 10 muestras&#41;&#46; Una vez realizada la mezcla&#44; debe verificarse que en la misma no existe el analito&#46; Esta verificaci&#243;n se puede llevar a cabo utilizando la informaci&#243;n cl&#237;nica de cada uno de los pacientes empleados as&#237; como&#44; procesando la muestra en el sistema cromatogr&#225;fico&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0140"><span class="elsevierStyleLabel">2&#41;</span><p id="par0445" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Preparar dos soluciones primarias del analito&#44; una para los materiales de calibraci&#243;n y otra para los materiales de control&#44; en un disolvente apropiado &#40;agua&#44; metanol&#44; acetonitrilo&#44; dimetisulf&#243;xido&#44; entre otros&#44; dependiendo de la solubilidad del analito&#41;&#46; Es necesario que las dos soluciones se preparen a partir de pesadas diferentes&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0145"><span class="elsevierStyleLabel">3&#41;</span><p id="par0450" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Preparar diferentes soluciones de trabajo &#40;seis para los materiales de calibraci&#243;n y tres para los materiales de control&#41; a partir de la correspondiente soluci&#243;n primaria del analito y del material de blanco&#46; En algunos casos&#44; debido a que los diferentes disolventes org&#225;nicos utilizados en la preparaci&#243;n de la soluci&#243;n primaria pueden provocar la precipitaci&#243;n del material de blanco empleado&#44; es preferible realizar distintas soluciones secundarias &#40;seis para los materiales de calibraci&#243;n y tres para los materiales de control&#41;&#44; en agua calidad HPLC o HPLC-MS&#44; y preparar las soluciones de trabajo a partir de estas soluciones secundarias y el material de blanco&#46;</p></li></ul></p><p id="par0455" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Siempre que sea posible&#44; deber&#237;an prepararse nuevas soluciones de trabajo para los materiales de calibraci&#243;n y de control cada vez que se realice la medici&#243;n de la magnitud en estudio&#44; a menos que se pueda garantizar que estas son estables en unas condiciones de almacenamiento determinadas &#40;p&#46; ej&#46;&#58; a -80<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#41;&#46;</p></span><span id="sec0140" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0115">Valores asignados&#46; Trazabilidad e incertidumbre de medida</span><p id="par0460" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Si el laboratorio cl&#237;nico prepara los materiales de calibraci&#243;n&#44; es responsable de asegurar la trazabilidad metrol&#243;gica de los valores asignados hasta las referencias de mayor jerarqu&#237;a metrol&#243;gica asequibles y de calcular la incertidumbre de los valores asignados&#46; Para ello&#44; debe usar la informaci&#243;n relacionada con su preparaci&#243;n&#46; Adem&#225;s&#44; la preparaci&#243;n debe realizarse utilizando instrumentos de medida &#40;pipetas&#44; matraces aforados&#44; balanzas anal&#237;ticas&#44; entre otros&#41; adecuadamente calibrados&#46;</p><p id="par0465" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La Comisi&#243;n de Metrolog&#237;a y Sistemas Anal&#237;ticos dispone de recomendaciones relacionadas con la utilizaci&#243;n de calibradores con trazabilidad metrol&#243;gica<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0275"><span class="elsevierStyleSup">25</span></a>&#44; la calibraci&#243;n de instrumentos de medida<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0280"><span class="elsevierStyleSup">26&#44;27</span></a> y de c&#243;mo debe estimarse la incertidumbre de medida<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0290"><span class="elsevierStyleSup">28</span></a>&#46;</p><p id="par0470" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En el <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0165">Material suplementario 1</a> se muestra un ejemplo pr&#225;ctico de c&#243;mo realizar la preparaci&#243;n de los materiales de calibraci&#243;n y de control&#44; el c&#225;lculo de la incertidumbre de medida de los valores asignados a los mismos&#44; as&#237; como la informaci&#243;n relativa a la trazabilidad de los resultados de medida&#46;</p></span></span><span id="sec0145" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0120">Soluciones de patrones internos</span><p id="par0475" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La utilizaci&#243;n de patrones internos es una pr&#225;ctica com&#250;n en HPLC cuando se utilizan los sistemas cromatogr&#225;ficos con una finalidad cuantitativa<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0260"><span class="elsevierStyleSup">22&#8211;24</span></a>&#46; Un patr&#243;n interno es una sustancia que se a&#241;ade a todas las muestras&#44; materiales de calibraci&#243;n y materiales de control en una cantidad conocida constante&#44; permitiendo compensar o reducir algunos errores que se puedan producir en el procedimiento de medida &#40;p&#46; ej&#46;&#58; errores atribuibles a la preparaci&#243;n de la muestra&#41; o bien que puedan afectar al sistema cromatogr&#225;fico &#40;errores en el pipeteo de muestras por parte del muestreador autom&#225;tico&#44; compensaci&#243;n de fluctuaciones en la se&#241;al anal&#237;tica que puedan