El objetivo del presente trabajo fue evaluar la actividad in vitro del ajoeno sobre levaduras del género Candida, obtenidas de secreciones vaginales.
MétodosSe analizaron 136 muestras. Las levaduras se aislaron e identificaron por métodos tradicionales. Se evaluó su sensibilidad al ajoeno (20, 15, 12,5, 10, 6,25 y 3,125μg/ml) según el documento M27-A2 del CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute), con modificaciones del EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing). Se incluyeron las cepas ATCC 90028 (Candida albicans), 22019 (Candida parapsilosis) y 6258 (Candida krusei). La concentración mínima inhibitoria (CMI) se consideró la menor concentración de ajoeno capaz de inhibir el 80% del crecimiento fúngico.
ResultadosSe recuperaron 55 levaduras, 36 que estaban ocasionando candidiasis (65,4%) y 19 que estaban colonizando (34,5%). De las 6 especies aisladas, C. albicans ocupó el primer lugar (81,8%) y predominó en las pacientes con candidiasis (54,5%). Otras especies del género Candida se aislaron con menor frecuencia (18,2%); Candida glabrata fue la primera en este grupo (7,3%), seguida de Candida tropicalis (3,6%), C. krusei, C. parapsilosis, Candida guilliermondii y Candida sp. (cada una 1,8%). Las pruebas de sensibilidad mostraron inhibición del crecimiento fúngico en un 98,2% de los aislamientos, con una CMI inferior o igual a 15μg/ml de ajoeno, y (un aislamiento de C. glabrata) (1,8%) la CMI fue superior a 20μg/ml. En las cepas control la CMI fue de 3,125 y 10μg/ml.
ConclusionesEstos resultados, obtenidos con un número significativo de aislamientos de Candida, en especial de C. albicans, demuestran una vez más el poder antifúngico potencial del ajoeno en las levaduras resistentes a los antifúngicos más comunes.
The main purpose of this work was to evaluate the in vitro activity of ajoene of the Candida, obtained from vaginal discharges.
MethodsFor this, 136 samples were analyzed. The yeasts were recovered and identified by conventional mycological methods. The susceptibility to ajoene (at 20, 15, 12.5, 10, 6.25 and 3.125μg/ml) was performed according to the CLSI M27-A2 document with the EUCAST modifications. The ATCC reference strains 90028 (Candida albicans), 22019 (Candida parapsilosis), and 6258 (Candida krusei) were included in this study. The minimal inhibitory concentration (MIC) was considered as the minimal concentration of ajoena able to inhibit 80% of the fungal growth.
ResultsFifty five yeasts were recovered, 36 (65.4%) of them were causing candidosis and 19 (34.5%) were colonizing. C. albicans was the most frequent (81.8%) of the six isolated species, prevailing on the patients with candidosis (54.5%). The non-albicans species were less frequently isolated (18.2%), and Candida glabrata was the prevailing agent (7.3%) followed by Candida tropicalis (3.6%), C. krusei, C. parapsilosis, Candida guilliermondii and Candida sp. (1.8% each of them). The susceptibility tests to ajoeno showed inhibition of fungal growth in 98.2% of the isolates, showing MIC values ⩽15μg/ml, and in (one isolate of C. glabrata) (1.8%) this value was >20μg/ml. The reference strains showed MIC values of 3.125 and 10μg/ml.
ConclusionsThe results here presented, obtained from a significant number of isolates, mainly C. albicans, demonstrate, once more, the potential of ajoeno as an antifungal agent.
La candidiasis comprende las manifestaciones clínicas ocasionadas por levaduras del género Candida, en especial, C. albicans. Es una de las infecciones micóticas más comunes de los últimos años, debido al incremento de los pacientes en condiciones de inmunosupresión3,6. Puede clasificarse como candidiasis cutánea, mucocutánea y sistémica. La candidiasis vaginal es una de las localizaciones más frecuentes15.
