La detección de estas enzimas es factible solo en enterobacterias naturalmente sensibles a la asociación amoxicilina-ácido clavulánico. Por tanto, y debido a la superposición de mecanismos de resistencia, su presencia no puede detectarse fenotípicamente en las enterobacterias naturalmente resistentes a esta asociación como Enterobacter cloacae, Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii, Morganella morganii, Serratia marcescens o los bacilos gramnegativos no fermentadores (P. aeruginosa) portadores de betalactamasa tipo AmpC inducible13,14. Así, para el resto de enterobacterias a partir de los antibiogramas realizados, bien por la técnica de disco-difusión o bien por la de microdilución, se puede sospechar la presencia de las enzimas IRT y OXA, aunque su confirmación definitiva debe ser realizada mediante técnicas moleculares dado que son varios los mecanismos que pueden dar patrones de resistencia similares. En la tabla 1 se muestran algunas características fenotípicas diferenciales de los distintos mecanismos implicados en la resistencia a las asociaciones betalactámico-inhibidor de betalactamasa15.

Generalmente, una cepa que expresa una betalactamasa de tipo IRT presentará resistencia a aminopenicilinas, carboxipenicilinas, ureidopenicilinas (en mayor o menor medida) y sensibilidad disminuida o resistencia a amoxicilina-ácido clavulánico9,10,13. Estas cepas muestran además sensibilidad a las cefalosporinas, incluyendo las de primera generación. También se afecta la asociación ampicilina-sulbactam y generalmente suele mantenerse o disminuir levemente la sensibilidad a piperacilina-tazobactam, posiblemente por la acción intrínseca de la piperacilina. Este patrón se puede ver alterado ante la presencia añadida de otros mecanismos de resistencia15.

Las cepas portadoras de las betalactamasas tipo OXA comentadas previamente (principalmente OXA-1) suelen presentar patrones similares a las portadoras de IRT. Así presentan resistencia a aminopenicilinas, carboxipenicilinas, ureidopenicilinas y sensibilidad disminuida o resistencia a amoxicilina-ácido clavulánico, ampicilina-sulbactam y piperacilina-tazobactam. Una característica de las enzimas de tipo OXA es que generalmente presentan una menor sensibilidad a cefepima. Debido a una cierta actividad del ácido clavulánico y a la menor sensibilidad de cefepima, es frecuente observar (especialmente mediante la técnica de disco-difusión) sinergia entre el ácido clavulánico y cefepima, siendo este patrón característico de las enzimas tipo OXA-1.

Ante la presencia de enzimas tipo IRT u OXA, deberíamos prescindir de tratamientos con las asociaciones de antibióticos betalactámicos e inhibidores de betalactamasa como amoxicilina-ácido clavulánico y ampicilina-sulbactam, presentándose como válida cualquier otra alternativa en función del antibiograma, del foco infeccioso y de la situación clínica del paciente. En el caso de la asociación piperacilina-tazobactam, debido a la propia actividad de la piperacilina, podría plantearse como alternativa siempre que se observe sensibilidad in vitro. En el caso de enterobacterias portadoras de betalactamasas tipo OXA debe plantearse también la conveniencia de evitar el uso de cefepima, especialmente si esta betalactamasa está hiperproducida y se observa disminución de la sensibilidad in vitro.

La detección de las BLEE en el laboratorio no siempre es fácil, ya que depende de su expresión fenotípica y esto viene condicionado por la cantidad de enzima producida por la bacteria, y de la presencia o no de otros mecanismos de resistencia. Su detección se basa en la capacidad de estas enzimas de hidrolizar las cefalosporinas de tercera y cuarta generación y los monobactámicos, disminuyendo por tanto la sensibilidad de la bacteria a estos antibacterianos. Otra de las características de estas enzimas es que son inhibidas por el ácido clavulánico (tabla 1)13,17.

