Influência dos polimorfismos no receptor beta 2 adrenérgico na presença de broncoespasmo induzido pelo exercício em adolescentes

Resumo

Objetivo

Determinar a influência dos polimorfismos dos receptores adrenérgicos beta 2 (ADRB2) no desencadeamento de broncoespasmo induzido pelo exercício (BIE) em adolescentes.

Métodos

Os sujeitos foram divididos em dois grupos: BIE presente (BIE+) (n=45) e BIE ausente (BIE−) (n=115). O teste de broncoprovocação com exercício foi feito com protocolo que consistiu em caminhar/correr durante no mínimo oito minutos em intensidade superior a 85% da frequência cardíaca máxima, considerando como BIE presente uma queda de 10% do volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF₁). A genotipagem do gene ADRB2 foi feita pelo método Taqman por meio do aparelho Step One Plus. Para análise estatística usaram‐se os testes t independente, U de Mann‐Whitney, qui‐quadrado e coeficiente de correlação de Spearman.

Resultados

Idade, massa corporal, estatura, VEF₁, CVF e relação VEF₁/CVF foram menores no grupo BIE+ em comparação com o BIE− (p<0,05). Não houve diferenças significativas na proporção do alelo na posição 27 e dos genótipos Arg16Gly e Gln27Glu entre os grupos BIE+ e BIE− (p=0,26; p=0,97 e p=0,43, respectivamente). Entretanto, verificou‐se uma tendência à significância estatística na maior proporção do alelo Gly16 para o grupo BIE+ comparado com o BIE− (p=0,08).

Conclusões

A presença de polimorfismos associados ao alelo Glu27 e os genótipos Arg16Gly e Gln27Glu não influenciam no BIE. Porém, a tendência estatística observada para uma maior frequência do alelo Gly16 nos indivíduos com a presença de BIE pode ser considerado indício da influência de polimorfismos no gene ADBR2 no BIE em adolescentes.

Abstract

Objective

To determine the influence of polymorphisms of the beta‐2 adrenergic receptor (ADRB2) in triggering exercise‐induced bronchospasm (EIB) in adolescents.

Methods

The subjects were divided into two groups: present EIB (EIB+) (n=45) and absent EIB (EIB−) (n=115). The bronchial provocation test with exercise was performed with a protocol that consisted of walking/running for at least eight minutes at high intensity, i.e., >85% of maximum heart rate, considering EIB+ as a 10% decrease in forced expiratory volume in one second (FEV1). The genotyping of the ADRB2 gene was performed by the Taqman method, using the Step One Plus system. Independent t‐test, Mann‐Whitney and Chi‐square tests, as well as Spearman's correlation coefficient were used for the statistical analysis.

Results

Age, body weight, height, FEV1, FVC and FEV1/FVC ratio were lower in the EIB+ group when compared to EIB− (p<0.05). There were no significant differences in the proportion of the allele at position 27 and Arg16Gly and Gln27Glu genotypes between the EIB+ and EIB− groups (p=0.26; p=0.97 and p=0.43, respectively). However, there was a trend towards statistical significance regarding the greater proportion of the Gly16 allele for the EIB+ when compared to the EIB− group (p=0.08).

Conclusions

The presence of polymorphisms associated with the Glu27 allele and Arg16Gly and Gln27Glu genotypes had no influence on EIB. However, the statistical trend towards greater frequency of the Gly16 allele in individuals with EIB+ can be considered evidence of the influence of polymorphisms of the ADBR2 gene on EIB in adolescents.