producirse en el detector&#44; compensaci&#243;n de un posible efecto matriz&#44; entre otros&#41;&#46;</p><p id="par0480" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Idealmente&#44; un patr&#243;n interno deber&#237;a cumplir las siguientes caracter&#237;sticas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0215"><span class="elsevierStyleSup">13&#8211;15&#44;22&#44;23</span></a>&#58;<ul class="elsevierStyleList" id="lis0035"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0150"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0485" class="elsevierStylePara elsevierViewall">No encontrarse en la muestra a estudiar&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0155"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0490" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Presentar una composici&#243;n y estructura qu&#237;mica similar a la del analito&#46; En la HPLC-MS o HPLC-MS&#47;MS&#44; siempre que sea posible&#44; deber&#237;a utilizarse el propio analito marcado con is&#243;topos estables &#40;<span class="elsevierStyleSup">2</span>H&#44; <span class="elsevierStyleSup">13</span>C&#44; <span class="elsevierStyleSup">15</span>N&#44; entre otros&#41;&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0160"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0495" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Presentar una elevada pureza&#46; Adem&#225;s&#44; se deber&#237;an conocer cu&#225;les son sus impurezas&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0165"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0500" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Ser suficientemente estable en soluci&#243;n como para garantizar que no se degradar&#225; durante los procesos de preparaci&#243;n de la muestra y de separaci&#243;n cromatogr&#225;fica&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0170"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0505" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Proporcionar una se&#241;al suficiente en el detector cromatogr&#225;fico&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0175"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0510" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Presentar una resoluci&#243;n cromatogr&#225;fica claramente diferenciada del analito&#46; Esta caracter&#237;stica no es necesaria si se emplea un espectr&#243;metro de masas como detector cromatogr&#225;fico&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0180"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0515" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Eluir despu&#233;s del analito&#44; de tal manera que permita confirmar que la separaci&#243;n cromatogr&#225;fica se ha producido correctamente&#46; Si se utiliza un espectr&#243;metro de masas como detector cromatogr&#225;fico&#44; es suficiente &#8212;incluso necesario la mayor&#237;a de las veces&#8212; que el analito eluya al mismo tiempo de retenci&#243;n que el patr&#243;n interno&#46;</p></li></ul></p><p id="par0520" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Siempre que sea posible&#44; es recomendable que se empleen patrones internos comerciales y que su preparaci&#243;n se realice siguiendo las instrucciones y recomendaciones descritas por el fabricante&#46; En caso contrario&#44; su preparaci&#243;n puede realizarse de la siguiente manera<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0215"><span class="elsevierStyleSup">13&#8211;15&#44;22&#44;23</span></a>&#58;<ul class="elsevierStyleList" id="lis0040"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0185"><span class="elsevierStyleLabel">1&#41;</span><p id="par0525" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Preparar una soluci&#243;n primaria de patr&#243;n interno en un disolvente apropiado &#40;agua&#44; metanol&#44; acetonitrilo&#44; dimetilsulf&#243;xido&#44; entre otros&#44; dependiendo de la solubilidad del mismo&#41;&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0190"><span class="elsevierStyleLabel">2&#41;</span><p id="par0530" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Preparar&#44; a partir de la soluci&#243;n primaria&#44; una soluci&#243;n de trabajo de patr&#243;n interno&#44; en un disolvente apropiado&#44; que produzca una se&#241;al anal&#237;tica suficiente y estable en el detector cromatogr&#225;fico&#46; Es recomendable preparar una soluci&#243;n de trabajo a una concentraci&#243;n similar a la que tendr&#237;a el analito a valores fisiol&#243;gicos&#44; dentro del intervalo de referencia o terap&#233;utico o cercanos al valor discriminante&#46;</p></li></ul></p><p id="par0535" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Siempre que sea posible&#44; se deber&#237;a preparar una soluci&#243;n de trabajo de patr&#243;n interno nueva cada vez que se realice la medici&#243;n de la magnitud en estudio&#44; a no ser que se pueda garantizar que esta es estable en unas condiciones de almacenamiento determinadas &#40;p&#46; ej&#46;&#58; a -80<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#41;&#46;</p><p id="par0540" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En el <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0165">Material suplementario 2</a> se muestra un ejemplo pr&#225;ctico de c&#243;mo llevar a la