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ARTÍCULO ORIGINAL
Caracterización de patrones de hordeínas en variedades mexicanas de cebada maltera
Marisol Salgado-Albarrána, Jorge Herrera-Díazb, Tzvetanka D. Dinkovaa,
Autor para correspondencia
cesy@unam.mx

Autor para correspondencia. Ciudad Universitaria, Deleg. Coyoacán, C.P. 04510, México.
a Departamento de Bioquímica, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México
b Unidad de Servicios de Apoyo a la Investigación y la Industria, Facultad de Química, Universidad Nacional Autónoma de México
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que en cebada son llamadas horde&#237;nas&#46; Las horde&#237;nas presentan un alto grado de polimorfismo&#44; y su acumulaci&#243;n y estabilidad en el grano se han relacionado frecuentemente con la calidad de la malta y cerveza<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0010"><span class="elsevierStyleSup">2&#44;3</span></a>&#46; Es por ello que la caracterizaci&#243;n de sus patrones en diversas variedades es parte crucial para el mejoramiento gen&#233;tico de la cebada&#46;</p></span><span id="sec0010" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0030">Variedades de cebada en M&#233;xico</span><p id="par0010" class="elsevierStylePara elsevierViewall">La cebada es una planta anual con distintas variedades&#44; entre las que destacan aqu&#233;llas cuyas espigas presentan un ordenamiento de los granos en dos o seis hileras<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0020"><span class="elsevierStyleSup">4</span></a>&#46; Cada variedad de cebada tiene diferencias en la composici&#243;n de su semilla &#40;entre otras caracter&#237;sticas que en este trabajo no se abordan&#41;&#44; y es de acuerdo a esto&#44; que cada una tiene distinta calidad para su prop&#243;sito final&#46; Por ejemplo&#44; la cebada sin c&#225;scara requiere poco o casi ning&#250;n esfuerzo para su remoci&#243;n durante el procesamiento del grano y por lo tanto&#44; estas variedades son las m&#225;s adecuadas para el consumo humano en forma de alimento&#46; En contraste&#44; la cebada con c&#225;scara es preferida para la producci&#243;n de cerveza debido a que este tejido contribuye al sabor y ayuda en las filtraciones respectivas&#46; No obstante&#44; es dif&#237;cil distinguir el grano de cebada adecuado para cada uso&#44; ya que existen pocos criterios que permiten diferenciar entre variedades<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0005"><span class="elsevierStyleSup">1</span></a>&#46;</p><p id="par0015" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Algunas variedades tienen un alto rendimiento en grano y producen semillas ricas en prote&#237;nas&#46; Contrariamente&#44; otras variedades tienen poca producci&#243;n de granos&#44; pero sus cualidades se adaptan bien a los procesos de malteo&#46; Entre estas &#250;ltimas&#44; destaca la variedad Metcalfe de dos hileras &#40;denominada HV2008-08&#44; o simplemente 08 en este trabajo&#41; por su desempe&#241;o durante el malteo&#44; siendo una de las variedades preferidas para este fin<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0025"><span class="elsevierStyleSup">5</span></a>&#46; En este estudio se utilizaron cinco variedades de cebada de seis hileras cultivadas en M&#233;xico&#58; HV2005-04&#44; HV2005-19&#44; HV2007-23&#44; HV2007-18&#44; HV2008-11&#44; denominadas en adelante como 04&#44; 19&#44; 23&#44; 18 y 11&#44; respectivamente&#46; Las variedades 19&#44; 23 y 18 se cultivan en la regi&#243;n del Baj&#237;o &#40;Guanajuato&#44; Quer&#233;taro&#44; Michoac&#225;n y Jalisco&#41; en condiciones de riego y las variedades 04 y 11 en el Altiplano &#40;Hidalgo&#44; Puebla Tlaxcala y Estado de M&#233;xico&#41; en condiciones de temporal<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0030"><span class="elsevierStyleSup">6</span></a>&#46; Estas variedades tienen diferentes propiedades&#44; entre ellas su composici&#243;n de prote&#237;nas&#46;</p></span><span id="sec0015" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0035">Las horde&#237;nas</span><p id="par0020" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Existe una gran familia de prote&#237;nas de almacenamiento en semillas de cereales llamadas prolaminas que constituyen una reserva de amino&#225;cidos presentes en la semilla para ser utilizados durante el desarrollo embrionario de la planta&#46; En el caso de las semillas de cebada&#44; las prolaminas se denominan horde&#237;nas&#44; las cuales son almacenadas en forma de cuerpos proteicos en el endospermo y presentan polimorfismos entre los genotipos de la especie&#46; La alta variabilidad se debe a que las prolaminas surgen de familias multig&#233;nicas y en algunos casos&#44; por el procesamiento proteol&#237;tico y glicosilaci&#243;n<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0010"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>&#46; Las horde&#237;nas tienen un tama&#241;o que va desde 30 hasta 100 kDa aproximadamente y se clasifican en tres grupos&#58; 1&#41; ricas en azufre &#40;horde&#237;nas B y &#947;&#41;&#44; 2&#41; pobres en azufre &#40;horde&#237;nas C&#41; y 3&#41; de alto peso molecular &#40;horde&#237;nas D&#41;&#46; Una caracter&#237;stica com&#250;n a los tres grupos es su solubilidad en mezclas de alcohol&#47;agua&#44; pero var&#237;an considerablemente en otras propiedades como el peso molecular&#44; punto isoel&#233;ctrico y composici&#243;n de amino&#225;cidos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0035"><span class="elsevierStyleSup">7</span></a>&#46; Por su gran variaci&#243;n genot&#237;pica han sido utilizadas como marcadores gen&#233;ticos<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0010"><span class="elsevierStyleSup">2</span></a>&#46;</p><p id="par0025" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las horde&#237;nas D tienen un tama&#241;o aproximado de 100 kDa y representan menos del 10&#37; del contenido total de la semilla&#46; Las horde&#237;nas C tienen un tama&#241;o de 55-70 kDa&#44; no contienen residuos de ciste&#237;na&#44; por lo que no tienden a formar complejos con otras prote&#237;nas y su abundancia es del 10-20&#37;&#46; Las horde&#237;nas B tienen un tama&#241;o de 36-44 kDa&#44; son ricas en residuos de ciste&#237;na&#44; por lo tanto pueden formar puentes disulfuro intra o intercatenarios y son las m&#225;s abundantes &#40;75-80&#37;&#41;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0035"><span class="elsevierStyleSup">7</span></a>&#46; Las horde&#237;nas &#947; son de tama&#241;o similar a las B y contienen