La candidiasis vaginal es una vaginitis caracterizada por exantema doloroso con presencia de un exudado blanquecino, bajo el que se pueden formar petequias o erosiones hemorrágicas que suelen ulcerarse15. Se presenta en la mayoría de las mujeres al menos una vez durante su vida; en la mitad de ellas, ocurren de 2 a 3 episodios infecciosos en un año, y en un 5% aproximadamente la enfermedad se vuelve crónica o recurrente por presentar 4 episodios durante un año1.
C. albicans es el comensal prevalente y se ha localizado en el 70% del cuerpo en la mujer sana, mientras que C. glabrata es el segundo patógeno de origen fúngico aislado y ocasiona del 5 al 8% de las infecciones por Candida. Las otras especies de Candida se recuperan con menor frecuencia7.
Para considerar los aislamientos de Candida provenientes de sitios donde habita normalmente como causantes de procesos infecciosos, debe observarse en el examen directo de la muestra un número abundante de levaduras, hifas o seudohifas y, en el cultivo, el crecimiento levaduriforme. Candida suele encontrarse formando sólo blastoconidias cuando está asociada a colonización y formando micelio cuando ocasiona la sintomatología propia de la infección1.
Las infecciones fúngicas han adquirido gran importancia en las últimas décadas, debido a su mayor frecuencia de aparición (particularmente en pacientes con estado de inmunodepresión avanzada), a su alta morbimortalidad y al surgimiento de nuevas especies patógenas, lo que ha conducido al uso frecuente de antifúngicos y en dosis elevadas, y ha originado en muchos casos la aparición de cepas resistentes, especialmente a los derivados azólicos. Por tanto, los estudios de sensibilidad in vitro a los antifúngicos se hacen cada vez más necesarios a fin de conocer su actividad y predecir el éxito o el fracaso del tratamiento, así como también conocer otras alternativas de tratamientos6.
El ajoeno2 es un compuesto organosulfurado [(E-Z) 4-5-9 trithiadodeca-1-6-11 trieno 9-oxido] con actividad in vivo8,9,10,14,21,25 e in vitro16,18,21,26,27 contra distintas especies de hongos patógenos en los seres humanos. Uno de sus mecanismos de acción como antimicótico lo ejerce sobre la membrana plasmática al inhibir la síntesis de la fosfatidilcolina, lo que trae como consecuencia la alteración en su composición lipídica e incrementa los esteroles. Esta interacción es la causante de los cambios estructurales de la membrana citoplásmica, con aumento de su permeabilidad y su posterior muerte celular20,21.
Debido a lo anteriormente expuesto, el objetivo del presente trabajo fue determinar la susceptibilidad in vitro al ajoeno de Candida aisladas de secreciones vaginales de pacientes embarazadas con complicaciones (ECC), embarazadas sin complicaciones (ESC) y no embarazadas (NE).
Material y métodosPoblación: se tomaron 136 muestras de secreciones vaginales distribuidas de la siguiente manera: 79 provenientes de pacientes ECC como amenaza de parto pretérmino, trabajo de parto pretérmino y rotura prematura de membrana, que acudieron a la emergencia obstétrica del Instituto Autónomo Hospital Universitario de los Andes; 22 de pacientes ESC y 35 de mujeres NE que asistieron a la consulta prenatal y de medicina de familia del Ambulatorio Venezuela, Mérida, Estado de Mérida. Las pacientes manifestaron por escrito su voluntad de participar en el estudio (consentimiento informado).
Criterios utilizados para considerar una candidiasis vaginal: se consideró que la paciente presentaba candidiasis vaginal cuando mostraba clínicamente los signos y síntomas de una vaginitis, abundantes levaduras, hifas o seudohifas en el examen directo de la muestra y una correlación de estos elementos con el crecimiento levaduriforme en los respectivos cultivos1.
