• •

  Bacterias. Las dos plataformas anteriormente comentadas ofrecen la posibilidad de identificación directamente a partir de una colonia. Se han publicado diversos trabajos en los que se compara la identificación obtenida por EM, especialmente utilizando el MALDI Biotyper, con los métodos microbiológicos clásicos. Los más relevantes se resumen en la tabla 1. En general se han obtenido valores de concordancia a nivel de especie con los métodos convencionales entre el 84 y el 95%.

  Tabla 1.

  Identificación a partir de colonia con la plataforma MALDI Biotyper (Bruker Daltonics)

  Referencia	Tipo de muestra utilizada para el cultivo	Número de colonias analizadas	ID a nivel de especie	ID a nivel de género	Comentarios
  Bizzini et al., 201026	Aislados de diversas muestras clínicas (bacterias y levaduras)	1.371 (30 géneros, 60 especies)	Global: 95%GN: 92%GP: 99%LEV: 100%	Global: 98%	En el 22% de los casos fue necesaria una extracción de proteínas previa para obtener una identificación fiable, sobre todo en el caso de levadurasDificultad en ID bacilos GPID influida por el medio de cultivo
  Seng et al., 200927	Aislados de diversas muestras clínicasa (bacterias)	1.660 (45 géneros, 109 especies)	Global: 84%	Global: 94%	Dificultad en la ID de Propionibaterium acnes, Streptococcus pneumoniae, Stenotrophomonas maltophilia y Shigella spp.
  Van Veen et al., 201028	Aislados de diversas muestras clínicas (bacterias y levaduras)	327 (29 géneros, 80 especies)	Global: 86%GN: 88%CGP: 80%LEV: 95%	Global: 95%GN: 93%CGP: 98%LEV: 100%	Extracción previa de proteínas necesaria para levaduras y, en algunos casos, para bacterias GN no fermentadorasDificultad ID Streptococcus del grupo viridans
  Sogawa et al., 201129	Aislados de diversas muestras clínicas (bacterias y levaduras)	498 (92 especies)	Global: 91%	Global: 97%	Utilización de 3 espectrómetros de masas con diferente poder de resolución, pero no se encontraron diferencias significantes en la fiabilidad de las identificaciones obtenidas
  Marklein et al., 200940	Aislados frescos de muestras clínicas y cultivos tipo (levaduras y hongos)	267 (15 especies de Candida spp. y 10 especies de hongos de 7 géneros) y 18 cultivos tipo	Global: 92,5%ID Candida spp: 98%ID hongos: 42%	Global: 92,5%	Dificultad de diferenciar C. dublinensis de C. albicansDiez de las 17 especies de hongos tuvieron que ser añadidas a la base de datos
  Putignani et al., 201041	Aislados frescos de muestras clínicas (levaduras y hongos)	303 (5 géneros, 19 especies)	Global: 85%	Global: 85%	Conversión de los espectros obtenidos a geles virtuales para investigar la tipificación de las muestras. Diez de los aislados no fueron identificados por no encontrarse en la base de datos

  ID: identificación (proporción de resultados obtenidos mediante el sistema BioTyper 2.0 concordantes con la identificación obtenida por los métodos microbiológicos convencionales); GN: bacterias gramnegativas; GP: bacterias grampositivas; CGP: cocos grampositivos; LEV: levaduras.

  a

  Sangre, líquido cefalorraquídeo, pus, biopsias, tracto respiratorio, heridas, heces.

  Cherkaoui et al. realizaron un estudio comparando ambas plataformas comerciales, MALDI Biotyper y Axima@SARAMIS24. De 720 colonias analizadas, el sistema MALDI Biotyper identificó correctamente y con una elevada confianza el 94,4% de ellas, en comparación al 88,8% obtenido por el sistema Axima@SARAMIS. En las muestras en las que se obtuvo una identificación diferente a la conseguida mediante los métodos convencionales se llevó a cabo la secuenciación del gen 16S para confirmar la identificación. De las identificaciones discrepantes obtenidas utilizando la plataforma MALDI Biotyper, la secuenciación del gen 16S confirmó los resultados obtenidos por dicha plataforma en el 75% de los casos. Este porcentaje fue del 78,3% en el caso de la plataforma de Axima@SARAMIS.

