Actualmente el principal problema para la realización del TCH es la falta de fuentes adecuadas de hepatocitos humanos viables. Los hepatocitos se obtienen a partir de los órganos no válidos para trasplante por esteatosis superior al 40–50%1, tiempo de isquemia prolongado, lesión traumática del injerto9, desgarro capsular10,16, incompatibilidad de grupo sanguíneo17 y lesión vascular o biliar. Ocasionalmente se han infundido hepatocitos fetales11.

Las nuevas fuentes de obtención de hepatocitos incluyen tejido hepático resultante de reducciones hepáticas, split, así como el segmento iv tras split para 2 receptores12,13,18,19, injertos de donantes a corazón parado y donantes con arteriosclerosis. Otras fuentes propuestas son el tejido hepático procedente de resecciones hepáticas por enfermedad benigna o tras resección de tumor colorrectal20 (fig. 1).

Figura 1.

Aislamiento de los hepatocitos: digestión del parénquima hepático.

(0.45MB).

La UTCH ha aislado 13 órganos descartados para TH, pero aptos para TCH. Los hepatocitos se aislaron a partir de donantes con arteriosclerosis, serología vírica dudosa no confirmada, donante a corazón parado, split, fibrosis hepática y anoxia cerebral en recién nacido.

Berry y Friend (1969) fueron los primeros en desarrollar el procedimento para el aislamiento de hepatocitos de rata mediante la perfusión del hígado in situ con colagenasa, y sentaron las bases de los protocolos actuales. La colagenasa es una enzima proteolítica que permite la digestión del tejido hepático y el aislamiento de sus componentes celulares18,21–28.

Inicialmente investigamos, en biopsias quirúrgicas procedentes de los hígados preservados con Celsior®, la influencia sobre el rendimiento del aislamiento y la calidad de los hepatocitos de factores tales como el tiempo de isquemia fría y la esteatosis hepática determinada por estudio anatomopatológico. Tanto la viabilidad celular como el rendimiento presentaron un descenso a medida que aumentaba el tiempo de isquemia fría y la esteatosis29–32.

Sobre la base de estos resultados, tratamos de optimizar el proceso de aislamiento y cultivo de hepatocitos a partir de los hígados enteros (1,5–3,5kg) o los lóbulos completos (0,5–1kg) descartados para trasplante, por esteatosis u otra causa, y se realizaron inicialmente 5 aislamientos32 y posteriormente 3 más hasta un total de 8 (tabla 1). Todos los injertos se perfundieron con Celsior®, dado que en nuestra experiencia su uso produce una mayor viabilidad de las células en el proceso de aislamiento de hepatocitos humanos en comparación con otros líquidos de preservación31. Los órganos con mayor esteatosis (≥40%) presentaron menor rendimiento celular en el proceso de aislamiento. Los injertos desechados de donantes de edad avanzada mostraban una tendencia a una menor viabilidad (tabla 1). En general, el rendimiento del proceso de disgregación en el hígado o los lóbulos enteros es inferior al obtenido con biopsias quirúrgicas del tejido hepático con esteatosis, aunque hay que destacar mayor rendimiento en las muestras de menor peso (un lóbulo) (tabla 1). Esto podría atribuirse a los problemas que inicialmente presentaba el proceso de digestión del injerto.

Del total de los órganos desestimados para implante, 13 se han remitido a la UTCH para aislamiento de hepatocitos. Los criterios que se exigen para aceptar estos injertos para el aislamiento celular son similares a los exigidos para la donación en el TH. Se consideran donantes aptos para TCH todos aquellos injertos rechazados para TH, sin límite de edad, que no presenten sepsis ni antecedentes de neoplasia, con serología negativa para hepatitis C, B, VIH, HTLV y lúes, consentimiento familiar para emplear el órgano con fin investigador, esteatosis inferior o igual al 30%, no presentar enfermedad de origen hepático (cirrosis, colestasis y hemofilia) y un tiempo de isquemia fría inferior a 6h.

