Objetivos: El objetivo de este estudio es evaluar el posible uso de dos kits comerciales para la determinación colorimétrica de zinc en plasma seminal humano, como alternativa a la compleja metodología analítica de la espectrofotometría de absorción atómica (AAS), y validar la relación entre zinc y citrato en plasma seminal.
Pacientes: Ciento sesenta pacientes que acuden al servicio de andrología procedentes, fundamentalmente, de los servicios de esterilidad, urología, endocrinología y oncología con edades comprendidas entre los 17 y 63 años.
Métodos: El estudio incluye la comparación del método de referencia para la determinación de zinc en plasma seminal, AAS, y los métodos colorimétricos; la validación de los dos métodos colorimétricos [basados en los cromóforos 2-(5-bromo-2-piridilazo)-5-(N-propil-N-3-sulfopropilamino)-fenol (5-Br-PAPS) y 2-(5-nitro-2-piridilazo)-5-(N-propil-N-sulfopropilamino)-fenol (Nitro-PAPS), respectivamente] para imprecisión, linealidad y límite de cuantificación y el estudio de la correlación entre zinc y citrato.
Resultados: Los métodos colorimétricos y la AAS son intercambiables.
La imprecisión intradía media (% CV) obtenida con el kit basado en 5-Br-PAPS es de 2,42, y 5,81% con el kit basado en Nitro-PAPS.
En el estudio de linealidad, ambos métodos presentan un coeficiente de regresión de 0,999 en concentraciones de zinc entre 10-500 μg/dl, aunque en dicho rango el kit basado en 5-Br-PAPS presenta mejores porcentajes de recuperación.
Se observa una correlación positiva significativa entre el zinc y citrato (r = 0,724, p < 0,001).
Conclusión: Los métodos colorimétricos representan una buena alternativa a la AAS; el método colorimétrico basado en 5-Br-PAPS muestra mejores prestaciones.
Objectives: The aim of the current study is to evaluate the possible use of two commercial kits for the colorimetric determination of zinc in human seminal plasma as an alternative to the complex analytical methodology of atomic absorption spectrophotometry and to assess the relation between zinc and citrate in seminal plasma.
Patients: The study included 160 patients, aged 17 to 63 years, who came to the Andrology service proceeding fundamentally from the Sterility, Urology, Endocrinology and Oncology Departments.
Methods: The study included the comparison of the method of reference for the determination of zinc in seminal plasma, atomic absorption spectrophotometry and the colorimetric methods, the validation of both colorimetric methods (based on the chomophores 5-Br-PAPS and Nitro-PAPS, respectively) determining imprecision, linearity and limit of quantification and the correlation study between zinc and citrate.
Results: Both colorimetric methods and atomic absorption spectrophotometry are interchangeable.
The average within-run variation (%CV) is 2.42% with the 5-Br-PAPS based kit and 5.81% with the Nitro-PAPS based kit.
In the linearity study, both methods present a determination coefficient of 0.999 at zinc concentrations between 10-500 μg/dl. However the percentages of recovery in that range are better with the 5-Br-PAPS based kit.
A significant positive correlation was observed between zinc and citrate (r=0.724, P<0.001).
Conclusion: Colorimetric methods are a good alternative to atomic absorption spectrophotometry, the colorimetric method based in 5-Br-PAPS showing better performance.
Introducción
El semen está compuesto en un 90% por secreciones de los órganos accesorios, principalmente de la próstata y la vesícula seminal, con una menor contribución de las glándulas bulbouretrales (glándulas de Cowper) y los epidídimos, de tal manera que la medición de la concentración de compuestos específicos en plasma seminal nos permite evaluar la capacidad secretora de estas glándulas1.
El zinc es un marcador de la función secretora prostática, junto con el ácido cítrico y la fosfatasa ácida1. En situaciones de infección y/o inflamación del aparato reproductor masculino, se observan disminuciones significativas de la concentración de zinc en plasma seminal, sugiriendo un daño en la función secretora de la próstata2,3.