Introdução

O broncoespasmo induzido pelo exercício (BIE) é definido como estreitamento transitório das vias aéreas que acontece logo após exercícios intensos em até 90% dos indivíduos asmáticos¹ e em quase 20% das pessoas sem histórico de doenças respiratórias.² A presença de excesso de peso pode contribuir para aumento da gravidade do BIE em asmático.³ O acúmulo excessivo de tecido adiposo na região central pode alterar a mecânica pulmonar e a resposta inflamatória das vias aéreas, levar ao aumento da contratilidade e da responsividade da musculatura lisa dos brônquios⁴ e limitar assim a prática de exercícios físicos⁵ como terapêutica na asma⁶ e na obesidade.⁷

Algumas alterações genéticas, como os polimorfismos nos receptores adrenérgicos beta 2 (ADRB2), têm sido associadas à presença de asma⁸ e de obesidade.⁹ O gene do ADRB2 está localizado no cromossomo 5q31 e pode ser encontrado em diversas regiões do corpo, inclusive na musculatura lisa.¹⁰ Os ADRB2 atuam mediados pela ação da adrenalina e da noradrenalina e promovem o relaxamento do músculo liso, até na região pulmonar,¹¹ além de desempenhar papel importante na broncodilatação durante o exercício em indivíduos saudáveis.¹² Os polimorfismos Arg16Gly e Gln27Glu do gene do ADRB2 vêm sendo relacionados a sintomas da asma,⁷ incluindo a redução da função pulmonar e da resposta broncodilatadora à medicação, pois têm influência negativa no efeito da medicação broncodilatadora,¹³ recurso terapêutico que faz parte da prevenção do BIE pré‐exercício.¹⁴

Recentemente, nosso grupo de pesquisas verificou maior presença de polimorfismo Arg16Gly em crianças e adolescentes asmáticos em comparação com os controles. Além disso, verificou‐se tendência a maior frequência do polimorfismo Gly16 em asmáticos com excesso de peso.¹⁵ Contudo, a influência da presença de polimorfismo no receptor ADRB2 na presença de BIE em crianças e adolescentes ainda não foi investigada. Nossa hipótese é que a maior frequência de polimorfismo no receptor ADRB2 poderia estar relacionada à maior presença de BIE nessa população. Portanto, o propósito do presente estudo foi determinar a influência dos polimorfismos no gene ADRB2 no desencadeamento de BIE em adolescentes.

Método

Estudo transversal com 160 adolescentes de ambos os sexos, de etnia branca, entre 9‐17 anos, selecionados por conveniência e provenientes de escolas públicas de Curitiba (PR). A amostra foi dividida em dois grupos, BIE presente (BIE+) (n=45) e BIE ausente (BIE−) (n=115). Constatou‐se presença de BIE quando houve queda maior ou igual a 10% do VEF₁ em relação ao valor basal no teste de broncoprovocação por exercício. Todos os participantes e responsáveis assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido, conforme projeto de pesquisa aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná (protocolo n° 2460.067/2011‐03). O cálculo amostral foi feito com nível de confiança de 95% e a fórmula descrita por Santos.¹⁶ O tamanho da amostra calculado foi de 246 escolares. Entretanto, o número de participantes foi de 160 adolescentes, 65% da amostra prevista, em função da complexidade dos exames e da necessidade de coleta sanguínea.

Mensurou‐se a massa corporal (kg) em balança digital (Toledo^®), com resolução de 0,1kg, e a estatura (cm) em estadiômetro (Sanny^®) com resolução de 0,1cm. O Índice de Massa Corporal (IMC) foi calculado pela fórmula IMC (kg/m²)=Massa corporal (kg)/Estatura² (m). Essa variável foi convertida para IMC‐escore Z, por meio do software WHO Anthroplus v.1.0.4 desenvolvido pela Organização Mundial da Saúde (OMS), classificado de acordo com os pontos de corte propostos pela OMS em 2006.¹⁷

A circunferência abdominal (CA) foi mensurada em centímetros (cm) com fita antropométrica inextensível (Cardiomed^®), medida no ponto médio entre o último arco costal e a crista ilíaca, com o indivíduo de pé, abdome relaxado e braços ao longo do corpo. Para classificação, usaram‐se os valores propostos por Fernandéz et al., em 2004.¹⁸

Para o diagnóstico da asma, conforme o III Consenso Brasileiro do Manejo da Asma (SBPT, 2002),¹⁹ usaram‐se a avaliação médica e o questionário do International Study of Asthma and Allergies in Childhood (Isaac) e confirmou‐se a doença por meio da questão de número 6.