Criterios utilizados para considerar una colonización por Candida: se consideró que la paciente presentaba colonización por Candida cuando había ausencia o escasas levaduras en el examen directo de la muestra clínica y crecimiento levaduriforme en los medios de cultivos1.
Estudio micológicoProcesamiento y aislamiento de las levaduras: las muestras se tomaron del fondo de saco vaginal, con hisopos estériles y se colocaron en solución salina fisiológica (SSF) estéril. A cada muestra se le realizó examen directo al fresco y coloración de Gram. Luego se sembraron, por duplicado, en agar de Sabouraud glucosado (ASG), ASG con cloranfenicol y ASG con cloranfenicol y actidiona, y se incubaron a temperatura ambiente y a 37°C. Las levaduras aisladas se purificaron en placas con ASG.
Identificación: para ello se usó el método convencional con agar bilis, el sistema ID 32C (bioMérieux, Francia) y la lectura con el equipo ATB expression. Se incluyeron las cepas C. albicans ATCC 90028, Candida parapsilosis ATCC 22019 y Candida krusei ATCC 6258, como controles.
Pruebas de susceptibilidad in vitroMétodo de microdilución: se siguió la metodología descrita en el documento M27-A2 del CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute)13 con las modificaciones del EUCAST (European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing) y se utilizó el medio RPMI-1640, al que se añadió glucosa al 2% y ácido morfolino propanosulfónico5.
El ajoeno se sintetizó y purificó según lo reportado previamente2. De una solución madre de ajoeno (539mg/ml), se prepararon concentraciones de 40, 30, 25, 20, 12,5 y 6,25μg/ml en dimetilsulfóxido, y se dispensaron 100μl de cada una de ellas en las placas de microdilución, que se mantuvieron a -5°C hasta el momento de su uso.
Se preparó una suspensión celular de cada levadura en la SSF para obtener una concentración de 1–5×105UFC/ml y se colocaron 100μl de esta dilución en las placas de microdilución contentivas de ajoeno, previamente descongeladas; luego se incubaron a 35°C en agitación constante, durante 24h. Las concentraciones finales de ajoeno en cada pozo fueron de 20, 15, 12,5, 10, 6,25 y 3,125μg/ml. Las placas se leyeron usando un lector de ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay ‘técnica de radioinmunoanálisis’) (Bio-Rad, EE. UU.) a 492nm.
Se consideró la concentración mínima inhibitoria (CMI) como la menor concentración capaz de inhibir el 80% del crecimiento del microorganismo.
Los resultados se presentaron en valores absolutos y en porcentajes.
ResultadosEn 55 (40,4%) de las 136 muestras clínicas se aislaron levaduras, de las que 36 (65,4%) estaban ocasionando candidiasis vaginal, diagnosticada mediante la observación directa de hifas, seudohifas o blastoconidias y 19 (34,5%) estaban colonizando, lo que se determinó por el crecimiento en los medios de cultivo.
De los 36 casos con candidiasis, 19 (34,5%) correspondieron a pacientes ECC, 5 (9,1%) a ESC y 12 (21,8%) a NE. De las 19 levaduras colonizadoras, 13 (23,6%) provenían de las pacientes ECC, 4 (7,3%) de las ESC y 2 (3,6%) de las NE (tabla 1).
Tabla 1. Distribución de las especies de Candida recuperadas de mujeres con y sin candidiasis, según su condición clínica
| Con candidiasis | Sin candidiasis | ||||||||
| Especie | ECC | ESC | NE | Subtotal | ECC | ESC | NE | Subtotal | Total (%) |
| Candida albicans | 16 | 4 | 10 | 30 | 10 | 3 | 2 | 15 | 45 (81,8) |
| Candida glabrata | 2 | 2 | 2 | 2 | 4 (7,3) | ||||
| Candida tropicalis | 1 | 1 | 1 | 1 | 2 (3,6) | ||||
| Candida krusei | 1 | 1 | 1 (1,8) | ||||||
| Candida parapsilosis | 1 | 1 | 1 (1,8) | ||||||
| Candida guilliermondii | 1 | 1 | 1 (1,8) | ||||||
| Candida sp. | 1 | 1 | 1 (1,8) | ||||||
| Subtotal | 36 | 19 | 55 | ||||||
| Total | 19 | 5 | 12 | 13 | 4 | 2 | 55 | ||
| (%) | (34,5) | (9,1) | (21,8) | (23,6) | (7,3) | (3,6) | (100) | ||
ECC: embarazadas con complicaciones; ESC: embarazadas sin complicaciones; NE: no embarazadas.