Se han desarrollado diversas pruebas fenotípicas para la detección de BLEE, la mayoría basadas en la actividad inhibitoria del ácido clavulánico15. Entre ellas destaca la técnica de disco-difusión en la que la presencia de una BLEE se sospecha no solo por la resistencia o disminución de los halos de inhibición de algunos o todos los sustratos sino también por el efecto sinérgico producido entre las cefalosporinas de amplio espectro o los monobactámicos y el ácido clavulánico, cuando previamente se han situado de forma estratégica los discos15,17,18,21.

Otras técnicas basadas en el mismo principio son la utilización de discos combinados de cefalosporinas con ácido clavulánico y su variante en las técnicas de microdilución que permiten conocer las CMI de las cefalosporinas solas y en presencia de inhibidor. La técnica de difusión en gradiente (Etest) con tiras combinadas de cefalosporinas con y sin inhibidor es también de utilidad para la detección de BLEE15.

Todas estas pruebas requieren como mínimo 48 horas desde que el producto patológico llega al laboratorio. Se han buscado nuevos métodos para acortar este tiempo por lo que se han diseñado medios cromogénicos para el aislamiento selectivo y la identificación presuntiva de enterobacterias productoras de BLEE. Entre ellos se encuentra el ChromID ESBL (bioMérieux), Brilliance ESBL agar (Oxoid) y el CHROMagar™ ESBL (CHROMagar).

Otro método cromogénico rápido es el Cica-beta-Test (Kanto Chemical) que se utiliza para la detección rápida de BLEE directamente de la colonia de enterobacteria aislada. El método utiliza una cefalosporina cromogénica (HMRZ-86) y el ácido clavulánico como inhibidor para detectar rápidamente si el aislado es portador o no de una BLEE. Esta técnica permite asimismo detectar metalobetalactamasas y AmpC hiperproducidas mediante el uso de EDTA y ácido borónico, respectivamente.

Es importante recordar que algunas enterobacterias poseen betalactamasas cromosómicas que hidrolizan las cefalosporinas y son inhibidas por el ácido clavulánico. Cuando se hiperproducen dan lugar a un patrón fenotípico de resistencia compatible con la presencia de una BLEE. Entre ellas se encuentra la betalactamasa K1 de Klebsiella oxytoca, la SHV-1 de Klebsiella pneumoniae y las cefalosporinasas CepA de Proteus vulgaris y Proteus penneri.

Los métodos fenotípicos para la detección de AmpC plasmídicas son sencillos y económicos, pero solo resultan de utilidad en aislados que no tienen una AmpC cromosómica natural (Kebsiella spp., S. enterica, P. mirabilis) o que la expresan constitutivamente a muy bajo nivel, como ocurre en E. coli. La presencia de AmpC plasmídica debe sospecharse cuando estos aislados presenten un patrón de resistencias a betalactámicos (fenotipo AmpC) diferente al de su respectivo fenotipo salvaje o de resistencia natural (tabla 3), siendo los marcadores de mayor utilidad la sensibilidad intermedia o resistencia a amoxicilina-ácido clavulánico y a algunas de las cefalosporinas de tercera generación13,15,23.

Los métodos fenotípicos más rentables por su eficacia, su sencillez y su bajo coste económico, son el método de sinergia de doble disco (usando discos de cloxacilina o ácido fenil-borónico y discos de cefotaxima y ceftazidima) y el método de discos combinados con inhibidores15. Existen otros métodos fenotípicos bastante sensibles, pero son más complejos (test en 3D) o más caros que los anteriores (agar cefoxitina, Etest de cefotetán/cefotetán más cloxacilina)23. En el caso concreto de E. coli, la utilización del método de inducción de AmpC puede resultar útil en la detección de AmpC plasmídica puesto que un resultado positivo solo es posible si media la adquisición de una AmpC plasmídica inducible y descarta sin lugar a dudas la hiperproducción de la AmpC cromosómica, dado que ésta no es inducible23. Se ha descrito otro método simple para diferenciar las AmpC plasmídicas de las AmpC cromosómicas que puede ser de utilidad. Los aislados productores de AmpC plasmídicas suelen presentar colonias dispersas por el borde de los halos de inhibición con discos de cefoxitina, cefotaxima, ceftazidima y aztreonam25.