A função pulmonar foi avaliada por espirometria no pré‐exercício e pós‐exercício (5, 10 e 15 minutos). Fizeram‐se três manobras, com o avaliado em posição sentada e com clipe nasal. Foram selecionadas as curvas que apresentaram os maiores valores para as variáveis de volume expiratório forçado no primeiro segundo (VEF₁) e capacidade vital forçada (CVF) em litros (L). Os valores preditos e o coeficiente expiratório forçado (VEF₁/CVF) foram mostrados pelo software do espirômetro (marca One Flow^®), que usa como referência os valores propostos por Knudson et al.²⁰

O teste de broncoprovocação com exercício foi feito em ambiente controlado (temperatura entre 20‐25°C e umidade relativa de 50%), no período da tarde, em esteira ergométrica (modelo Master Super ATL‐Inbramed), com um protocolo que consistiu em caminhar/correr durante oito minutos, em intensidade superior a 85% da frequência cardíaca máxima (FC_máx), de acordo com o guia da American Thoracic Society.¹⁴ A FC_máx foi calculada por meio da fórmula proposta por Tanaka et al.²¹ e monitorada, durante o teste, por frequencímetro (Polar^®). Os avaliados foram orientados a não ingerir bebidas à base de cafeína, duas horas antes da avaliação, suspender o uso de broncodilatadores de ação curta e longa, 48 horas e cinco dias antes das avaliações, respectivamente. O exercício não foi feito quando houve relato de crise de asma ou infecção viral nas vias aéreas nas últimas quatro semanas antes do teste. A intensidade da queda foi calculada pela queda máxima do VEF₁ (QMVEF₁) por meio da equação: QMVEF₁=[(VEF₁ pré‐exercício‐VEF₁ pós‐exercício mais baixo)/VEF₁ pré‐exercício]×100.¹⁴

A extração do DNA ocorreu por meio de amostra sanguínea, com a genotipagem dos polimorfismos Arg16Gly e Gln27Glu do gene ADRB2 pelo método Taqman, por meio do kit TaqMan SNP genotyping assays da Applied Biosystems e do software Eppendorf realplex v.1.5, com o uso do aparelho de Step One Plus. A seguir, foi feito um gráfico de dispersão (XY) para a separação FAM‐VIC e consequente determinação do genótipo de cada adolescente para cada polimorfismo. Classificaram‐se como usuais os indivíduos homozigóticos para o aminoácido arginina no códon 16 (ArgArg) e glutamina no códon 27 (GlnGln) e como portadores os indivíduos homozigóticos, na posição 16, para o aminoácido glicina (GlyGly) e, na posição 27, para ácido glutâmico (GluGlu), bem como os heterozigóticos.

A análise estatística foi feita no software SPSS versão 19. A normalidade foi verificada pelo teste de Kolmogorov‐Smirnov. Para comparação dos grupos, aplicou‐se o teste t de Student nas variáveis paramétricas e o teste U de Mann‐Whitney nas não paramétricas. O teste qui‐quadrado foi usado para analisar as proporções entre os grupos. A correlação entre as variáveis foi avaliada pelo coeficiente de correlação de Spearman e classificadas de acordo com Dancey e Reidy.²² O nível de significância adotado foi de p<0,050.

Resultados

As características basais dos grupos são mostradas na tabela 1. Foram encontradas diferenças nas variáveis idade, massa corporal, estatura, VEF₁ (tanto em litros quanto no percentual do predito) e CVF em litros e na relação VEF₁/CVF, menores no grupo BIE+.

Tabela 1.