Algunos estudios sugieren que el zinc presenta un rol en la estabilización de la membrana celular y la cromatina nuclear del espermatozoide4.
El zinc presenta propiedades antioxidativas que participan en la neutralización de especies reactivas de oxígeno producidas por espermatozoides defectuosos y/o leucocitos en el semen humano tras la eyaculación5. Las especies reactivas de oxígeno son una de las principales causas de disfunción espermática6 debido a las alteraciones que producen en la fluidez e integridad de la membrana plasmática de los espermatozoides, lo cual se traduce en alteraciones en la movilidad y morfología del espermatozoide, y a su papel en la fragmentación del ADN7. En dos estudios publicados recientemente, se evidencia el efecto positivo de un compuesto de antioxidantes (vitaminas y oligoelementos) sobre la concentración, movilidad y morfología espermática y el grado de fragmentación del ADN espermático en varones infértiles7,8.
El zinc también es responsable de la actividad antibacteriana en el plasma seminal. La principal actividad antibacteriana del plasma seminal es transitoria y dependiente de péptidos derivados proteolíticamente de las semenogelinas I y II y de la unión de iones zinc9.
Un defecto espermático frecuente es una reacción acrosómica inducida por la zona pelúcida defectuosa, definida como ZPIAR < 16%. La concentración de zinc es significativamente más alta en pacientes infértiles con semen normozoospérmico y reacción acrosómica inducida por la zona pelúcida alterada, debido al rol del zinc como factor de decapacitación por unión excesiva a la membrana plasmática del espermatozoide10.
Enzimas vitales para la función espermática son las metaloenzimas de zinc, de tal manera que la presencia de zinc es imprescindible en la actividad de dichas metaloenzimas11,12. Tal es el caso de la enzima convertidora de angiotensina en las células Leydig, que en situaciones de déficit de zinc presenta una baja actividad, produciendo a su vez una depleción de la testosterona e inhibición de la espermatogénesis10-13.
El procedimiento analítico recomendado en la medición del zinc en plasma seminal es la espectrofotometría de absorción atómica (AAS) de llama12.
Sin embargo, el coste del analizador de AAS junto con el requerimiento de unas instalaciones especiales (suministro de gases) hace que esta metodología analítica no sea asequible a todos los laboratorios. Como alternativa, se han desarrollado nuevos métodos colorimétricos basados en derivados piridilazo, tales como 2-(5-bromo-2-piridilazo)-5-(N-pro pil-N-3-sulfopropilamino)-fenol (5-Br-PAPS)14, 2-(5-nitro-2-piridilazo)-5-(N-propil-N-sulfopropilamino)-fenol (Nitro-PAPS)15, 1-(2-piridilazo)-2-naftol (PAN)16, entre otros.
El objetivo de este estudio es la validación de dos kits colorimétricos comerciales, y también se pretende confirmar la relación entre el zinc y el ácido cítrico en el plasma seminal en la sustitución de la determinación de ácido cítrico por la de zinc como único marcador de la función excretora prostática, tal y como se recomienda en la última edición del Manual de laboratorio de la Organización Mundial de la Salud (5.ª ed. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen)1.
Material y métodos
Pacientes
En la comparación de los métodos analíticos, se seleccionaron 42 pacientes (32 de los cuales procedían de la unidad de reproducción asistida y 10 del servicio de urología) que presentaban concentraciones de zinc en plasma seminal, determinadas por el método de referencia, que cubrían el rango fisiopatológico de zinc en plasma seminal.
Para validar la relación entre zinc y ácido cítrico, se seleccionaron 118 pacientes, de edades comprendidas entre los 17 y 63 años, que acudieron al servicio de andrología correlativamente durante el mes de junio, excluyendo del estudio a aquellos pacientes que presentaban azoospermia. De los 118 pacientes, 110 procedían de la unidad de reproducción asistida, 6 del servicio de urología, 1 del servicio de endocrinología y 1 de oncología.