residuos de ciste&#237;na pero son menos abundantes que &#233;stas&#46; Las horde&#237;nas &#947;1 y &#947;2 pueden formar puentes disulfuro intra o intercatenarios y se asocian con las B en los cuerpos proteicos&#46; La horde&#237;na &#947;3 solamente forma puentes disulfuro intracatenarios y es requerida para el transporte de las dem&#225;s horde&#237;nas a la vacuola<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0040"><span class="elsevierStyleSup">8</span></a>&#46;</p><p id="par0030" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las variedades mexicanas de cebada maltera presentan diferentes caracter&#237;sticas para la producci&#243;n y calidad de la malta&#46; Aunque existen datos agron&#243;micos y fenot&#237;picos a nivel de planta y semilla para estas variedades&#44; no hay datos sobre los polimorfismos a nivel de horde&#237;nas&#46; En este trabajo se propuso investigar la composici&#243;n de horde&#237;nas y su posible utilizaci&#243;n como marcadores moleculares en semillas y malta de cebada de diferentes variedades mexicanas&#46;</p></span><span id="sec0020" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0040">Materiales y M&#233;todos</span><span id="sec0025" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0045">Material vegetal</span><p id="par0035" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para la comparaci&#243;n de patrones de horde&#237;nas en semilla seca se utilizaron cinco variedades mexicanas de cebada maltera&#46; Para la comparaci&#243;n de patrones de horde&#237;nas en malta&#44; se utilizaron cuatro de las cinco variedades mexicanas y la variedad canadiense Metcalfe cuya malta es utilizada ampliamente en la obtenci&#243;n de cerveza a nivel mundial&#46;</p></span><span id="sec0030" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0050">Extracci&#243;n de horde&#237;nas</span><p id="par0040" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las horde&#237;nas fueron extra&#237;das utilizando un protocolo disponible para prolaminas de ma&#237;z con ciertas modificaciones<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0045"><span class="elsevierStyleSup">9</span></a>&#46; En el protocolo modificado&#44; las muestras de semillas o malta fueron molidas con nitr&#243;geno l&#237;quido en un mortero&#46; Se pesaron 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mg de la harina obtenida a partir de esta molienda en una balanza anal&#237;tica y se colocaron en un tubo de pl&#225;stico &#40;Eppendorf&#41; con capacidad de 2&#46;0<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mL&#46; Posteriormente se agreg&#243; a cada muestra 1&#46;6<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mL de amortiguador de extracci&#243;n&#44; el cual conten&#237;a 12&#46;5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM de borato de sodio&#44; 1&#37; de dodecil sulfato de sodio y 2&#37; de &#946;-mercaptoetanol a pH 10&#44; y se incubaron los tubos con agitaci&#243;n a 120<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>rpm a temperatura ambiente &#40;TA&#41; durante 5 horas&#46; Transcurrido este tiempo&#44; las muestras fueron centrifugadas a 11&#44;000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>rpm durante 15 minutos&#46; Se tom&#243; el sobrenadante y se agreg&#243; etanol de la siguiente forma&#58; por cada 500<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;L de sobrenadante&#44; se adicionaron 1&#46;2<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mL de etanol absoluto para alcanzar una concentraci&#243;n final de etanol equivalente al 70&#37;&#46; Las muestras se incubaron con agitaci&#243;n durante 1 hora a TA y se centrifugaron a 11&#44;000<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>rpm por 15 minutos&#46; Finalmente el sobrenadante que conten&#237;a las horde&#237;nas se almacen&#243; a -20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C para su posterior an&#225;lisis&#46;</p></span><span id="sec0035" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0055">Preparaci&#243;n de la muestra para electroforesis y an&#225;lisis de patrones de horde&#237;nas por SDS-PAGE</span><p id="par0045" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se tom&#243; una al&#237;cuota de 300<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;L de la fracci&#243;n con horde&#237;nas y se sec&#243; mediante evaporaci&#243;n utilizando un concentrador al vac&#237;o &#40;Centrivap Concentrator de Labconco Corporation&#174;&#44; Kansas USA&#41;&#46; Posteriormente el bot&#243;n se resuspendi&#243; en 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;L de amortiguador de carga para electroforesis desnaturalizante SDS-PAGE&#44; 1X&#46;</p><p id="par0050" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se prepararon por triplicado los geles de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio &#40;SDS-PAGE&#41; al 12&#46;5&#37;&#44; para obtener los patrones de horde&#237;nas correspondientes a la semilla seca o malta<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0050"><span class="elsevierStyleSup">10</span></a>&#46; Los geles se ti&#241;eron con Coomassie Coloidal G-250 al 0&#46;02&#37;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0055"><span class="elsevierStyleSup">11</span></a>&#46;</p><p id="par0055" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para cada uno de los triplicados de semilla seca&#44; las bandas seleccionadas de horde&#237;nas D&#44; C y B o &#947; se cuantificaron por densitometr&#237;a en un equipo Chemidoc MP System con el software Image Lab &#40;Bio-Rad&#44; M&#233;xico&#44; D&#46;F&#46;&#41;&#46; Se obtuvieron los valores de intensidad total de cada carril y de las bandas seleccionadas en unidades arbitrarias&#46; La intensidad de cada banda fue normalizada por la intensidad total del carril correspondiente para calcular las veces de cambio respecto al valor de la variedad 04 &#40;asign&#225;ndose un valor igual a uno en este caso&#41;&#46; Con estos datos se realiz&#243; un An&#225;lisis de Varianza &#40;ANOVA&#41; y t de Student para determinar si las diferencias entre variedades son significativas&#46;</p></span><span id="sec0040" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0060">Identificaci&#243;n por espectrometr&#237;a de masas</span><p id="par0060" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se seleccionaron algunas bandas diferenciales entre variedades para su identificaci&#243;n por espectrometr&#237;a de masas&#46; El tratamiento de muestra previo a la identificaci&#243;n fue realizado acorde al protocolo desarrollado en la Unidad de