Características antropométricas e espirométricas basais dos grupos broncoespasmo induzido pelo exercício (BIE) presente (+) e ausente (−)

Variáveis	BIE+(n=45)	BIE−(n=115)	t ou U	p‐valor
Idade (anos)^a	13,6±1,6	14,5±1,5^**	4,05	0,00
Massa corporal (kg)	65,0±15,2	74,5±18,3^**	−3,09	0,00
Estatura (cm)	160,4±9,4	165,5±8,9^**	−3,18	0,00
IMC (kg/m^2)	25,3±5,5	27,0±5,3	−1,88	0,06
IMC escore‐z	1,6±1,3	1,9±1,2	−1,30	0,19
CA (cm)	84,6±13,6	84,9±13,9	1,57	0,12
VEF1 (L)	2,9±0,5	3,4±0,6^**	−4,28	0,00
VEF1 (% predito)	95,4±10,8	102,0±18,8^*	−2,21	0,02
CVF (L)	3,4±0,7	3,9±0,8^**	−3,57	0,00
CVF (% predito)	102,3±12,2	106,0±13,4	−1,61	0,10
VEF1/CVF (%)^a	86,7±10,3	88,5±7,0^*	2,01	0,04

IMC, índice de massa corporal; CA, circunferência abdominal; VEF₁, volume expiratório forçado no 1° segundo; CVF, capacidade vital forçada; VEF₁/CVF, razão entre VEF₁ e CVF.

Valores expressos em média ± desvio padrão.

^*p<0,05; ^**p<0,01.

a

Variáveis que não apresentaram distribuição normal.

Com relação aos polimorfismos do gene do ADRB2, não foram encontradas diferenças significativas para o alelo 27 e para os genótipos do polimorfismo Arg16Gly e Gln27Glu entre os grupos BIE+ e BIE− (p=0,26; p=0,97 e p=0,43, respectivamente). Porém, foi encontrada uma tendência à significância estatística para maior proporção de polimorfismo do alelo 16 entre o grupo BIE+ comparado com o BIE− (p=0,08) (tabela 2).

Tabela 2.

Frequência dos alelos e genótipos do gene ADRB2 entre os grupos broncoespasmo induzido pelo exercício (BIE) presente (+) e ausente (−)

	BIE+	BIE−	X^2	p‐valor
Alelos
Arg	30 (37,5%)	103 (48,6%)	2,87	0,08
Gly	50 (62,5%)	109 (51,4%)
Total	80 (100%)	212 (100%)
Gln	47 (69,1%)	140 (69,3%)	0,001	0,97
Glu	21 (30,9%)	62 (30,7%)
Total	68 (100%)	202 (100%)
Genótipos
ArgArg	7 (17,5%)	28 (26,4%)	2,64	0,26
ArgGly	16 (40,0%)	47 (44,4%)
GlyGly	17 (42,5%)	31 (29,2%)
Total	40 (100%)	106 (100%)
GlnGln	19 (55,9%)	51 (50,5%)	1,68	0,43
GlnGlu	9 (26,5%)	38 (37,6%)
GluGlu	6 (17,6%)	12 (11,9%)
Total	34 (100%)	101 (100%)

Arg, arginina; Gly, glicina; Gln, glutamina; Glu, ácido glutâmico; valores expressos em frequência absoluta e relativa.

O percentual de queda máxima do VEF₁ apresentou correlação moderada com a presença de asma (rho=0,47; p<0,01). Entretanto, para as variáveis IMC escore‐z (rho=0,01), CA (rho=0,20), polimorfismo Arg16Gly (−0,01) e Gln27Glu (rho=−0,07) não foram encontradas correlações significativas.

Discussão

O objetivo do presente estudo foi determinar a influência dos polimorfismos no gene ADRB2 no desencadeamento de BIE em adolescentes. Não foram encontradas diferenças significativas nas frequências para o alelo 27 e para os genótipos do alelo Arg16Gly e Gln27Glu no grupo BIE+ comparado com o BIE−, o que refuta, em parte, nossa hipótese inicial. Porém, verificou‐se uma tendência à significância estatística para uma maior frequência do alelo 16 no grupo BIE+ comparado com o BIE−. Esse achado pode ser considerado um indício da relação entre polimorfismos no gene ADRB2 e a presença de BIE.