La esteatosis cuando es superior o igual al 30% invalida el tejido para el aislamiento celular. Nuestra experiencia nos ha permitido demostrar que, comparado con el hígado normal, los hepatocitos del hígado con esteatosis presentan baja viabilidad, menor rendimiento del proceso de aislamiento (hepatocitos viables obtenidos/g de tejido procesado), son muy frágiles para soportar la crioconservación y las posibilidades de injertarse con éxito son menores, por lo que actualmente no son órganos aptos para tratamiento celular21,30–32, y es un criterio de exclusión.

De los 13 donantes (8 mujeres y 5 hombres), se realizó el aislamiento en 3 splits, en 2 órganos completos y en el resto de los casos se procedió a la división del órgano en los 2 lóbulos, derecho e izquierdo y segmento iv para su mejor perfusión. El porcentaje de esteatosis se determinó por estudio anatomopatológico, y el tiempo de isquemia en todos ellos fue inferior a 4h. La viabilidad celular se sitúo entre el 70–89%, con un rendimiento de 1–17×106 células/g (tabla 2).

Nuestro laboratorio posee un protocolo estandarizado de aislamiento de hepatocitos a partir de biopsias hepáticas quirúrgicas, protocolo que se ha optimizado y se ha adaptado para realizar aislamientos a gran escala a partir de los órganos descartados para trasplante o de fragmentos del hígado procedentes de hepatectomía23.

La perfusión enzimática se realiza previa canulación de la arteria hepática y la vena porta del tejido hepático desechado. Si es factible, canulamos la vía biliar. En los primeros aislamientos realizamos la perfusión del órgano completo; sin embargo, la digestión del tejido hepático era incompleta. Esto motivó un cambio en el sistema de perfusión, y dividió el parénquima hepático en el lóbulo derecho e izquierdo, para lo que se realizó primero la perfusión de un lóbulo y a continuación la del otro (fig. 1).

La digestión enzimática consta de 2 etapas: una primera etapa de perfusión no recirculante del tejido hepático con solución salina de Krebs-Ringer tamponada con HEPES (20mmol, pH7,4), exenta de calcio, pero que contiene EGTA (0,5mmol) para lavar el tejido de la sangre y debilitar las uniones intercelulares; una segunda etapa de perfusión recirculante, se utiliza la misma solución salina sin EGTA y contiene 5mmol de Cl2Ca y el 0,05% de colagenasa para conseguir la digestión completa del parénquima hepático25,26. Ambas etapas se realizan a 37°C26. Se procede a la disgregación mecánica del tejido hepático para obtener una suspensión de hepatocitos en solución de Krebs-Ringer que se filtra (fig. 1). Esta suspensión celular se lava varias veces, se centrifuga, se desecha el sobrenadante y se resuspende el sedimento celular. Finalmente, se determina la viabilidad mediante el colorante azul de tripán, el rendimiento y la funcionalidad de las células mediante estudio metabonómico de enzimas de biotransformación de fases i y ii, capacidad de ureogénesis y número total de células33 (fig. 2). Se obtienen entre 6×106 y 2×107 hepatocitos vivos/g de hígado30,31,34, e influyen las condiciones de obtención del tejido en los resultados del procedimiento34.

Figura 2.

Aislamiento de los hepatocitos: centrifugación de la suspensión celular y obtención de los hepatocitos.

(0.32MB).

La solución de preservación empleada, la logística para procesar un injerto entero en el menor tiempo posible, la variabilidad de la actividad específica de la colagenasa, la necesidad de mantener el tejido a 37°C durante la perfusión con colagenasa y la digestión incompleta del tejido han sido aspectos clave del proceso que se han ido optimizando. Nuestros estudios recientes muestran que la fuente del tejido hepático, el tiempo de isquemia así como el líquido de perfusión (Celsior®/Wisconsin) utilizado influyen en el rendimiento y la calidad del hepatocito obtenido31,32.