Preparación del plasma seminal
Las muestras fueron obtenidas siguiendo las normativas de la Organización Mundial de la Salud1 y de la European Society of Human Reproduction and Embryology17 y recogidas por los pacientes mediante la masturbación tras un período mínimo de abstinencia de 48 h y máximo de 7 días. El tiempo transcurrido entre la llegada de las muestras al laboratorio y su análisis fue de una hora como máximo.
Tras el examen macroscópico inicial (viscosidad, licuefacción, apariencia, volumen y pH del eyaculado) y estudio de la concentración, movilidad, vitalidad y morfología de los espermatozoides, la muestra de semen se centrifugó a 3.000 revoluciones por minuto durante diez minutos.
Se decantó y conservó el plasma seminal libre de espermatozoides a -20 ºC hasta el momento del análisis de zinc en plasma seminal.
Para minimizar la interferencia de las proteínas plasmáticas del semen en las determinaciones colorimétricas y por AAS, todas las muestras se diluyeron al 1/100 con agua destilada.
Espectrofotometría de absorción atómica de llama
Es el procedimiento analítico de referencia para la determinación de zinc en plasma seminal12. Se empleó un espectrómetro de absorción atómica AAnalyst 800 de Perkin Elmer, con lámpara de cátodo hueco y atomización con llama de acetileno y aire.
En la puesta a punto de esta técnica en el Hospital Universitario Vall d'Hebron, el límite de detección, según el método de la International Union of Pure and Applied Chemistry, fue de 0,02 mg/dl, y la linealidad de la técnica fue comprobada hasta 640 mg/dl. Los coeficientes de variación intraensayo obtenidos fueron del 3 y del 8% en dos pools de muestras de plasma seminal con unas concentraciones medias de 136,6 y 70,6 mg/dl, respectivamente.
Métodos colorimétricos basados en Nitro-PAPS y 5-Br-PAPS
En la determinación colorimétrica de zinc en plasma seminal, se utilizó el analizador Cobas Mira Plus de Roche.
En este estudio, se han validado dos kits comerciales con los reactivos listos para su uso, basados cada uno en dos cromóforos diferentes. Por un lado, el kit de Ben-Biochemical Enterprise S.r.l., suministrado por Materlab, S.L., y Atom, S.A., basado en la sal sódica (Nitro-PAPS) como componente cromógeno. Por el otro, el kit de Wako Pure Chemicals Industries Ltd., basado en una sal sódica (5-Br-PAPS) como componente cromógeno.
Diseño experimental
La comparación de los métodos colorimétricos basados en 5-Br-PAPS y Nitro-PAPS con respecto a la AAS de llama se realizó a través del método no paramétrico de Passing y Bablok.
Los métodos colorimétricos se validaron en linealidad, imprecisión intradía, imprecisión interdía y límite de cuantificación.
La linealidad se estudió mediante la determinación por duplicado de una serie de soluciones acuosas de zinc de concentración entre 10,24-1.000 μg/dl, preparadas a partir de una solución patrón de nitrato de zinc, Zn (NO3)2 en HNO3 0,5 mol/l, 1.000 mg/l Zn (Merck 19806).
La imprecisión intradía se evaluó midiendo 20 veces consecutivas dos niveles de material control y dos pools de plasma seminal.
La imprecisión interserie se evaluó analizando 2 niveles de material control durante 15 días consecutivos.
El límite de cuantificación, definido como la mínima concentración que puede ser detectada con una imprecisión igual o inferior al 5%, se determinó analizando 5 replicados de varios niveles de concentración (54,90 μg/dl, 31,60 μg/ dl, 15,58 μg/dl, 7,25 μg/dl y 1,22 μg/dl) obtenidos por dilución seriada del calibrador.
En el estudio de correlación bivariante entre zinc y citrato en plasma seminal, se calculó el coeficiente de correlación de Pearson. Las determinaciones de zinc se efectuaron con el método colorimétrico basado en 5-Br-PAPS.