Los métodos fenotípicos de detección de betalactamasas de tipo AmpC plasmídicas tienen varias limitaciones importantes que deben ser consideradas para poder realizar una interpretación fiable de los resultados obtenidos. Estos métodos aún no han sido estandarizados por ningún comité u organización de expertos (CLSI, EUCAST, CASFM)2-5. Un marcador fenotípico muy utilizado para diferenciar la producción de AmpC de la de BLEE es la cefoxitina. Salvo algunas excepciones, los aislados con fenotipo AmpC son generalmente resistentes a cefoxitina, mientras que los aislados productores de BLEE suelen ser sensibles, excepto cuando se produce la pérdida o una disminución en la expresión de alguna porina15.

Para la detección fenotípica de las carbapenemasas se debe tener en cuenta el perfil hidrolítico general que confiere cada una de sus clases y de manera específica cada una de las enzimas incluidas en estas clases, la posible inhibición por los diferentes inhibidores de betalactamasas, la epidemiología local y la identidad del microorganismo en el que se pretende detectar o inferir la producción de estas enzimas. En este último punto es esencial valorar la posible presencia de otros mecanismos de resistencia que puedan «enmascarar» el fenotipo que confieren las cabapenemasas, entre ellos la alteración de la permeabilidad, la presencia de bombas de expulsión, afectación de las PBPs o presencia simultánea de otras betalactamasas. En este sentido, no es igual la expresión de una carbapenemasa en P. aeruginosa o en A. baumannii que en E. coli, K. pneumoniae o en una cepa de E. cloacae. Cada una de estas especies tiene sus peculiaridades fenotípicas naturales que deben ser contempladas13,26,28,30.

Desde un punto de vista práctico y una vez observado en el antibiograma, la expresión de un fenotipo compatible con la presencia de una carbapenemasa, generalmente ilustrado por la sensibilidad disminuida o resistencia a las cefalosporinas de amplio espectro y a alguno de los carbapenémicos, es importante verificar que existe un mecanismo de inactivación de los carbapenémicos. Se recomienda investigar este hecho en las cepas en las que los valores de CMI de los carbapenémicos se incrementan por encima de los correspondientes puntos de corte epidemiológicos (separan las poblaciones salvajes de aquellas que presentan mecanismos de resistencia). El método de referencia no siempre al alcance de todos los laboratorios, sería el ensayo espectrofotométrico, por lo que se han propuesto métodos biológicos (bioensayos) sencillos que permiten su detección15. La prueba modificada de Hodge35 fue recomendada por vez primera por el CLSI en el año 2009 como test fenotípico de confirmación. Tiene una elevada sensibilidad, pero no sirve para la diferenciación del tipo de carbapenemasa. A pesar de su sencillez, el test de Hodge modificado tiene detractores por las discordancias observadas con algunas cepas. Se han observado resultados falsos negativos por la baja expresión de la carbapenemasa, sobre todo con cepas con metalo-betalactamasa y oxacilinasas. No obstante, los falsos negativos pueden evitarse añadiendo sulfato de zinc al medio que incrementan la expresión del enzima (en el caso de las metalo-betalactamasas). También se han comunicado falsos positivos con cepas productoras de CTX-M-15 y pérdida de porinas y con las cepas hiperproductoras de AmpC. Asimismo, se ha discutido cuál es el carbapenémico más adecuado para el test de Hodge modificado, recomendándose la utilización de meropenem y ertapenem15,26,35.

Para la detección de microorganismos productores de carbapenemasas directamente de muestras clínicas se ha propuesto la utilización de medios cromogénicos, entre ellos los que se emplean para la detección de BLEE y los que específicamente se han diseñado para la detección de KPC. Los medios cromogénicos para BLEE detectan la presencia de microorganismos con carbapenemasas de las clases A y B, pero no las cepas que tienen OXA-48. No obstante, tienen el inconveniente de ser poco específicos dado que en ellos también crecen los microorganismos productores de BLEE. Los medios cromogénicos específicos para carbapenemasas como el CHROMagar™ KPC (CHROMagar) tienen una elevada sensibilidad y especificidad para la detección de cepas con enzimas tipo VIM y KPC directamente de muestras rectales, si bien no discrimina el tipo de carbapenemasa.