  Además de la identificación a ciegas de aislados clínicos, la EM ha demostrado ser útil a la hora de identificar microorganismos a los que es difícil hacerlo por métodos clásicos, como por ejemplo las bacterias gramnegativas no fermentadoras30,31 o las diferentes especies del género Bacteroides32. Así mismo, esta tecnología también permite la identificación y tipificación de Listeria spp.33, Staphylococcus spp.34,35 y Mycobacterium spp.36.

  La mayor limitación de esta técnica es que pueden existir errores en la identificación de bacterias genéticamente muy parecidas, ya que pueden presentar proteomas parecidos. Por ello, el criterio del microbiólogo clínico es crucial en la interpretación de los resultados. La identificación en estos casos puede mejorarse con una extracción proteica previa, pero se recomienda la confirmación por métodos bioquímicos o por secuenciación. Por otro lado, tal y como se explica en el apartado «Espectrometría de masas dirigida a la detección de proteínas», el software adjudica a cada identificación un valor indicativo de su fiabilidad. En el caso de Biotyper 2.0, se ha observado que con valores entre 1,7 y 2, que indicarían un parentesco muy cercano y una identificación fiable tan solo a nivel de género, de hecho se obtienen identificaciones correctas a nivel de especie. Algunos autores consideran estos intervalos demasiado restrictivos a la hora de validar los resultados. Así pues, dentro de dicho intervalo se debería poder adjudicar un elevado grado de fiabilidad a la identificación, sobre todo si se puede disponer de una morfología de colonia que la corrobore37. Por último, se ha observado una necesidad de completar la base de datos con más perfiles proteicos para mejorar la identificación correcta a nivel de especie, sobre todo en el caso de bacterias poco comunes29,38.

• •

  Levaduras y hongos filamentosos. Dada la gravedad de las fungemias, sobre todo en pacientes immunodeprimidos, es necesaria una rápida identificación de las mismas. Bader et al.39 realizaron un estudio en el que compararon ambas plataformas comerciales (MALDI Biotyper y Axima@SARAMIS) para la identificación de levaduras patógenas. Se analizaron un total de 1.192 aislados, que incluyeron 36 especies diferentes. El porcentaje de identificaciones correctas obtenidas mediante la plataforma MALDI Biotyper fue del 97,6%, y en el caso de la plataforma Axima@SARAMIS el porcentaje fue de 96,1%. Los resultados de otros estudios de interés aparecen resumidos en la tabla 1.

Desde nuestro mejor conocimiento, a día de hoy solo se ha publicado un artículo en el que se utiliza una plataforma comercial, la MALDI Biotyper en su versión de software Biotyper 1.0 (Bruker Daltonics), para la identificación de hongos filamentosos del género Fusarium42. En este estudio se creó una base de datos para la identificación de este patógeno. Se incluyeron 60 cepas obtenidas a partir de aislados clínicos y dos cepas de aislados ambientales. La identificación de todos los aislados fue comprobada mediante secuenciación. Al analizar 49 aislados clínicos a ciegas, se obtuvo una identificación correcta en el 92% de los casos. Cuando no se obtuvo un resultado fiable fue debido a la presencia de especies del género Fusarium que no estaban incluidas en la base de datos creada.

A pesar de ser este un territorio poco explorado con la utilización plataformas comerciales, la EM se ha empleado durante años para la identificación de hongos filamentosos. Santos et al.43 han publicado recientemente una exhaustiva revisión referida al tema en cuestión.

En cuanto a la preparación de la muestra en el caso de las levaduras, en los trabajos revisados (tabla 2) se realiza una extracción de proteínas previa mediante etanol/ácido fórmico. En el caso de hongos filamentosos, Marinach-Patrice et al.42 realizan una extracción previa mediante ácido trifluoroacético/acetonitrilo. Sin embargo, en su trabajo de revisión Santos et al.43 comentan que, si bien la lisis era necesaria para la obtención del espectro en los primeros experimentos, en trabajos recientes se ha logrado evitar este paso.