selecci&#243;n de un patr&#243;n interno y c&#243;mo realizar la preparaci&#243;n de la soluci&#243;n de trabajo del patr&#243;n interno&#46;</p></span></span><span id="sec0150" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0125">Calibraci&#243;n</span><p id="par0545" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los principales procedimientos de calibraci&#243;n empleados en la HPLC son los del patr&#243;n externo&#44; del patr&#243;n interno &#40;el m&#225;s utilizado&#41;&#44; de normalizaci&#243;n de &#225;reas y de la adici&#243;n est&#225;ndar<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0260"><span class="elsevierStyleSup">22&#8211;24</span></a>&#46;</p><p id="par0550" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El proceso de calibraci&#243;n y la obtenci&#243;n de la curva de calibraci&#243;n est&#225; sujeto a una serie de condiciones<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0215"><span class="elsevierStyleSup">13&#8211;15</span></a>&#58;<ul class="elsevierStyleList" id="lis0045"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0195"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0555" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La curva de calibraci&#243;n debe estar definida por un m&#237;nimo de seis materiales de calibraci&#243;n&#46; Adicionalmente&#44; han de prepararse dos materiales de blanco&#44; uno que no contenga ni el analito en estudio ni el est&#225;ndar interno &#40;si se emplea&#41;&#44; y otro que solo contenga el est&#225;ndar interno &#40;si se utiliza&#41;&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0200"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0560" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El material de calibraci&#243;n que presenta el valor m&#225;s bajo de la magnitud en estudio &#40;calibrador 1&#41; debe presentar un valor cercano al l&#237;mite de cuantificaci&#243;n&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0205"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0565" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El material de calibraci&#243;n que presenta el valor m&#225;s alto de la magnitud en estudio &#40;calibrador 6&#41; debe coincidir con el l&#237;mite superior del intervalo de medida previamente seleccionado&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0210"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0570" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los materiales de calibraci&#243;n y los materiales de blanco deben procesarse por duplicado&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0215"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0575" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Siempre que sea posible&#44; la curva de calibraci&#243;n debe estar representada por la ecuaci&#243;n de una l&#237;nea recta&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0220"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0580" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se puede utilizar cualquier algoritmo matem&#225;tico que permita ajustar la curva de calibraci&#243;n &#40;regresi&#243;n lineal&#44; polin&#243;mica&#44; m&#250;ltiple&#44; rec&#237;proca&#44; logar&#237;tmica&#44; exponencial&#44; entre otros&#41;&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0225"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0585" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los valores obtenidos en los materiales de blanco no deben considerarse durante la realizaci&#243;n del ajuste matem&#225;tico que representar&#225; la curva de calibraci&#243;n&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0230"><span class="elsevierStyleLabel">-</span><p id="par0590" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para cada material de calibraci&#243;n procesado&#44; debe calcularse la diferencia relativa porcentual entre el valor obtenido mediante el ajuste matem&#225;tico &#40;valor obtenido&#41; y su correspondiente valor asignado dividido por el valor asignado&#46; Esta diferencia debe estar comprendida entre<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#177;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>15&#37;&#44; excepto para el calibrador 1 &#40;calibrador con un valor cercano al l&#237;mite de cuantificaci&#243;n&#41; donde esta diferencia puede estar comprendida entre<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#177;<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>20&#37;&#46; Como m&#237;nimo&#44; para el 75&#37; de los materiales de calibraci&#243;n procesados debe cumplirse esta condici&#243;n&#46; Adem&#225;s&#44; entre los duplicados de un mismo material de calibraci&#243;n&#44; al menos uno de ellos debe cumplir este requisito&#46;</p></li></ul></p><p id="par0595" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Si alguno de los materiales de calibraci&#243;n no cumple estas condiciones&#44; el valor obtenido para el mismo debe eliminarse&#44; volver a realizar el ajuste de la curva de calibraci&#243;n&#44; calcular de nuevo las distintas diferencias relativas porcentuales y comprobar el cumplimiento de dichas condiciones&#46;</p></span><span id="sec0155" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0130">Validaci&#243;n del procedimiento de medida desarrollado</span><p