Una vez confirmado que la cepa problema produce una enzima que inactiva los carbapenémicos es preciso diferenciar el tipo de carbapenemasa. En Enterobacteriaceae, utilizando diferentes inhibidores puede seguirse el esquema que se incluye en la figura 1.

Figura 1.

Identificación fenotípica de Enterobacteriaceae productores de carbapenemasas.

(0.21MB).

En el caso de las metalo-betalactamasa, la sensibilidad al aztreonam nos orienta hacia este tipo de enzimas que puede confirmarse por la sinergia entre los carbapenémicos y EDTA o entre ceftazidima y EDTA. No obstante, se han detactado falsos positivos con P. aeruginosa y particularmente con A. baumannii por la actividad intrínseca del EDTA, aunque puede evitarse añadiendo Zn2+ al medio de cultivo. Se han diseñado pruebas de aproximación de discos, discos de carbapenémicos combinados con EDTA y tiras de Etest con un carbapenémico y EDTA para identificar fenotípicamente estas enzimas. En algunos casos se añade además fenantrolina o se sustituye EDTA por compuestos tiólicos como el mercaptopropiónico para mejorar la sensibilidad de la prueba15. También se ha ensayado el ácido dipicolínico con buenos resultados26.

En el método de aproximación de discos es importante «acertar» con la distancia entre los discos del carbapenémico y el inhibidor, sobre todo en las cepas con baja expresión de la carbapenemasa en las que los halos de inhibición son amplios. Por este motivo, existen métodos que incluyen directamente el inhibidor en el mismo disco que el carbapenémico y se compara el halo de inhibición resultante con el que se produce con el carbapenémico solo. Este mismo principio se utiliza con las tiras de Etest que en un extremo contienen imipenem y en el otro imipenem con EDTA. Por diferencia entre los valores de CMI de imipenem sin y con inhibidor se puede inferir la presencia de las carbapenemasas. Asimismo, los sistemas expertos de determinados sistemas automáticos son también útiles para la detección de la metalo-betalactamasa, incluida la NDM-115,32.

Las KPC confieren resistencia al aztreonam y no se inhiben por el EDTA, pero sí por el ácido borónico y discretamente por el ácido clavulánico. No se recomienda utilizar ácido clavulánico por su baja sensibilidad. La utilización del ácido borónico tiene como inconveniente el ser también un buen inhibidor de AmpC, circunstancia que dificulta la detección de las KPC cuando está presente esta enzima (por ejemplo en E. cloacae). Se ha propuesto utilizar simultáneamente una prueba de discos combinados con cloxacilina para demostrar la presencia de estas betalactamasas tipo AmpC. La sinergia con ácido borónico en las cepas productoras de KPC se puede demostrar con los carbapenémicos y también con cefalosporinas de amplio espectro, preferentemente con cefepima. Se han diseñado pruebas que añaden ácido borónico directamente a los discos y comparan los halos de inhibición con los del carbapenémico sin el ácido borónico26. También se puede observar esta sinergia con pruebas de aproximación de discos. Aunque se han propuesto diferentes compuestos derivados del borónico, se prefiere el ácido fenilborónico al 3’-aminofenilborónico por su mayor capacidad inhibitoria. Asimismo, como sustrato se recomienda preferentemente utilizar meropenem o imipenem ya que con ertapenem pueden observarse resultados falsos positivos cuando el microorganismo estudiado produce AmpC, incluidas las AmpC plasmídicas15.

Para las carbapenemasas de tipo OXA no es posible utilizar un método fenotípico como el propuesto con las carbapenemasas de clase A o B ya que no existen inhibidores específicos de enzimas de clase D. Por este motivo, se recomienda confirmar la presencia de estas enzimas por métodos moleculares.