Tras el aislamiento de hepatocitos, las células se resuspenden, bien en el medio de infusión adecuado33 para trasplantarse en fresco o bien en el medio de congelación si se crioconservan para utilizarse posteriormente18,25,30 (fig. 3). La criopreservación de los hepatocitos obtenidos permite realizar el trasplante de forma semiprogramada. Se remiten muestras para estudio microbiológico a fin de descartar cualquier contaminación en el proceso de obtención celular, con adición de antibióticos de forma profiláctica.

Figura 3.

Criopreservación de los hepatocitos aislados y descongelación de las células para su infusión.

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El trasplante celular requiere la infusión de los hepatocitos humanos en suspensión en un período que oscila entre minutos y horas (fig. 4). La composición del medio de infusión y la duración y el almacenamiento del hepatocito influyen en la calidad de las células obtenidas. Habitualmente, la composición del medio de infusión se basa en un buffer de proteínas plasmáticas con agentes anticoagulantes y glucosa en condiciones de hipotermia. La adición de N-acetil-cisteína ha demostrado que disminuye el estrés oxidativo y disminuye la apoptosis27.

Figura 4.

Trasplante celular hepático.

(0.27MB).

Los aspectos clave a la hora de definir la técnica de implante son 4: la vía de infusión, el número de células por infundir, el número de infusiones y la viabilidad de las células.

Viabilidad y funcionalidad

La mayoría de los autores determinan la viabilidad mediante el test de exclusión del azul de tripán, que mide la integridad de la membrana celular21,27. Las células vivas no captan el azul de tripán, mientras que las células muertas son permeables al colorante y se tiñen de azul. Se calcula el porcentaje de viabilidad mediante la siguiente fórmula:

Se recomienda para el uso clínico una viabilidad superior al 60%, y es necesario evaluar la calidad del hepatocito27. Para ello, en nuestra Unidad realizamos determinación de la capacidad metabólica, medida de la actividad biotransformadora y medida de la expresión funcional de genes hepáticos36,37. Las suspensiones celulares se testan para micoplasma, endotoxinas, bacterias y hongos21,24,25.

En nuestra UTCH hemos establecido criterios para realizar el control de calidad funcional de los hepatocitos (recién aislados o crioconservados) de forma que en un tiempo razonable (1h) se pueda comprobar su idoneidad para trasplante celular. Se procede a la determinación de la actividad de 5 isoenzimas del citocromo P450 (CYP1A2, CYP2A6, CYP3A4, CYP2C9 y CYP2E1) y enzimas de conjugación de fase ii (UGT y SULT) mediante la incubación con un cocktail de sustratos específicos desarrollado recientemente en nuestro laboratorio, y análisis por HPLC/MS/MS (o espectrometría de masas)38. Se determina su capacidad ureogénica mediante la medición de la conversión de amonio en urea. En un futuro próximo pretendemos realizar un estudio metabonómico y determinar un número importante de metabolitos celulares.

Tras la infusión celular en el receptor, el porcentaje de las células hepáticas que se implantan es limitado, y contrastan con la elevada viabilidad obtenida tras el aislamiento. Esta discordancia podría estar relacionada con la presencia de apoptosis, la apoptosis originada como consecuencia de la pérdida de adherencia celular denominada anoikis, y se caracteriza por la liberación del citocromo C desde la mitocondria, la condensación de la cromatina, la activación de caspasas y la formación de cuerpos apoptóticos, y está implicada en la muerte del hepatocito aislado y criopreservado30,47.

Estos fenómenos de apoptosis se han detectado a los 15min del aislamiento de los hepatocitos humanos mediante el test de TUNEL y anexina con citometría de flujo, de forma que la presencia de apoptosis podría explicar la discrepancia entre el test de azul de tripán y la eficiencia del cultivo celular que indica que las células no son capaces de adherirse, ya que son apoptoicas30,48.