id="par0600" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Una vez desarrollado el procedimiento cromatogr&#225;fico&#44; el laboratorio cl&#237;nico debe llevar a cabo una validaci&#243;n del mismo antes de ser utilizado con muestras de pacientes&#44; con el objeto de confirmar que este ser&#225; adecuado para sus aplicaciones cl&#237;nicas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0295"><span class="elsevierStyleSup">29&#44;30</span></a>&#46;</p><p id="par0605" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En el <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#sec0165">Material suplementario 3</a>&#44; se muestra un ejemplo que contiene los principales aspectos a considerar en el desarrollo de un procedimiento cromatogr&#225;fico&#46;</p></span></span></span>"
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                  \t\t\t\t" class=""><thead title="thead"><tr title="table-row"><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Soluci&#243;n tamp&#243;n&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">pKa&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Longitud de onda &#40;nm&#41; de absorci&#243;n&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " rowspan="2" align="left" valign="top">Formiato de amonio</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">3&#44;8&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " rowspan="2" align="left" valign="top">210</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">9&#44;2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " rowspan="2" align="left" valign="top">Acetato de amonio</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">4&#44;8&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " rowspan="2" align="left" valign="top">210</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">9&#44;2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">&#193;cido c&#237;trico&#47;citrato monob&#225;sico&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">3&#44;1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " rowspan="3" align="left" valign="top">230</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Citrato monob&#225;sico&#47;citrato dib&#225;sico&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">4&#44;7&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Citrato dib&#225;sico&#47;citrato trib&#225;sico&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">5&#44;4&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">&#193;cido fosf&#243;rico&#47;dihidr&#243;geno fosfato&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">2&#44;1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " rowspan="3" align="left" valign="top">&#60;200</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Dihidr&#243;geno fosfato&#47;hidr&#243;geno fosfato&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">7&#44;2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Hidr&#243;geno fosfato&#47;fosfato&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">12&#44;3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Tricloroacetato&#47;&#225;cido tricloroac&#233;tico&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#60;2&#44;0&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">210&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Formiato&#47;&#225;cido f&#243;rmico&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">3&#44;8&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">210&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Acetato&#47;&#225;cido ac&#233;tico&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">4&#44;8&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">210&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Tris-&#40;hidroximetil&#41;-aminometano&#47;<br>ion Tris-&#40;hidroximetilinio&#41;-aminometano&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">8&#44;3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">220&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Amoniaco&#47;amonio&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">9&#44;2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">210&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">&#193;cido b&#243;rico&#47;borato&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">9&#44;2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">210&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Trietilamina&#47;ion trietilaminio&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">10&#44;8&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">200&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Pirrolidina&#47;ion pirrolidinio&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">11&#44;3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">200&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t" class=""><thead title="thead"><tr title="table-row"><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Tipos de empaquetados qu&#237;micos&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Tipo de cromatograf&#237;a&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Modalidad de trabajo&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">C<span class="elsevierStyleInf">18</span> &#40;octadecilo&#44; &#171;ODS&#187;&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Reparto&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Fase