Servicios de Apoyo a la Investigaci&#243;n y la Industria &#40;USAII&#41; de la Facultad de Qu&#237;mica en la UNAM&#46; Brevemente&#44; las bandas de gel fueron cortadas en fragmentos peque&#241;os y se desti&#241;eron con 50&#37; de metanol &#40;v&#47;v&#41;&#44; 5&#37; de &#225;cido ac&#233;tico &#40;v&#47;v&#41; por 12 horas&#46; Posteriormente se lavaron con agua destilada y se incubaron por 15 minutos dos veces en 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM de bicarbonato de amonio&#46; Se redujeron en 50<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM DTT durante 45 minutos y se alquilaron con iodoacetamida 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM durante 2 horas&#46; Posteriormente se lavaron 3 veces con 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mM de bicarbonato de amonio&#46; Se deshidrataron completamente con 100&#37; de acetonitrilo y se llevaron a sequedad total&#46; La digesti&#243;n en gel fue llevada a cabo con 30<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;L de tripsina de porcino modificada &#40;Sigma-Aldrich Qu&#237;mica S&#46; de R&#46;L&#46; de C&#46;V&#46;&#44; Toluca&#44; M&#233;xico&#41; de una soluci&#243;n que conten&#237;a 20 ng&#47;&#956;L y se incubaron por 18 horas a 37<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#176;C&#46; En los protocolos modificados&#44; se utiliz&#243; la mezcla Trypsin-LysC de Promega &#40;Promega Corporation&#44; USA&#41; siguiendo el mismo procedimiento&#44; mientras que la digesti&#243;n secuencial con quimotripsina y tripsina se realiz&#243; acorde a Colgrave y colaboradores<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0015"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a>&#46;</p><p id="par0065" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Los p&#233;ptidos se extrajeron con 50&#37; de acetonitrilo &#40;v&#47;v&#41; y 5&#37; de &#225;cido f&#243;rmico &#40;v&#47;v&#41; en sonicaci&#243;n y se llevaron a sequedad total&#46; Posteriormente&#44; se resuspendieron en 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;L de &#225;cido f&#243;rmico al 1&#37; &#40;v&#47;v&#41;&#44; se desalaron en columnas Ziptip C18 y se eluyeron en 12<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;L de fase m&#243;vil &#40;97&#37; agua&#44; 3&#37; acetonitrilo y 0&#46;1&#37; de &#225;cido f&#243;rmico&#41;&#46;</p><p id="par0070" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El an&#225;lisis de p&#233;ptidos por espectrometr&#237;a de masas se llev&#243; a cabo utilizando un sistema nano-LC-ESI-MS&#47;MS integrado SYNAPT G2 de alta definici&#243;n &#40;Waters Corporation&#44; UK&#41; equipado con una fuente de iones NanoLockSpray y acoplado en l&#237;nea a un cromat&#243;grafo l&#237;quido nanoACQUITY Ultra Performance &#40;UPLC&#59; Waters Corporation&#41;&#46; El sistema de disolventes binario fue acetonitrilo 2&#37; en agua MilliQ con &#225;cido f&#243;rmico al 0&#46;1&#37; &#40;fase m&#243;vil A&#41; y 98&#37; de acetonitrilo en agua MilliQ con &#225;cido f&#243;rmico al 0&#46;1&#37; &#40;fase m&#243;vil B&#41;&#46; La muestra se inyect&#243; en una columna de trampa C18 UPLC de 5<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m&#44; 180<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;mx&#44; 20<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm &#40;Waters Corporation&#41; y se lav&#243; con 100&#37; de fase m&#243;vil A&#44; a una velocidad de flujo de 15<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;L&#47;min&#46; Los p&#233;ptidos se separaron en una columna BEH&#44; C18 UPLC de 1&#46;7<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;m&#44; 75<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;mx y 100<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>mm &#40;Waters Corporation&#41; utilizando un gradiente lineal hasta el 40&#37; de fase m&#243;vil B con una velocidad de flujo de 0&#46;3<span class="elsevierStyleHsp" style=""></span>&#956;L&#47;min&#46;</p><p id="par0075" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se realizaron b&#250;squedas en la base de datos UNIPROT utilizando tripsina como proteasa espec&#237;fica&#44; o en el caso de la digesti&#243;n secuencial&#44; quimotripsina y tripsina&#46; Los p&#233;ptidos coincidentes con las puntuaciones de PLGS &#62; 95&#37; de confianza fueron aceptados como correctos&#46; El umbral de puntuaci&#243;n en las condiciones anteriores fue de 52 para p &#60; 0&#46;05&#46;</p></span></span><span id="sec0045" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0065">Resultados</span><span id="sec0050" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0070">Patrones de horde&#237;nas en semilla seca</span><p id="par0080" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Las horde&#237;nas se obtuvieron de semillas correspondientes a plantas crecidas en condiciones de campo y colectadas en la misma &#233;poca del a&#241;o&#46; Como se describe en M&#233;todos&#44; para el an&#225;lisis por triplicado en geles se utiliz&#243; la misma cantidad de extracto etan&#243;lico de horde&#237;nas&#46; Dado que el m&#233;todo de extracci&#243;n requiere secar totalmente las horde&#237;nas a partir de los extractos etan&#243;licos y resuspender inmediatamente en amortiguador de carga para el gel&#44; no se determin&#243; la cantidad de prote&#237;nas previo a la separaci&#243;n por SDS-PAGE&#46; En cambio&#44; los carriles correspondientes a cada variedad fueron registrados en un Fotodocumentador Chemidoc MP System &#40;Bio-Rad&#44; M&#233;xico&#44; D&#46;F&#46;&#41; y analizados con el software Image Lab&#46; La densitometr&#237;a correspondiente a todo el carril fue utilizada en la normalizaci&#243;n por carga&#46;</p><p id="par0085" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">Figura 1</a> se muestran los patrones caracter&#237;sticos de semilla seca para las cinco variedades mexicanas de cebada maltera&#46; Las horde&#237;nas se separaron en grupos de distinto peso molecular que son similares a los reportados en la literatura<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0035"><span class="elsevierStyleSup">7</span></a>&#46; Los patrones fueron diferentes entre variedades&#59; algunas de las diferencias estad&#237;sticamente significativas se se&#241;alan con flechas y se muestra el an&#225;lisis de densitometr&#237;a a la derecha&#46; En el intervalo correspondiente a las horde&#237;nas C&#44; se detecta una banda de 65 kDa con niveles mayores en 04 y 11&#44; menores en 19 y 23&#44; y pr&#225;cticamente ausente para la variedad 18&#46; Las horde&#237;nas del grupo B fueron las