Os indivíduos com diagnóstico de BIE+ apresentaram função pulmonar reduzida em relação aos BIE−, com exceção da CVF (% do predito), que não diferiu entre os dois grupos.²³ Por outro lado, estudos anteriores não identificaram tais diferenças ao avaliar adolescentes obesos,²⁴ obesos asmáticos³ e com rinite.²⁵ Essas divergências podem ser justificadas pelas diferenças na idade e na estatura inicial dos grupos na presente pesquisa.

O percentual de queda máxima VEF1 apresentou correlação moderada com histórico de asma, o que difere do resultado encontrado por Cichalewski et al.²⁶ As diferenças metodológicas quanto ao diagnóstico do BIE podem explicar essa discrepância, visto que na presente pesquisa foi feito teste de broncoprovocação em esteira e, no estudo de Cichalewski et al.,²⁶ foi feito 45 minutos após uma aula de educação física. Por outro lado, ambas as pesquisas não identificaram relação do BIE com IMC.

Não foram encontrados estudos anteriores que avaliassem a frequência dos polimorfismos ADRB2 em indivíduos com e sem BIE. Nesta pesquisa, a frequência do alelo Gly16 foi de 62,5% e 30,7% para o alelo Glu27. A proporção do primeiro foi mais elevada do que em estudo feito em asmáticos que encontrou 46,6%.⁸ Entretanto, é semelhante aos achados para a população em geral (61%).²⁷ A frequência do alelo Glu27 foi semelhante entre os estudos.^8,27

Estudo feito por Snyder et al.²⁸ observou, em adultos saudáveis, que aqueles com o genótipo Arg16Arg e Gly16Gly têm respostas similares à broncodilatação durante o exercício. Entretanto, após o término da prova, os indivíduos homozigotos para o alelo Arg16 retornam de forma mais rápida aos valores basais ao ser comparados com os homozigóticos Gly16. Os autores justificam tal achado por uma possível dessensibilização do gene ADRB2 nessa população. Esses resultados diferem dos encontrados neste estudo, no qual não se notaram diferenças na frequência entre os genótipos, o que pode realmente confirmar não haver influência desse gene nos indivíduos com BIE.

Os polimorfismos do gene ADRB2 podem estar relacionados com a asma principalmente por estar associados a maior sensibilidade nas vias aéreas.⁸ A hiper‐responsividade brônquica é uma das características primordiais da asma e pode ser desencadeada por diversos fatores, dentre eles o exercício.²⁹ Estudo feito por Fukui et al.³⁰ mostrou que os indivíduos com maior responsividade ao teste provocado por metacolina apresentavam polimorfismo no códon 16. O BIE pode ser considerado como uma resposta exacerbada das vias aéreas.¹ Assim, esperava‐se que os polimorfismos apresentassem influência na resposta broncoconstritora ao exercício, o que acabou não ocorrendo.

O desenho transversal do estudo limita as relações de casualidade entre as variáveis. Outra questão a destacar como fator limitante é o baixo número de participantes para as análises de polimorfismos genéticos, o que leva à interpretação cautelosa dos achados da pesquisa. Sugerem‐se estudos com maior número de indivíduos para confirmar a associação entre a presença do alelo Gly16 e a manifestação de BIE. Há necessidade de novas investigações com o controle das limitações citadas e com o uso da espirometria nos tempos 3; 5; 10 15 e 30 minutos após teste de broncoprovocação por exercício, para evitar possíveis erros de diagnóstico do BIE.

Conclui‐se que a presença de polimorfismos associados ao alelo Glu27 e aos genótipos Arg16Gly e Gln27Glu não influenciou na manifestação de BIE. Porém, a tendência estatística observada para uma maior frequência do alelo Gly16 nos indivíduos com a presença de BIE pode ser considerada um indício da influência de polimorfismos no gene ADBR2 no BIE em adolescentes.

Financiamento

Fundação Araucária, processo n° 19.281.

Conflitos de interesse

Os autores declaram não haver conflitos de interesse. LFA é pesquisadora da Fundação Araucária, LRS é bolsista de doutorado da Capes, WAL é bolsista de doutorado do CNPq, CRC e NL são bolsistas de produtividade do CNPq.