La identificación de bacterias mediante MALDI-TOF directamente a partir de un hemocultivo positivo permite reducir el tiempo de obtención del resultado en comparación con los métodos convencionales, ofreciendo la posibilidad de mejorar el manejo de los pacientes con sepsis. Recientemente se han publicado varios estudios cuyos resultados se resumen en la tabla 2. En la mayoría de los estudios se realizó la extracción previa con etanol/ácido fórmico previamente descrita, ya que como se demuestra en el trabajo publicado por La Scola et al.44, parece ser más efectiva para las bacterias grampositivas que la extracción mediante TFA. De los 322 hemocultivos analizados mediante la extracción con TFA, en el 59% de las muestras los resultados fueron concordantes con los obtenidos mediante los métodos convencionales. De estos, la concordancia para las bacterias gramnegativas fue del 94%, mientras que para las grampositivas fue del 37%. En una segunda fase del estudio se analizaron un total de 240 hemocultivos y se utilizó el protocolo de extracción con etanol/ácido fórmico, mediante el cual se mejoró la detección de las bacterias grampositivas, tal y como se refleja en la tabla 2. En el trabajo realizado por Ferreira et al.51 se compararon la identificación a partir de células intactas y la extracción mediante etanol/ácido fórmico. Mediante este segundo método la extracción de proteínas consiguió identificar un mayor número de microorganismos y con valores de fiabilidad más elevados.

En un estudio recientemente publicado, Schmidt et al.52 compararon los frascos de hemocultivo BD BACTEC Plus-aerobic (Becton Dickinson, Franklin Lakes, EE. UU.), que contienen resinas, con los frascos del sistema BacT/Alert (bioMérieux, Marcy l’Etoile, Francia) SA y FA, de los cuales solo los segundos contienen carbón activo. La plataforma de EM utilizada fue Axima@SARAMIS. Los frascos se inocularon con 103 microorganismos distintos. Para los frascos BD Bactec Plus-aerobic, BacT/Alert SA y BacT/Alert FA la concordancia general con los métodos convencionales fue, respectivamente, del 72, del 46 y del 23%. Para las bacterias gramnegativas la concordancia fue, respectivamente, del 87, del 69 y del 47%. Finalmente, la concordancia en la identificación de las bacterias grampositivas fue, respectivamente, del 60, del 29 y del 5%. Estos datos corroboran lo anteriormente publicado por Szabados et al.53, quienes demostraron que la sensibilidad de la identificación directa de hemocultivos positivos utilizando el sistema BacT/Alert era baja.

La identificación mediante esta técnica a partir de hemocultivo presenta las mismas limitaciones comentadas anteriormente en «Identificación de microorganismos a partir de colonia».

Dado que estas plataformas necesitan una concentración mínima de bacterias para lograr una identificación, resulta difícil la aplicación de la EM a la muestra directa sin pasar por el cultivo. Aun así, sí se han realizado estudios utilizando EM en muestras con una considerable concentración de microorganismos, como es la orina.

Ferreira et al.54 utilizaron el sistema MALDI Biotyper para la identificación de bacterias directamente a partir de orina mediante la aproximación de células intactas. Sin embargo, en el caso de no obtener una buena identificación, se realizó la extracción previa de proteínas mediante el protocolo de etanol/ácido fórmico. A nivel de especie, la concordancia obtenida con los métodos convencionales fue del 91,8%, y del 92% a nivel de género.

A pesar de no existir aún publicaciones en las que se estudie la resistencia a antibióticos mediante las plataformas comerciales previamente mencionadas, sí se han publicado trabajos en los que se utiliza la EM para la discriminación de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a la meticilina de aquellas sensibles, ya que presentan variaciones de picos en el espectro de masas22,55. De manera similar, en otro trabajo se describe la diferenciación entre cepas de Escherichia coli resistentes y sensibles a la ampicilina56.