Métodos estadísticos
El análisis estadístico se realizó con SPSS versión 10.0 (SPSS Inc. Chicago, IL, EE. UU.).
El nivel de significación estadística fue p < 0,05.
Resultados
Los resultados de Passing y Bablok del análisis comparativo entre los métodos colorimétricos Nitro-PAPS y 5-Br-PAPS y el método de AAS se muestran en las figuras 1 y 2, respectivamente.
Figura 1 Correlación entre la concentración de zinc medida con el método colorimétrico basado en Nitro-PAPS y el método de espectrometría de absorción atómica.
Figura 2 Correlación entre la concentración de zinc medida con el método colorimétrico basado en 5-Br-PAPS y el método de espectrometría de absorción atómica.
En el método colorimétrico Nitro-PAPS, la estimación de la ordenada en el origen es A = -3,552185 (intervalo de confianza [IC] 95%: -17,340311 a 5,253273) y de la pendiente B = 0,888717 (IC 95%: 0,786161 a 1,015224). Y en el método colorimétrico 5-Br-PAPS, la estimación de la ordenada en el origen es A = -0,520481 (IC 95%: -9,557060 a 10,009323) y de la pendiente B = 1,086044 (IC 95%: 1,002874 a 1,192502).
Respecto al estudio de linealidad, la representación gráfica de la concentración de zinc medida con respecto a la concentración de zinc teórica refleja un ajuste lineal del método colorimétrico basado en Nitro-PAPS en todo el rango de concentración evaluado (10-1.000 μg/dl), con un coeficiente de correlación de r = 0,9998 (p < 0,001). No obstante, en todo el rango de concentraciones se obtienen resultados proporcionalmente inferiores a los teóricos. En el método colorimétrico basado en 5-Br-PAPS, la representación gráfica de la concentración de zinc medida frente a la concentración de zinc teórica muestra un ajuste lineal en valores de zinc entre 10-500 μg/dl, con un coeficiente de correlación de r = 0,9995 (p < 0,001). En cambio, se observa una desviación de la linealidad a concentraciones de zinc superiores a 500 μg/dl.
Respecto a los resultados de precisión y reproducibilidad en el método colorimétrico basado en (desviación estándar [DS, en inglés] Nitro-PAPS, en el caso del material control, la concentración media obtenida en los niveles bajo y alto es de 107,87 μg/dl (desviación estándar [DS, en inglés] 3,08) y 388,84 μg/dl (DS 5,66), con una imprecisión (% CV) del 2,86 y 1,45%, respectivamente. Por otro lado, en los pools de plasma seminal se obtiene una concentración media de 41,69 μg/dl (DS 5,85) y 153,98 μg/dl (DS 7,55), con una imprecisión del 14,03 y 4,90%, respectivamente. En el método colorimétrico basado en 5-Br-PAPS, en el caso del material control, la concentración media obtenida en los niveles bajo y alto es de 50,4 μg/dl (DS 0,78) y 395,54 μg/dl (DS 12,99), con una imprecisión del 1,54 y 3,28%, respectivamente. Se obtiene, por otro lado, en los pools de plasma seminal, una concentración media de 70,09 μg/dl (DS 2,60) y 192,39 μg/dl (DS 2,23), con una imprecisión del 3,71 y 1,16%, respectivamente.
Se observan mejores resultados con el kit basado en 5-Br-PAPS, tanto en cuanto a precisión y reproducibilidad, como a linealidad, de tal manera que sólo se evaluó la imprecisión interdía y el límite de cuantificación en este método analítico.
La concentración media obtenida en el análisis de la imprecisión interdía en los niveles bajo y alto del material control es de 61,52 μg/dl (SD 4,41) y 110,07 μg/dl (DS 2,99), con una imprecisión (% CV) del 7,17 y 2,72%, respectivamente.
El cálculo del límite de cuantificación se realiza por ajuste potencial de la representación gráfica de la impresión (% CV) con respecto a la concentración de zinc, estableciéndose en 20 μg/dl de zinc.