m&#225;s abundantes en todas las variedades y en el intervalo de tama&#241;o de 37-45 kDa se observaron algunas bandas caracter&#237;sticas s&#243;lo para las variedades 23 y 18&#46; La presencia de horde&#237;nas D&#44; de mayor peso molecular &#40;100 kDa&#41;&#44; fue notoria para las variedades 04&#44; 23 y 18 pero fue significativamente menor en las variedades 19 y 11&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0005"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0055" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0075">Patrones de horde&#237;nas en malta</span><p id="par0090" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para el an&#225;lisis de malta se sigui&#243; el mismo protocolo que en semilla seca&#46; Sin embargo&#44; es importante mencionar que mientras que la cantidad de prote&#237;na en el extracto etan&#243;lico de semilla seca fue similar entre variedades&#44; en el caso de la malta hubo diferencias notables &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0010">Figura 2</a>&#41;&#46; Por ejemplo&#44; la malta de la variedad 04 pr&#225;cticamente no tiene prolaminas &#237;ntegras&#44; similar a 18&#44; que presenta s&#243;lo algunas bandas muy tenues de 50&#44; 40 y 30 kDa&#46; En cambio&#44; la variedad 19 muestra dos bandas mayoritarias de aproximadamente 60 y 50 kDa&#46; De las variedades mexicanas&#44; la 23 es la que presenta un mayor n&#250;mero de bandas implicando que probablemente para esta variedad se mantiene una mayor cantidad de horde&#237;nas despu&#233;s del malteo&#46; Es interesante se&#241;alar que el patr&#243;n de horde&#237;nas en malta de la variedad canadiense Metcalfe &#40;carril 08&#41; presenta tres bandas intensas en un tama&#241;o de 37-50 kDa que no se observan en los patrones de la malta de cebada mexicana&#46; En ninguna de las maltas se detectaron horde&#237;nas correspondiente al peso molecular del grupo D&#44; y la banda de mayor tama&#241;o fue de aproximadamente 60 kDa&#46; Sin embargo&#44; en la malta es imposible predecir mediante los patrones de gel el grupo de horde&#237;nas al que pertenece cada banda&#44; ya que ha tenido lugar una degradaci&#243;n&#44; al menos parcial&#44; de las prote&#237;nas de reserva y adem&#225;s estas prote&#237;nas tienden a formar asociaciones en c&#250;mulos que aun en condiciones de electroforesis desnaturalizante son dif&#237;ciles de deshacer&#46;</p><elsevierMultimedia ident="fig0010"></elsevierMultimedia></span><span id="sec0060" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0080">Identificaci&#243;n de horde&#237;nas por espectrometr&#237;a de masas</span><p id="par0095" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Al comprobar la reproducibilidad de los patrones de horde&#237;nas por lotes analizados&#44; se procedi&#243; con la identificaci&#243;n de prote&#237;nas en algunas de las bandas se&#241;aladas con flecha para semilla y malta &#40;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#fig0005">Figuras 1 y 2</a>&#41;&#46; Los criterios de selecci&#243;n de las bandas fueron los siguientes&#58;<ul class="elsevierStyleList" id="lis0005"><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0005"><span class="elsevierStyleLabel">1&#46;</span><p id="par0100" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se seleccion&#243; un mayor n&#250;mero de bandas en malta correspondientes a las variedades 23 y 08&#44; debido a sus patrones contrastantes&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0010"><span class="elsevierStyleLabel">2&#46;</span><p id="par0105" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En el caso de semilla seca se identific&#243; la banda de aproximadamente 100 kDa en dos variedades para determinar si hab&#237;a diferencias cualitativas en su composici&#243;n &#40;23 y 04&#41;&#46;</p></li><li class="elsevierStyleListItem" id="lsti0015"><span class="elsevierStyleLabel">3&#46;</span><p id="par0110" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Asimismo&#44; para la malta de la variedad 19 se eligi&#243; la banda de aproximadamente 45 kDa porque por su abundancia parec&#237;a ser la &#250;nica resistente a una degradaci&#243;n en la malta de esta variedad&#46;</p></li></ul></p><p id="par0115" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Adem&#225;s&#44; las bandas se nombraron con una clave que contiene una letra &#40;M o S&#44; malta o semilla&#41;&#44; la variedad y un n&#250;mero para distinguir bandas de una misma variedad que se muestra en cada uno de los patrones &#40;<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#fig0005">Figuras 1 y 2</a>&#41;&#46; Por ejemplo&#44; la muestra M08-2 se refiere a la banda n&#250;mero 2 de la variedad 08 de malta&#46;</p><p id="par0120" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se ha reportado en diversos estudios que las prolaminas pueden presentar problemas de identificaci&#243;n por la dificultad de ser digeridas por la tripsina&#44; com&#250;nmente utilizada en estudios de prote&#243;mica&#46; Con el fin de evaluar con qu&#233; enzimas se mejoraba la identificaci&#243;n de las horde&#237;nas por EM&#44; se siguieron dos protocolos distintos adem&#225;s del est&#225;ndar con tripsina &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">Tabla I</a>&#41;&#46; Uno de &#233;stos fue realizado acorde a Colgrave y colaboradores<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0015"><span class="elsevierStyleSup">3</span></a> quienes reportaron un protocolo de digesti&#243;n secuencial utilizando tripsina y quimotripsina&#44; que permiti&#243; la identificaci&#243;n por EM de prote&#237;nas distintas a las encontradas usando &#250;nicamente tripsina&#46; Cabe mencionar que algunas de las muestras correspondientes a las bandas seleccionadas fueron tratadas por los tres protocolos &#40;M23-2 y M08-1&#41;&#44; mientras que otras se trataron con uno o dos de estos procedimientos &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0005">Tabla I</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0005"></elsevierMultimedia><p id="par0125" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En la <a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0010">Tabla II</a> se observa que utilizando el protocolo de digesti&#243;n &#250;nicamente con tripsina se identificaron principalmente las horde&#237;nas B3 y &#947;1&#46; Utilizando la mezcla Trypsin-LysC de Promega grado EM&#44; se increment&#243; la eficiencia de corte en los sitios de lisina&#44; por lo que se logr&#243; identificar adem&#225;s a la horde&#237;na &#947;3&#46; Finalmente&#44; al realizar la digesti&#243;n