Por otro lado, aunque la identificación de virus aún no ha sido puesta a punto por las casas comerciales descritas, también constituye una de las aplicaciones de la EM. Por ejemplo, la identificación de Norovirus se ha llevado a cabo a partir de la detección de las proteínas de la cápside57, y la identificación del virus de Newcastle, por la detección de un polipéptido vírico58.

SEQUENOM (San Diego, EE. UU.) ofrece un método para la tipificación de bacterias con una precisión comparable al multilocus sequence typing (MLST). Esta metodología se basa en una amplificación inicial del DNA de la muestra utilizando un par de primers que incorporan en sus extremos 5′ los promotores T7 y SP6, respectivamente, lo que permite la posterior transcripción de ambas cadenas en dos reacciones diferentes. Una vez realizada la transcripción, se utiliza una enzima de restricción para cortar de manera específica el producto amplificado después de cada residuo de uracilo o citosina59,60. Estos fragmentos se analizan mediante EM tipo MALDI-TOF. Para la identificación se utiliza una base de datos previamente generada in silico de patrones de MLST generados a partir de secuencias de referencia.

Esta tecnología ha demostrado ser útil para la tipificación de Neisseria menigitidis59, para el genotipado de micobacterias61, así como para el genotipado de los virus de las hepatitis B y C62,63, entre otros.

Esta tecnología, denominada comercialmente PLEX-ID (anteriormente T5000), ha sido propuesta por Ibis Biosciences Inc. (Carlsbad, EE. UU.), empresa subsidiaria de Abbott Molecular (Chicago, EE. UU.). Se basa en la amplificación de los ácidos nucleicos existentes en la muestra y en el posterior análisis del producto de PCR mediante EM tipo ESI-TOF64.

El principio básico de esta tecnología es que todos los microorganismos comparten características comunes codificadas en sus genomas, y que estas secuencias conservadas permiten el diseño de primers universales. Con ellos es posible amplificar regiones conservadas pero con suficiente variabilidad como para permitir la identificación de los diferentes microorganismos. Además, el uso de distintos pares de primers en diferentes pocillos promueve la amplificación de los diferentes microorganismos que puedan coexistir en una muestra clínica sin que haya competencia por los recursos de la PCR. Posteriormente, el producto se analiza por ESI-TOF, determinándose así la masa de los amplicones presentes en la reacción de PCR con tal precisión que proporciona información sobre su composición específica de bases, es decir, en qué proporción se encuentran los diferentes nucleótidos en el amplicón. Sin embargo, no se obtiene la secuencia nucleotídica de los productos de PCR. Esta composición de bases es única para cada gen y específica de cada microorganismo, permitiendo así su identificación gracias al software y a la base de datos proporcionados.

Potencialmente, esta tecnología es capaz de identificar todas las bacterias conocidas, así como las principales familias de hongos patógenos y de virus a partir de cualquier tipo de muestra, previa extracción de los ácidos nucleicos. Además, debido a su diseño, esta técnica también permite la identificación de microorganismos no descritos previamente. Dado que se basa en la amplificación genética a partir de muestra directa, permite además la identificación de microorganismos no cultivables65. Otra de las ventajas de esta tecnología es que permite la cuantificación, gracias a un calibrador interno de concentración conocida añadido a cada reacción de PCR, informando del número inicial de genomas del microorganismo identificado en la muestra.

• •

  Identificación de bacterias. Los primers universales más utilizados son los primers ribosomales, que amplifican los genes 16S o 23S, pero existen otras regiones ampliamente conservadas, como el gen rpoB y otros genes housekeeping. El objetivo es utilizar varios pares de primers, cada uno dirigido a amplificar un grupo o división de bacterias concreto. De esta manera los diferentes tipos de bacterias que pueda haber en la muestra podrán ser amplificados sin presentar competencia, ya que si la bacteria menos abundante no consigue ser amplificada mediante los primers ribosomales, sí podría detectarse mediante los primers específicos de su división. El resultado final es la obtención de una mezcla de amplicones que reflejará la complejidad de la muestra inicial. La utilidad de esta tecnología para la vigilancia epidemiológica queda reflejada en diversos trabajos66-70. Algunos ejemplos considerados de especial interés se comentan a continuación.