De los aislamientos recuperados de candidiasis vaginal, 30 correspondieron a la especie C. albicans, 2 a C. glabrata y uno a cada una de las especies C. krusei, C. parapsilosis, Candida guilliermondii y Candida tropicalis; de las mujeres sin candidiasis vaginal se recuperaron 15 aislamientos de C. albicans, 2 de C. glabrata, uno de C. tropicalis y uno de Candida sp. De los 30 aislamientos de C. albicans de las pacientes con candidiasis, 16 procedían de ECC, 4 de ESC y 10 de NE, y de los 15 recuperados de las mujeres sin candidiasis, 10 eran de ECC, 3 de ESC y 2 de NE. De los 4 aislamientos de C. glabrata, 2 provenían de ECC con candidiasis y 2 de ECC sin candidiasis; el aislamiento de C. krusei se obtuvo de una paciente ECC con candidiasis y el de C. parapsilosis de una paciente NE con candidiasis, así como el de C. guilliermondii. De los 2 aislamientos de C. tropicalis, uno procedía de una ESC con candidiasis y el otro de una ECC sin candidiasis; el aislamiento de Candida sp. se recuperó de una ESC sin candidiasis (tabla 1).
Como se observa en la tabla 2, los aislamientos de C. albicans procedentes de las mujeres con y sin candidiasis, tanto de ECC como de ESC, mostraron valores de CMI para el ajoeno de 6,25 a 15μg/ml, y para los recuperados de las mujeres NE con y sin candidiasis este valor osciló entre 6,25 y 10μg/ml. En relación con C. glabrata, los valores de la CMI fueron de 3,125μg/ml en 2 aislamientos provenientes de mujeres ECC, una con candidiasis y la otra sin candidiasis, de 12,5μg/ml para el aislamiento procedente de una ECC sin candidiasis y superiores a 20μg/ml para el aislamiento de una ECC con esta micosis. Para los 2 aislamientos de C. tropicalis, procedentes uno de una ESC con candidiasis y otro de una ECC sin candidiasis, la CMI fue de 12,5 y 10μg/ml, respectivamente. En cuanto a los aislamientos de C. krusei y de C. parapsilosis, recuperados de 2 mujeres con candidiasis, una ECC y otra NE, se reveló una CMI de 10μg/ml. La cepa de C. guilliermondii, recuperada de una mujer NE con candidiasis, mostró una CMI de 12,5μg/ml y en el aislamiento de Candida sp., obtenido de una ESC sin candidiasis, ésta fue de 3,125μg/ml. Las cepas control C. albicans ATCC 90028 y C. parapsilosis ATCC 22019 mostraron valores de CMI de 10μg/ml; para C. krusei ATCC 6258, este valor fue de 3,125μg/ml de ajoeno.
