Objetivos: A compreensão da dinâmica periodontal biofilme‐hospedeiro, in situ, é crucial para melhorar o diagnóstico e definir tratamentos mais racionais e eficazes. Este trabalho tem como objetivo o desenvolvimento de sondas de ácido peptídico nucleico (PNA), um mímico do DNA, para a identificação e localização de Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans) e Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) em amostras de placa subgengival e biópsias gengivais, pelo método de hibridação fluorescente in situ (FISH).
Materiais e métodos: Foi desenhada uma sonda de PNA para cada microrganismo. Para tal, oligonucleotídeos com 15 pares de bases com elevada sensibilidade e especificidade, entre outras características, foram identificados recorrendo ao programa Primerose acoplado à base de dados de rRNA 16S do RDP‐II. As sequências selecionadas foram sintetizadas (PANAGENE, Coreia do Sul). O método PNA‐FISH foi otimizado em laboratório para permitir a hibridação simultânea das sondas (PNA‐FISH multiplex). Depois de testado em estirpes representativas de P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans, o método de PNA‐FISH foi adaptado para a deteção de microrganismos na placa subgengival e biópsias gengivais de pacientes com periodontite grave.
Resultados: As melhores condições de hibridação para as 2 sondas (PgPNA1007 e AaPNA235) foram alcançadas à temperatura de 59°C, durante 150 minutos. A sensibilidade e especificidade in silico foram ambas de 100% para a sonda PgPNA1007 e de 100 e 99,9% para a sonda AaPNA235, respetivamente. Ambas apresentaram um desempenho teórico superior a sondas de DNA desenvolvidas até à data. A aplicação da técnica a amostras de placa bacteriana subgengival revelou ausência de A. actinomycetemcomitans na nossa amostra. A P. gingivalis mostrou‐se presente e exibiu ocasionalmente uma organização em microcolónias. Os resultados em biópsias de tecido gengival mostraram que as sondas AaPNA235 e PgPNA1007 foram capazes de detetar, discriminar e colocalizar ambas as espécies. Foi interessante observar a existência de células epiteliais superinvadidas por P. gingivalis a contrastar com células não invadidas ou pouco invadidas.
Conclusões: Esta investigação apresenta um novo método para discriminar e colocalizar P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans em amostras clínicas, em apenas algumas horas. Com esta técnica foi possível observar, pela primeira vez, a distribuição espacial simultânea destas espécies em biópsias de tecido gengival organizado, pela técnica de FISH.