Los microorganismos productores de carbapenemasas suelen tener un perfil multirresistente que incluye los aminoglucósidos, las fluoroquinolonas y el cotrimoxazol, circunstancia que restringe sus posibilidades terapéuticas36,37. Como opciones alternativas se ha sugerido la tigecilina y la colistina, aunque debe confirmarse su sensibilidad con un antibiograma. Se ha recomendado también fosfomicina o nitrofurantoina, sobre todo en el caso de las infecciones urinarias, que debe guiarse por el antibiograma y su interpretación por los puntos de corte correspondientes.

Con respecto a los antibióticos betalactámicos existen controversias acerca de su utilización cuando los valores de CMI (o halos de inhibición) se encuentran por debajo del punto de corte de sensibilidad, circunstancia bastante habitual para los carbapenémicos y las carbapenemasas de tipo VIM y en menor medida para las KPC38. El CLSI3 y EUCAST5 recomiendan taxativamente informar los carbapanémicos en función de los puntos de corte de sensibilidad establecidos, algo menores para el CLSI, sin modificar la interpretación. No obstante, los nuevos puntos de corte de carbapenémicos, sobre todo en Enterobacteriaceae, están muy cercanos a los puntos de corte de vigilancia epidemiológica, circunstancia que facilita la detección fenotípica de las carbapenemasas (tabla 2). A pesar de ello, y debido a que la información clínica es todavía muy escasa, la variabilidad de la expresión de las enzimas, la baja reproducibilidad en las pruebas de sensibilidad (sobre todo con los métodos automáticos) y la muy dispar prevalencia de este tipo de microorganismos, en muchos laboratorios se siguen criterios interpretativos propios que trasforman la categoría sensible de los carbapenémicos a resistente cuando se identifica la presencia de una carbapenemasa (como se hacía con las cefalosporinas de amplio espectro en las cepas productoras de BLEE con anterioridad al cambio de los puntos de corte).

En el caso de las metalo-betalactamasa y dado que no hidrolizan el aztreonam podría sugerirse este antibiótico como tratamiento de elección. Un caso particular lo constituirían las carbapenemasas de tipo OXA, esencialmente OXA-48, ya que presentan una ligera pérdida de sensibilidad a los carbapenémicos (suficiente en muchos casos para que se categoricen como resistentes) pero que por su perfil hidrolítico aparecen sensibles a las cefalosporinas de amplio espectro, por lo que se deberían informar como sensibles en espera de estudios clínicos que avalen la modificación de las interpretaciones.

Los mecanismos cromosómicos de resistencia van apareciendo secuencialmente, y el uso de quinolonas es uno de los factores más importantes en la selección de aislados con resistencia de alto nivel a fluoroquinolonas. En cuanto a la detección de determinantes plasmídicos de resistencia, no existen marcadores fenotípicos claros para reconocerlos y su detección debe hacerse por métodos moleculares, no siempre accesibles. En los últimos años se ha observado que algunas enterobacterias presentan sensibilidad disminuida a las fluoroquinolonas siendo sensibles a ácido nalidíxico, situación que en muchos casos se ha relacionado con la presencia de genes plasmídicos de resistencia a quinolonas15,40,41.

Los resultados de sensibilidad al ácido nalidíxico y ciprofloxacino son suficientes para el estudio de mecanismos de resistencias a quinolonas en enterobacterias, Haemophilus y Neisseria spp15.

• a)

  Resistencia de alto nivel a ácido nalidíxico y sensibilidad a ciprofloxacino. Presumiblemente presentan ya una mutación en gyrA, por lo que es importante informar el riesgo de seleccionar mutantes con resistencia a fluoroquinolonas tras tratamiento con las mismas en este tipo de cepas. El CLSI2 solo alerta del fracaso del tratamiento con fluoroquinolonas en caso de infecciones extraintestinales por S. enterica. Asimismo EUCAST5, recomienda en los aislados de salmonela resistentes al ácido nalidíxico informar como resistentes todas las fluoroquinolonas, pero muchos autores opinan que esta regla debe extenderse al resto de enterobacterias, o al menos interpretarse como «intermedio» sobre todo en situaciones en las que por el lugar de la infección no accedan bien las fluoroquinolonas.