Tabla 2. Valores de la concentración mínima inhibitoria de ajoeno en las especies de Candida recuperadas de mujeres con y sin candidiasis
| Con candidiasis | Sin candidiasis | ||||
| Especies (n) | Condición clínica | CMI (μg/ml) | Especies (n) | Condición clínica | CMI (μg/ml) |
| Candida albicans (30) | ECC | 6,25 a 15 | C. albicans (15) | ECC | 6,25 a 15 |
| ESC | 6,25 a 15 | ESC | 6,25 a 15 | ||
| NE | 6,25 a 10 | NE | 6,25 a 10 | ||
| Candida glabrata (2) | ECC | 3,125 y>20 | C. glabrata (2) | ECC | 3,125 y 12,5 |
| Candida tropicalis (1) | ESC | 12,5 | C. tropicalis (1) | ECC | 10 |
| Candida krusei (1) | ECC | 10 | |||
| Candida parapsilosis (1) | NE | 10 | |||
| Candida guilliermondii (1) | NE | 12,5 | |||
| Candida sp. (1) | ESC | 3,125 | |||
| Total (36) | (19) | ||||
CMI: concentración mínima inhibitoria; ECC: embarazadas con complicaciones; ESC: embarazadas sin complicaciones; NE: no embarazadas.
Las micosis oportunistas, entre éstas la candidiasis, han aumentado en las 2 últimas décadas debido al incremento de situaciones inmunosupresoras, como la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana, los trasplantes de órganos, el cáncer, los tratamientos con inmunosupresores y la utilización de métodos invasivos con miras a preservar la vida de los pacientes en situaciones de gravedad3,12. La candidiasis vaginal, caracterizada por dolor vulvovaginal, ardor, prurito, flujo blanquecino, inflamación, disuria y por su frecuencia y difícil tratamiento, ocasiona un problema de salud pública15. Puede presentarse en cualquier etapa de la vida de la mujer; son factores predisponentes el embarazo, los anticonceptivos orales, la alteración de los valores de glucosa y el abuso de antibióticos, entre otros. Son los agentes causales las especies C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis, C. pseudotropicalis y C. krusei1,23,24.
La aparición de candidiasis oportunista, sobre todo en niños prematuros, es muy frecuente y ha alcanzado el cuarto lugar en los cuadros de septicemia nosocomial3,12. El nacimiento de un lactante por el canal del parto de una madre con candidiasis aumenta los casos de candidiasis invasiva en los infantes, condición que se incrementa debido a que la candidiasis vaginal es una de las infecciones más comunes del tracto genital femenino4. En el presente estudio se obtuvo una frecuencia de candidiasis del 65,4%; se notó que el 74,5% de las levaduras se aisló de las secreciones vaginales de mujeres embarazadas, de las que el 58,1% eran de las ECC y el 16,4% de las ESC.
C. albicans fue la especie recuperada con mayor frecuencia en las mujeres con y sin candidiasis, independientemente de su condición clínica, resultados esperados si se considera que este agente forma parte de la microbiota fúngica vaginal y que, en condiciones favorables, se hace patógeno4. En este estudio se evidenció el oportunismo de este agente al observar que se obtuvo el doble de estos aislamientos en las pacientes con candidiasis.
Las especies de Candida diferentes a C. albicans se aislaron con menor frecuencia (18,2%); C. glabrata fue la primera en este grupo (7,3%), resultados que concuerdan con informes previos23,24. En las pacientes con candidiasis se aisló mayor diversidad de especies con relación a las mujeres sin candidiasis (tabla 1). La identificación de las especies de Candida diferentes a C. albicans es sumamente importante, debido, entre otras cosas, a que se reportan con mayor frecuencia como causantes de enfermedades, sobre todo en pacientes inmunosuprimidos, además de mostrar menor sensibilidad a los antifúngicos con respecto a C. albicans1,23.
El tratamiento de la candidiasis vaginal está limitado al uso de fármacos comerciales, principalmente fluconazol; recientemente, se ha informado acerca de la aparición de resistencia a este antimicótico, por lo que se considera altamente recomendable disponer de nuevas alternativas terapéuticas28. Por esto, se evaluó en el presente estudio el efecto del ajoeno sobre las especies de Candida aisladas en las pacientes de la muestra.