secuencial con quimotripsina y tripsina&#44; se identificaron las horde&#237;nas C aunque solamente en las bandas correspondientes a semilla &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0010">Tabla II</a>&#41;&#46; La horde&#237;na B3 fue identificada en varias de las bandas analizadas&#44; lo que corresponde a prote&#237;nas de diferente tama&#241;o e incluye las bandas M23-1&#44; S04-1 y S23-1 de tama&#241;o mayor al esperado para este grupo de horde&#237;nas &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#fig0005">Figura 1</a>&#41;&#46; Por otro lado&#44; en la banda M19-1 no se identificaron horde&#237;nas&#44; pero s&#237; otro tipo de prote&#237;nas &#40;datos no mostrados&#41; importantes en el proceso de malteo&#46; La diversidad de horde&#237;nas identificadas fue mayor para las muestras de semilla madura &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0010">Tabla II</a>&#41;&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0010"></elsevierMultimedia><p id="par0130" class="elsevierStylePara elsevierViewall">De manera interesante&#44; los p&#233;ptidos identificados en el an&#225;lisis por espectrometr&#237;a de masas indican distinto grado de degradaci&#243;n de las horde&#237;nas en las muestras de malta &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0015">Tabla III</a>&#41;&#46; Por ejemplo&#44; para la horde&#237;na B3 se observa un gran n&#250;mero y diversidad de p&#233;ptidos truncados en malta que no contienen lisina o arginina en el extremo C-terminal como cabr&#237;a esperar de una digesti&#243;n tr&#237;ptica&#46; En cambio&#44; la mayor&#237;a de p&#233;ptidos identificados en la semilla para esta horde&#237;na s&#237; contienen los amino&#225;cidos esperados en el C-terminal&#46; Lo mismo se puede observar para la horde&#237;na &#947;1&#46;</p><elsevierMultimedia ident="tbl0015"></elsevierMultimedia></span></span><span id="sec0065" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0085">Discusi&#243;n</span><p id="par0135" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En este trabajo se realiz&#243; un primer acercamiento a la variabilidad en los patrones de horde&#237;nas en variedades mexicanas de cebada maltera&#46; Los patrones fueron obtenidos con un m&#233;todo que permite tener extractos ricos en horde&#237;nas y se basa en las propiedades qu&#237;micas de &#233;stas&#58; son insolubles en agua&#44; pero altamente solubles en etanol al 70&#37;&#46; De hecho&#44; las prolaminas fueron descubiertas gracias a esta caracter&#237;stica<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0035"><span class="elsevierStyleSup">7</span></a>&#46; Los patrones de semilla seca fueron reproduciblemente distintos entre las variedades analizadas&#44; lo que apoya su utilidad como marcadores moleculares para an&#225;lisis gen&#233;ticos en la cebada mexicana y ofrece la posibilidad de correlacionar su presencia&#47;ausencia con caracter&#237;sticas de la malta obtenida a partir de las variedades cultivadas&#46; Por ejemplo&#44; las horde&#237;nas cuya migraci&#243;n en el gel corresponde al grupo D se encuentra disminu&#237;da significativamente en las variedades 19 y 11&#44; mientras que las horde&#237;nas del grupo C muestran menor contenido en las variedades 19&#44; 23 y 18&#46; Por otra parte&#44; s&#243;lo las variedades 23 y 18 presentaron una banda caracter&#237;stica en el rango de horde&#237;nas B o &#947; que se no se detect&#243; en las dem&#225;s variedades&#46; Si aunado a estos datos se cuenta con conocimiento sobre algunas caracter&#237;sticas fenot&#237;picas deseables en cada una de las variedades es posible seguir a los marcadores propuestos en cruzas gen&#233;ticas y an&#225;lisis de caracter&#237;sticas en la descendencia deseables para la semilla y malta obtenida a partir de &#233;sta&#46; En algunos estudios se ha reportado correlaci&#243;n entre bandas particulares de horde&#237;nas en variedades de cebada brasile&#241;as y la calidad de la malta obtenida de estas variedades<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0060"><span class="elsevierStyleSup">12</span></a>&#46; Recientemente&#44; en otro estudio de prote&#237;nas asociadas con la calidad de la malta&#44; la horde&#237;na &#947;3 fue identificada con mayores niveles en micromalteo&#44; para una l&#237;nea de cebada con mejores caracter&#237;sticas en malta<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0065"><span class="elsevierStyleSup">13</span></a>&#46; En el an&#225;lisis de horde&#237;nas de semilla seca no se cont&#243; con muestra de la variedad canadiense Metcalfe&#44; por lo que en un futuro ser&#237;a interesante comparar los patrones de las variedades mexicanas con el correspondiente a esta variedad&#46;</p><p id="par0140" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Para determinar si la presencia&#47;ausencia de bandas de horde&#237;nas en los patrones de semillas maduras de las variedades de cebada analizadas es debida a polimorfismos gen&#233;ticos&#44; es necesario obtener los patrones a partir de plantas cultivadas en diferentes condiciones ambientales&#46; Es conocido que los patrones de horde&#237;nas se ven modificados por la disponibilidad de algunos nutrientes en el suelo&#44; como es la fuente de nitr&#243;geno y azufre&#46; En este sentido&#44; Rahman y colaboradores<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0070"><span class="elsevierStyleSup">14</span></a> demuestran que la falta de azufre en cebada produce una disminuci&#243;n en la acumulaci&#243;n de las horde&#237;nas B &#40;ricas en azufre&#41; con poco o ning&#250;n efecto en las horde&#237;nas C &#40;pobres en azufre&#41;&#46; Adem&#225;s&#44; Qi y colaboradores<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0075"><span class="elsevierStyleSup">15</span></a> evaluaron el efecto de la disponibilidad de nitr&#243;geno en la acumulaci&#243;n de los diferentes grupos de horde&#237;nas y encontraron que los grupos B&#44; C y D aumentan su acumulaci&#243;n con altas concentraciones de nitr&#243;geno&#44; siendo las C y D las que se modifican en mayor medida&#46; Finalmente&#44; tambi&#233;n se conoce que la temporada de siembra influye en el contenido de prote&#237;na total y de horde&#237;nas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0080"><span class="elsevierStyleSup">16</span></a>&#46;</p><p id="par0145" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En el an&#225;lisis de patrones de horde&#237;nas en malta seca&#44; se observa un cambio importante respecto a los patrones en semilla seca&#44; ya que ha ocurrido el proceso de germinaci&#243;n donde se