  Identificación de Mycobacterium tuberculosis multirresistente. El ensayo molecular descrito por Massire et al.70 consta de 16 pares de primers repartidos en 8 reacciones dúplex. Se analizaron un total de 1.340 aislados, cuya resistencia había sido previamente caracterizada. La sensibilidad y la especificidad en la detección de la resistencia a la isoniazida fueron del 89,3 y del 95,8%, respectivamente. Para la detección de la resistencia a la rifampicina, estas fueron del 96,3 y del 98,6%, respectivamente. Por último, en el caso de la resistencia al etambutol, los valores fueron del 73,6 y del 97,3%. Los valores predictivos positivos y negativos para la detección de estas resistencias fueron, respectivamente, del 97,3 y del 84,3% para la isoniazida; del 96,7 y del 98,5% para la rifampicina, y del 84,4 y del 94,9% para el etambutol.

  El ensayo también demostró su utilidad para la especiación y distinción entre micobacterias pertenecientes al complejo M. tuberculosis y micobacterias no tuberculosas (NTM). La sensibilidad en la detección de las bacterias pertenecientes al complejo M. tuberculosis fue del 98%, y la especificidad, del 100%. Para las NTM, dichos valores fueron del 97 y del 99,9%. Los valores predictivos positivos y negativos para la identificación de estos dos grupos fueron, respectivamente, del 100 y del 99,5% para el complejo M. tuberculosis, y del 99,6 y del 99,6% para las NTM.

  Vigilancia de patógenos respiratorios. En el estudio de Ecker et al.71 se presentan los resultados obtenidos tras el análisis de diferentes brotes de infecciones respiratorias ocurridos durante los años 2002 y 2003 en diversas instalaciones militares de Estados Unidos. En el ensayo desarrollado para este fin, se combinaron primers universales para la detección de bacterias y primers específicos para el genotipado de Streptococcus pyogenes basados en el gen emm, el cual codifica para la proteína M, un factor de virulencia. En 48 de las 51 muestras analizadas del brote del 2002 se detectó S. pyogenes perteneciente al genotipo emm3, el cual ha sido asociado a una elevada virulencia. Además, durante el análisis de las muestras se detectó la presencia de otros microorganismos, siendo Haemophilus influenzae y Neisseria meningitidis los más abundantes, además de S. pyogenes, lo cual demuestra que en la mayoría de casos las infecciones respiratorias tienden a ser polimicrobianas. Al analizar muestras de pacientes sanos, el patrón de microorganismos encontrados en la garganta de dichos voluntarios fue diferente, predominando una microbiota de estreptococos del grupo viridans. Durante el brote de 2003 se comprobó que la distribución de S. pyogenes había cambiado y que el genotipo virulento emm3 ya no predominaba.

  Identificación de bacterias a partir de hemocultivo. Existen tres trabajos publicados en los que se utiliza esta tecnología para identificar bacterias y levaduras a partir del hemocultivo positivo mediante el ensayo BAC Assay (Abbott Sterile Fluid Bacteria and Candida assay). En dichos trabajos se comparó la identificación obtenida mediante el PLEX-ID con los resultados obtenidos mediante los métodos clásicos: cultivo e identificación mediante perfil bioquímico (Vitek 2 Compact, bioMérieux). En el primero de los dos estudios72 se obtuvo una concordancia a nivel de género del 94% y a nivel de especie del 93%, de un total de 170 hemocultivos positivos y 199 microorganismos analizados. En el segundo de los trabajos73 se obtuvo una concordancia a nivel de género del 98,7% y a nivel de especie del 96,5%, de un total de 234 hemocultivos y 211 microorganismos. Finalmente, el último trabajo74, que se trata de una comparación de esta tecnología con la plataforma comercial de EM por MALDI-TOF MALDI Biotyper, se comenta más adelante. Sin embargo, esta tecnología podría utilizarse a partir de muestra directa; en este caso, la sangre total del paciente antes de inocular el hemocultivo. En el caso de la sepsis, esto permitiría acortar el proceso en una media de 9h, tiempo necesario para la positivización del hemocultivo, acelerando el proceso diagnóstico y mejorando el manejo de los pacientes. Sin embargo, hasta el momento no existen publicaciones al respecto, aunque nuestro centro está actualmente realizando una evaluación.