Se encuentra una correlación positiva, significativa, entre zinc y ácido cítrico (r= 0,724, p< 0,001) (fig. 3).
Figura 3 Correlación entre las concentraciones de zinc (μmol/ eyaculado) y las concentraciones de ácido cítrico (μmol/eyaculado) en plasma seminal.
Discusión
El método colorimétrico Nitro-PAPS no presenta diferencias de tipo constante ni de tipo proporcional respecto al método de referencia, mientras que el método colorimétrico 5-Br-PAPS, al no comprender el IC de la pendiente el valor 1, presentaría diferencias significativas de tipo proporcional con respecto al método de referencia. Pero, puesto que el límite inferior de la pendiente es 1,002874, se podría asumir que estas diferencias son mínimas. Así pues, los resultados obtenidos en este estudio reflejan una buena correlación entre la AAS de llama y los métodos colorimétricos, hallazgo coherente con la bibliografía14-16.
Respecto a la validación de los métodos colorimétricos, se observan mejores resultados con el kit basado en 5-Br-PAPS, tanto en cuanto a precisión y reproducibilidad como a linealidad. La imprecisión media (valorada mediante el % CV) obtenida con el kit basado en el cromóforo 5-Br-PAPS es de 2,42%, mientras que la obtenida con el kit basado en el cromóforo Nitro-PAPS es de 5,81%. Las mayores diferencias observadas radican en las medidas realizadas con los pools de plasma seminal, pudiendo indicar un posible efecto matriz. Respecto a la linealidad, aunque ambos métodos presentan unos coeficientes de correlación de Pearson de las concentraciones medidas con respecto a las concentraciones teóricas en el rango de concentraciones entre 10-500 μg/dl (rango fisiopatológico del zinc) del orden de 0,999, el kit basado en 5-Br-PAPS presenta mejores porcentajes de recuperación en dicho rango.
En el estudio de correlación entre zinc y citrato en plasma seminal, se ha encontrado una correlación positiva, significativa, entre zinc y ácido cítrico (r = 0,724, p < 0,001), hallazgo que confirma la opción de determinar el zinc en plasma seminal como único marcador de la función secretora prostática, de acuerdo con las recientes indicaciones de la Organización Mundial de la Salud1.
Se ha cuestionado el valor del análisis del zinc en plasma seminal en el estudio de la infertilidad masculina6. En este sentido, sería interesante ampliar el estudio y determinar si existen diferencias significativas en los niveles de zinc entre los grupos fértiles y subfértiles, ya que algunos estudios reportan niveles más bajos de zinc en plasma seminal en la población subfértil18,19, mientras que otros reportan que no hay diferencias significativas entre ambos grupos20. Asimismo, se debería verificar la existencia de una correlación significativa entre los niveles de zinc en plasma seminal y los principales parámetros seminales, fundamentalmente concentración espermática, movilidad, vitalidad y morfología, por la falta de consenso al respecto4,10,19-22.
Conclusión
Los métodos colorimétricos validados constituyen una buena alternativa a la AAS de llama, debido tanto a las menores dificultades técnicas como a sus características de precisión y reproducibilidad, rapidez, practicabilidad y linealidad dentro del rango fisiopatológico del plasma seminal.
Responsabilidades éticas
Protección de personas y animales
Los autores declaran que para esta investigación no se han realizado experimentos en seres humanos ni en animales.
Confidencialidad de los datos
Los autores declaran que han seguido los protocolos de su centro de trabajo sobre la publicación de datos de pacientes y que todos los pacientes incluidos en el estudio han recibido información suficiente y han dado su consentimiento informado por escrito para participar en dicho estudio.
Derecho a la privacidad y consentimiento informado
Los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.
Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
* Autor para correspondencia
Correo electrónico: mncorral@vhebron.net (M.N. Corral-Gallego).
Recibido el 19 de octubre de 2011;
aceptado el 16 de enero de 2012