produce la prote&#243;lisis de muchas prote&#237;nas almacenadas en la semilla&#46; Adem&#225;s&#44; la semilla germinada ha sido posteriormente secada en condiciones controladas<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0020"><span class="elsevierStyleSup">4</span></a>&#46; En los patrones se advierte el grado de degradaci&#243;n que han sufrido las horde&#237;nas durante la germinaci&#243;n&#44; el cual es notoriamente diferente entre variedades&#46; Estudios sobre la composici&#243;n de horde&#237;nas en malta y cerveza indican que varias de estas prote&#237;nas mantienen su presencia a lo largo de todo el proceso aunque el contenido global disminuye considerablemente<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0015"><span class="elsevierStyleSup">3&#44;17</span></a>&#46; Por ejemplo&#44; se ha reportado que las horde&#237;nas de tipo D y C son las que sufren mayor degradaci&#243;n<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0085"><span class="elsevierStyleSup">17</span></a>&#59; por el contrario&#44; las &#947;3 y B resisten el proceso y&#44; en conjunto con otras prote&#237;nas no-prolaminas&#44; tienen un papel importante en la generaci&#243;n de la turbidez en la cerveza<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#bib0090"><span class="elsevierStyleSup">18</span></a>&#46; Es por esto que las prote&#237;nas presentes en la malta &#40;principalmente las horde&#237;nas&#41; tienen una influencia importante en las caracter&#237;sticas de la cerveza&#44; siendo necesaria una cantidad adecuada para estabilizar la espuma pero sin un exceso que podr&#237;a generar turbidez o hacer m&#225;s costoso el proceso&#46;</p><p id="par0150" class="elsevierStylePara elsevierViewall">En la malta es imposible predecir mediante los patrones de gel el grupo de horde&#237;nas al que pertenece cada banda&#46; Adem&#225;s&#44; estas prote&#237;nas tienden a formar asociaciones en c&#250;mulos&#44; lo cual se favorece en el proceso de malteo por las condiciones de temperatura&#46; Sin embargo&#44; los patrones que se obtuvieron en este estudio permiten distinguir a la variedad 04 como la que presenta mayores niveles de degradaci&#243;n de horde&#237;nas lo que coincide con un comportamiento m&#225;s favorable de esta malta para el proceso de producci&#243;n de cerveza&#46;</p><p id="par0155" class="elsevierStylePara elsevierViewall">El patr&#243;n de horde&#237;nas en malta de Metcalfe es muy distinto al de las variedades mexicanas y sorpresivamente no se distingue por presentar la mayor degradaci&#243;n de estas prote&#237;nas&#46; Considerando que Metcalfe produce una malta que se adapta muy bien a los procesos cerveceros&#44; es posible que las prote&#237;nas contenidas en las bandas observadas sean indicativas de c&#250;mulos de horde&#237;nas que no afectan el proceso&#46; De las variedades mexicanas&#44; adem&#225;s de la malta correspondiente a 04&#44; la variedad 18 tambi&#233;n present&#243; un elevado grado de degradaci&#243;n de horde&#237;nas&#46; Esto puede deberse no s&#243;lo al tipo de horde&#237;nas&#44; sino tambi&#233;n a la abundancia o actividad de proteasas e inhibidores de proteasas que degradan horde&#237;nas<a class="elsevierStyleCrossRefs" href="#bib0095"><span class="elsevierStyleSup">19&#44;20</span></a>&#46;</p><p id="par0160" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Dado que la presencia de horde&#237;nas intactas o poco degradadas normalmente se ha correlacionado con problemas en la producci&#243;n de cerveza&#44; es importante conocer la identidad de las bandas con mayor intensidad en los patrones correspondientes a la malta&#46; Es por ello que algunas fueron seleccionadas para identificar las horde&#237;nas o fragmentos de las mismas que resisten la degradaci&#243;n durante el malteo y su posible influencia sobre las caracter&#237;sticas de procesamiento de la cerveza&#46; La identificaci&#243;n de horde&#237;nas indic&#243; que gran parte de &#233;stas no se encuentran en el tama&#241;o que les corresponde&#46; Esto puede ser debido a que se establecen interacciones de tipo covalentes &#40;puentes disulfuro&#41; o interacciones hidrof&#243;bicas de los fragmentos desnaturalizados de horde&#237;nas y otras prote&#237;nas que lleven a la formaci&#243;n de aglomerados que se resuelven en un tama&#241;o distinto al de las prote&#237;nas que los forman&#46; Por ejemplo&#44; en la banda M23-1 ubicada entre 55-70 kDa&#44; intervalo que corresponde a las horde&#237;nas C&#44; se identificaron horde&#237;nas B3 cuyo tama&#241;o te&#243;rico es alrededor de 46 kDa&#46; A pesar de haber utilizado agentes reductores y desnaturalizantes durante la extracci&#243;n y electroforesis&#44; es recomendable agregar un paso extra de alquilaci&#243;n de los residuos de ciste&#237;na una vez reducidos&#44; para asegurar que no se formen nuevas interacciones entre prote&#237;nas&#46; Acorde a los p&#233;ptidos identificados en malta se comprob&#243; la presencia mayoritaria de horde&#237;nas B3 tanto para la variedad 23 como para Metcalfe&#46; Sin embargo&#44; los fragmentos identificados para cada una de estas horde&#237;nas no fueron siempre los mismos &#40;<a class="elsevierStyleCrossRef" href="#tbl0015">Tabla III</a>&#41;&#46; Es posible notar que en la banda 23-1 se presentaron p&#233;ptidos de B3 no detectados en ninguna de las bandas de la malta 08 &#40;Metcalfe&#41;&#46; Esto apoya el hecho de que las diferencias en los patrones se deben en gran medida a una degradaci&#243;n diferencial del mismo tipo de horde&#237;nas&#46; Por lo anterior&#44; no se puede descartar la presencia de polimorfismos entre variedades para este grupo de horde&#237;nas que tambi&#233;n podr&#237;a contribuir en mayor o menor medida a su susceptibilidad a las proteasas&#46;</p><p id="par0165" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Con el uso de diferentes protocolos de digesti&#243;n fue posible ampliar la identificaci&#243;n de horde&#237;nas&#46; En este caso las horde&#237;nas C s&#243;lo se detectaron con el uso de quimotripsina y tripsina&#44; ya que &#233;stas son ricas en fenilalanina y la quimotripsina hidroliza en residuos de amino&#225;cidos arom&#225;ticos principalmente&#44; lo que mejor&#243; su digesti&#243;n y por lo tanto su identificaci&#243;n&#46; Por otra parte fue posible detectar con el uso de tripsina modificada &#40;Trypsin-LysC&#41; varios tipos de horde&#237;nas en semilla seca&#44; pero ninguna en las bandas de malta&#44; donde la mejor identificaci&#243;n se logr&#243; con el protocolo est&#225;ndar de digesti&#243;n con tripsina&#46; Estos datos permiten