• •

  Identificación de virus. Mediante esta tecnología es posible identificar las principales familias víricas. Se han publicado varios trabajos que demostraban la versatilidad de esta técnica para la detección de virus, como por ejemplo el ensayo diseñado para la detección de los virus de la gripe A y B, con una sensibilidad y una especificidad superiores al 97% (determinadas tras el análisis a ciegas de 656 muestras clínicas)75. También se han descrito ensayos para la detección de Coronavirus, Bocavirus y Metapneumovirus, entre otros75-78.

  Esta tecnología fue una de las primeras en identificar la nueva cepa H1N1 del virus de la gripe responsable de la pandemia del 2009, ya que el ensayo para la identificación de este virus fue capaz de detectar esta nueva cepa sin ninguna modificación previa del mismo79.

• •

  Identificación de factores de virulencia y/o resistencia. Incluidos en el ensayo BAC Assay (Abbott Sterile Fluid Bacteria and Candida assay) se encuentran los genes mecA, el cual confiere resistencia a la meticilina en cepas de S. aureus, la detección de los genes vanA y vanB, los cuales confieren resistencia a la vancomicina, de especial interés cuando se trata del género Enterococcus spp., y la detección del gen kpc, de gran relevancia médica en el caso de Klebsiella pneumoniae y que le confiere resistencia al carbapenem. La detección de esta última resistencia también ha sido evaluada en Acinetobacter baumannii80. En el caso de S. aureus, también existe la posibilidad de detección de factores de virulencia, como por ejemplo la leucocidina de Panton-Valentine81,82.

Recientemente se ha publicado un trabajo en el que se comparan estas dos técnicas para la identificación de bacterias y levaduras a partir de un total de 273 hemocultivos positivos74.

• •

  Concordancia entre los resultados obtenidos por EM y los métodos clásicos. Ambas técnicas mostraron una muy buena concordancia con la identificación obtenida mediante cultivo y pruebas bioquímicas (Vitek 2, bioMérieux). En el caso del PLEX-ID, la concordancia obtenida fue del 96,7% a nivel de género y del 95,6% a nivel de especie. En al caso del MALDI-TOF, la plataforma utilizada fue la de Bruker Daltonics, y la concordancia obtenida fue del 97,1% a nivel de género y del 94,9% a nivel de especie.

• •

  Preparación, análisis y coste por muestra. En el caso del PLEX-ID, desde la obtención de la muestra del paciente son necesarias de 4 a 6h, que incluyen la extracción del DNA, la amplificación por PCR y el análisis de la muestra mediante el espectrómetro de masas. En el caso del sistema MALDI Biotyper, se realizó un subcultivo de los hemocultivos positivos en caldo de enriquecimiento, los cultivos enriquecidos se sembraron en diferentes medios y se utilizó una colonia para el análisis por MALDI-TOF. Como se menciona en «Espectrometría de masas dirigida a la detección de proteínas», esta plataforma permite el análisis de hasta 48 muestras en una hora.

Por otro lado, hay que tener en cuenta que el PLEX-ID necesita diversos reactivos y equipos, tanto para la extracción automatizada de DNA como para la realización de la PCR y el análisis por EM, mientras que para la utilización del MALDI-TOF los requerimientos son mínimos: tan solo es necesaria la matriz orgánica. Por ello, aunque ambas tecnologías requieren de una inversión inicial considerable en instrumentación, el coste por muestra mediante el PLEX-ID se encuentra entre 34 y 70 euros, mientras que el coste por muestra utilizando el MALDI-TOF es de 2 a 4 euros.