Se utilizó el método reportado en el documento M27-A2 del CLSI con las modificaciones del EUCAST, debido a los excelentes resultados que se han obtenido en informes previos que han utilizado fármacos comerciales5,13. Bajo esas condiciones, el 98,2% de los aislamientos clínicos de este estudio mostró una sensibilidad marcada al ajoeno con inhibición de su crecimiento y valores de CMI iguales o inferiores a 15μg/ml, resultados similares a los reportados previamente en estudios de sensibilidad in vitro a este compuesto en C. albicans, C. krusei, C. parapsilosis, Cryptococcus neoformans, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis, Microsporum canis, Cladophialophora carrionii, Fonsecaea pedrosoi e Histoplasma capsulatum8,11,16,17,18,19,21,22,26,27.
Con respecto a los aislamientos de C. albicans, aunque todos mostraron una CMI inferior o igual a 15μg/ml, es interesante resaltar que en los 12 aislamientos procedentes de las NE con y sin candidiasis, los valores de la CMI fueron menores (6,25 a 10μg/ml), quizá debido a que su estado fisiológico no requiere recibir tratamiento antimicrobiano, que podría inducir a la adquisición de mecanismos de resistencia.
En 3 de los 4 aislamientos de C. glabrata, la CMI fue de 3,125 a 12,5μg/ml, valores de CMI más bajos con respecto al resto de las especies de Candida diferentes a C. albicans resultados altamente satisfactorios debido a que esta especie manifiesta resistencia secundaria a los azoles, por lo que la posible alternativa del uso terapéutico del ajoeno resolvería los casos de candidiasis ocasionados por C. glabrata, segunda especie de Candida recuperada con frecuencia en la candidiasis vaginal, principalmente en la recurrente1,28. Con respecto al otro aislamiento de C. glabrata, ninguna de las concentraciones utilizadas de ajoeno inhibió su crecimiento, por lo que, para obtener resultados concluyentes, sería necesario realizar ensayos con concentraciones mayores de ajoeno a fin de determinar su CMI.
C. krusei es intrínsecamente resistente a los azoles, en especial al fluconazol13,28. En estos ensayos, esta especie se recuperó de una mujer ECC y con candidiasis. El ajoeno, en una concentración de 10mg/ml, inhibió al único aislamiento evaluado y las expectativas son estimulantes para realizar estudios posteriores con un mayor número de aislamientos y corroborar estos hallazgos.
En el resto de los aislamientos ensayados, C. tropicalis (2), C. parapsilosis (1), C. guilliermondii (1) y Candida sp. (1), se evidenció una inhibición del crecimiento con las concentraciones de 3,125 a 12,5μg/ml de ajoeno, al igual que con las cepas control.
En conclusión, los resultados del presente estudio, realizado con un número significativo de especies de Candida, en especial C. albicans, demuestran, una vez más, el potencial poder antifúngico del ajoeno. Con respecto a las especies de Candida diferentes a C. albicans, sería importante incluir un mayor número de aislamientos para confirmar estos hallazgos. El ajoeno sería la nueva alternativa de tratamiento en la candidiasis vulvovaginal, sobre todo en las ocasionadas por levaduras resistentes a los antifúngicos de uso frecuente.
FinanciaciónEste trabajo se financió parcialmente por parte del CDCHT-ULA No SE-FA-01-07-07 y el proyecto CDCH-UCV No 0912-4911-04.
Agradecimientos
Los autores desean expresar su gratitud a aquellos que de una u otra manera contribuyeron en la realización de este trabajo: al Dr. Axel Santiago, Laboratorio de Micología del Hospital Universitario de Caracas; a la MSc. María Isabel Ramos, Escuela de Bioanálisis, UCV; a la Lic. Adriana Di Rudolfo, Laboratorio del IPAS-ME; a la MSc. Egleé Borregales, a TSU Oduar Salazar, y a la MSc. Luisa Vizcaya del Departamento de Microbiología y Parasitología, Facultad de Farmacia y Bioanálisis, ULA; y, de manera muy especial, a las pacientes que participaron en este proyecto.
Autor para correspondencia.