a futuro seleccionar el protocolo m&#225;s apropiado dependiendo del tipo de muestra &#40;semilla seca o malta&#41;&#44; as&#237; como del grupo de horde&#237;nas que se desea evaluar &#40;C&#44; B o &#947;&#41;&#46; En ninguna de las bandas se identific&#243; a horde&#237;nas del grupo D&#44; aun cuando se seleccionaron bandas en semilla seca correspondientes a su tama&#241;o&#44; por lo que ser&#225; necesario optimizar los protocolos de identificaci&#243;n para este tipo de prote&#237;nas&#46;</p><p id="par0170" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Finalmente&#44; la caracterizaci&#243;n molecular de las variedades mexicanas de cebada es de gran importancia para encontrar marcadores moleculares que permitan facilitar y acelerar el proceso de obtenci&#243;n de nuevas variedades&#46; Lo anterior con la finalidad de que dichas variedades se adapten mejor a las condiciones ambientales y los requerimientos para la producci&#243;n de cerveza en M&#233;xico&#44; con lo que se promueve su cultivo y se benefician los agricultores y la industria mexicana&#46;</p></span><span id="sec0070" class="elsevierStyleSection elsevierViewall"><span class="elsevierStyleSectionTitle" id="sect0090">Conclusiones</span><p id="par0175" class="elsevierStylePara elsevierViewall">Se reportaron los patrones de horde&#237;nas en geles SDS-PAGE de una dimensi&#243;n de semilla seca y malta de variedades mexicanas de cebada&#46; En semilla seca se observaron bandas diferenciales a 100 kDa&#44; 65 kDa y de 37-45 kDa&#44; por lo que se sugiere continuar con su an&#225;lisis como candidatos a marcadores moleculares en la semilla&#46; En malta destacaron los patrones de la variedad 08 y 23 por su abundancia en horde&#237;nas&#44; as&#237; como la 04 y 18 por la degradaci&#243;n de las mismas que muestra cada una&#46; Por otro lado&#44; para la identificaci&#243;n de horde&#237;nas por EM&#44; se determin&#243; que la digesti&#243;n con tripsina favorece la identificaci&#243;n de p&#233;ptidos en muestras de malta&#44; mientras que en semilla seca el uso de tripsina modificada puede ser utilizado con &#233;xito en la identificaci&#243;n de horde&#237;nas B y &#947; y solamente la digesti&#243;n conjunta de tripsina con quimotripsina favorece la identificaci&#243;n de las horde&#237;nas C&#46;</p></span></span>"
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                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Tripsina<span class="elsevierStyleSup">1</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Trypsin LysC<span class="elsevierStyleSup">2</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Quimotripsina<span class="elsevierStyleSup">3</span> &#43; tripsina&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M19-1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">x&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M23-1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">x&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M23-2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">x&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">x&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">x&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M23-3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">x&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M08-1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">x&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">x&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">x&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M08-2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">x&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M08-3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">x&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">S04-1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">x&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">x&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">S23-1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">x&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">x&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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                  \t\t\t\t" class=""><thead title="thead"><tr title="table-row"><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Muestra&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Enzima&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Resultado&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M19-1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Tripsina&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">------&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M23-1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Tripsina&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Horde&#237;na B3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M23-2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Tripsina&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Horde&#237;na B3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Trypsin-LysC&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">------&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Quimotripsina &#43; Tripsina&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">------&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M23-3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Tripsina&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Horde&#237;na &#947;1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M08-1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Tripsina&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Horde&#237;na B3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Trypsin-LysC&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">------&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Quimotripsina &#43; Tripsina&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">------&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M08-2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Tripsina&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Horde&#237;na B3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Horde&#237;na &#947;1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M08-3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Tripsina&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Horde&#237;na &#947;1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">S04-1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Trypsin-LysC&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Horde&#237;na &#947;3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Quimotripsina &#43; Tripsina&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Horde&#237;na &#947;1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Horde&#237;na &#947;3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Horde&#237;na C&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">S23-1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Trypsin-LysC&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Horde&#237;na B3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Horde&#237;na &#947;1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Quimotripsina &#43; Tripsina&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">Horde&#237;na C&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr></tbody></table>