inversa&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">C<span class="elsevierStyleInf">8</span> &#40;octilo&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Reparto&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Fase inversa&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">C<span class="elsevierStyleInf">6</span> &#40;hexilo&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Reparto&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Fase inversa&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">C<span class="elsevierStyleInf">4</span> &#40;butilo&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Reparto&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Fase inversa&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">C<span class="elsevierStyleInf">1</span> &#40;trimetilsililo&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Reparto&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Fase inversa&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">&#171;Fenilo&#187;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Reparto&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Fase inversa&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">PFP &#40;pentafluorofenilo&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Reparto&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Fase inversa&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">CONH<span class="elsevierStyleInf">2</span> &#40;amida&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Reparto&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Fase inversa&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " rowspan="2" align="left" valign="top">CN &#40;ciano&#41;</td><td class="td" title="table-entry  " rowspan="2" align="left" valign="top">Reparto</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Fase inversa&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Fase normal&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " rowspan="2" align="left" valign="top">NH<span class="elsevierStyleInf">2</span> &#40;amino&#41;</td><td class="td" title="table-entry  " rowspan="2" align="left" valign="top">Reparto</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Fase inversa&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Fase normal&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " rowspan="2" align="left" valign="top">NH&#40;CH<span class="elsevierStyleInf">3</span>&#41;<span class="elsevierStyleInf">2</span> &#40;dimetilamina&#41;</td><td class="td" title="table-entry  " rowspan="2" align="left" valign="top">Reparto</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Fase inversa&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Fase normal&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " rowspan="2" align="left" valign="top">Poliestireno</td><td class="td" title="table-entry  " rowspan="2" align="left" valign="top">Reparto</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Fase inversa&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Fase normal&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">S&#237;lice&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Reparto&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Fase normal&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">&#40;OH&#41;<span class="elsevierStyleInf">2</span> &#40;diol&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Reparto&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Fase normal&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">NR<span class="elsevierStyleInf">4</span> &#40;amina cuaternaria&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Intercambio i&#243;nico&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#8211;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">SO<span class="elsevierStyleInf">3</span> &#40;&#225;cido sulf&#243;nico&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Intercambio i&#243;nico&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#8211;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">CH<span class="elsevierStyleInf">3</span>NH<span class="elsevierStyleInf">2</span> &#40;metilamina&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Intercambio i&#243;nico&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#8211;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">COOH &#40;&#225;cido carbox&#237;lico&#41;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Intercambio i&#243;nico&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#8211;&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " rowspan="2" align="left" valign="top">Pol&#237;meros&#47;s&#237;lice espec&#237;ficos</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Afinidad&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " rowspan="2" align="left" valign="top">&#8211;</td></tr><tr title="table-row"><td class="td-with-role" title="table-entry ; entry_with_role_rowhead " align="left" valign="top">Exclusi&#243;n molecular&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr></tbody></table>
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Información del artículo

ISSN: 18884008
Idioma original: Español

DOI:10.1016/j.labcli.2017.05.001

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