• b)

  Resistencia a ácido nalidíxico de alto nivel (CMI > 32mg/L) y sensibilidad intermedia o resistencia a ciprofloxacino (CMI > 1mg/L). Muy probablemente son aislados con al menos dos mutaciones en gyrA o gyrA+parC. Ello implica resistencia a todas las fluoroquinolonas, independientemente de su posible sensibilidad in vitro a alguna de ellas. La resistencia a una fluoroquinolona invariablemente conlleva una sensibilidad disminuida al resto de las fluoroquinolonas.

• c)

  Sensibilidad disminuida al ácido nalidíxico (CMI 16-32mg/L) y ciprofloxacino (CMI 0,25-1mg/L). Este fenotipo sugiere con alta probabilidad la presencia de genes qnr y/o de otros genes plasmídicos, sin alteraciones adicionales en las topoisomerasas. No hay consenso al respecto, pero debido al riesgo de selección de mutantes con alto nivel de resistencia, algunos autores han propuesto informarlos como sensibilidad intermedia a quinolonas.

Por desgracia, no hay consenso en los puntos de corte de sensibilidad entre los diferentes comités de estandarización. Como se observa en la tabla 5, hay grandes diferencias entre los puntos de corte de CLSI2 y EUCAST5 para amoxicilina-ácido clavulánico y las cefalosporinas. EUCAST5, además de los cortes clínicos de sensibilidad, aporta puntos de corte epidemiológicos que podrían ser más eficaces a la hora de detectar cepas con bajos niveles de resistencia. El punto de corte para ampicilina propuesto tanto por CLSI2 como EUCAST5 (≤ 1mg/L) no es útil ya que clasificaría como sensibles a numerosas cepas BLNAR que presentan valores bajos de CMI para ampicilina (low-BLNAR), que son mayoritarias en España46,48.

Numerosos autores han propuesto diferentes puntos de corte para detectar las cepas BLNAR, aunque la mayoría se inclina por valores de CMI ≥1mg/L para ampicilina, mientras que valores ≤ 0,25mg/L descartarían cualquier mecanismo de resistencia48. Valores de CMI ≥ 0,5mg/L o diámetros de inhibición ≤ 29mm para cefixima son muy indicativos de cepas BLNAR con mutaciones en el motivo SSN que conllevan una menor sensibilidad a las cefalosporinas de tercera generación, que podría tener un impacto en el tratamiento de infecciones graves como meningitis.

Además del antibiograma convencional, se debe realizar siempre la prueba cromogénica de la nitrocefina para caracterizar las cepas productoras de betalactamasa (BLPAR) y se caracterizan por valores altos de CMI para ampicilina (> 4mg/L)15. Por último, valores de CMI ≥ 2mg/L para amoxicilina-ácido clavulánico en cepas productoras de betalactamasa nos indica con alta probabilidad un fenotipo BLPACR. Si utilizamos el método de Etest, valores de 0,5-1mg/L también pueden detectarse en las cepas BLPACR. En cambio con valores < 0,5mg/L para amoxicilina-ácido clavulánico se puede descartar la presencia de mutaciones en el gen ftsI por ambas metodologías (microdilución y Etest)15.

El método de difusión con discos se ha demostrado que tiene menos capacidad de discriminación entre cepas BLNAR y cepas sin modificaciones en la PBP3. Si se siguen los puntos de corte establecidos por el CLSI2 para ampicilina (disco 10μg), la mayoría de las cepas BLNAR identificadas en nuestro país se identificarían como sensibles. Se han propuesto diferentes alternativas con mejor sensibilidad para detectar BLNAR, EUCAST5 propone discos de ampicilina 2μg (< 16mm), cefaclor 30μg (< 19mm) o fenoxymetilpenicilina 10μg (< 15mm). Otras propuestas publicadas incluyen la utilización de discos de amoxicilina-ácido clavulánico de baja carga (2/1μg), cefalotina, cefalexina, cefsulodina, etc. Desafortunadamente, aún no hay resultados concluyentes sobre un método óptimo que pueda ser utilizado por la generalidad de los laboratorios clínicos15.