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                  \t\t\t\t" class=""><thead title="thead"><tr title="table-row"><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Banda&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Horde&#237;na B3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Horde&#237;na &#947;1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Horde&#237;na &#947;3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th><th class="td" title="table-head  " align="left" valign="top" scope="col" style="border-bottom: 2px solid black">Horde&#237;na C&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</th></tr></thead><tbody title="tbody"><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M19-1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M23-1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#46;&#46;&#46;PLAIDTR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#46;&#46;VPLAIDTR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#46;IVPLAIDTR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M23-2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVPL&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVPLA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVPLAI&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVPLAIDTR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">TLPTMCSVNVPLYR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#46;&#46;&#46;TMCSVNVPLYR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M23-3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">APFV&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">APFVGVVTGV&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">APFVGVVTGVG&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">APFVGVVTGVGG&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">APFVGVVTGVGGQ&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M08-1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVPL&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVPLA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVPLAI&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVPLAIDTR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#46;&#46;PLAIDTR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">VFLQQQCSPLAMSQR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M08-2&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVPL&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVPLA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">APFVGVVT&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVPLAI&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">APFVGVVTGV&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVPLAID&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">APFVGVVTGVGGQ&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVPLAIDT&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;GVGGQ&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVPLAIDTR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#8230;&#46;PLAIDTR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">M08-3&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">APFVGVVTGV&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">APFVGVVTGVGGQ&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;GVGGQ&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">S04-1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">KCTAIDS</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">LLQQCTLDEKVPLLQSVISF</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">RQLNPSSQELQSPQQSY</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">KCTAIDSIVHAI</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">VLPQQQAQF</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">RQLNPSSQELQSPQQS</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">KCTAIDSIVHAIF</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">YPEQPQQPFPWQQPTIQLYLQQQLNPCK&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">&#46;QLNPSSQELQSPQQSY</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">LQQQL</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVQQSSCRVMQQQCCLQLAQIPEQYK&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">&#46;&#46;&#46;&#46;PSSQELQSPQQSY</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">LQQQLNPCKEF</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;SPQQSY</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">S23-1&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVPLA&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">APFVGVV&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;&#46;PQQSY</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVPLAIDTR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">APFVGVVTGVGGQ&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">&#46;&#46;QLNPSSQELQSPQQSY</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">&#46;VPLAIDTR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">IVQQSSCRVMQQQCCLQLAQIPEQYK&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">--&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">&#46;RQLNPSSQELQSPQQSY</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">TLPTMCSVNVPLYR&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top">YPEQPQQPFPWQQPTIQLYLQQQLNPCK&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">RQQAELI</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="left" valign="top"><span class="elsevierStyleItalic">RQQAELIIPQQPQQPFPLQPHQPY</span>&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td></tr><tr title="table-row"><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
                  \t\t\t\t</td><td class="td" title="table-entry  " align="" valign="top">&nbsp;\t\t\t\t\t\t\n
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Información del artículo
ISSN: 1405888X
Idioma original: Español
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