La mayoría de las técnicas de cuantificación de CV, detección de resistencias, diagnóstico genético temprano perinatal y detección de variantes empleando DBS se basan en la amplificación de ácidos nucleicos, principalmente por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ARN viral (de virus circulantes) y/o el ADN proviral (de virus integrados en células sanguíneas infectadas) extraído del DBS también se puede usar para otros estudios que requieran secuenciación viral o clonaje molecular del VIH, incluso ensayos de resistencia fenotípica o detección molecular de otros virus del paciente. Sin embargo, todos ellos requieren un paso previo de extracción de material genético del DBS.

No todas las técnicas de extracción (comerciales y no comerciales) disponibles tienen la misma eficacia37. De hecho, los fallos en la extracción del ARN viral son la causa más frecuente de obtener valores de CV infraestimados, viremias negativas o fallos de amplificación en la detección de resistencias en muestras de pacientes donde se esperaban CV altas. La mayoría de estudios de determinación de la CV, resistencias y epidemiología molecular y diagnóstico genético empleando DBS extraen ácidos nucleicos por técnicas basadas en el uso de sílice38, principalmente mediante el empleo del NucliSens isolation Kit (BioMérieux).

Otros métodos de extracción (comerciales y no comerciales) de ácidos nucleicos en DBS alternativos al uso de la sílice también se han usado para cuantificar la viremia del VIH6,7,10,15,16,37 y para detectar resistencias22. La extracción por NucliSens resultó ser más precisa y sensible que otras durante la cuantificación de la viremia5 y la detección de resistencias37.

Aunque los DBS se pueden almacenar a temperatura ambiente, hay factores que hay que tener en cuenta para preservar la integridad del material genético a extraer del fluido seco en el DBS (tabla 3), y han sido extensamente estudiados6,7,13,14,26,32,37,39–42. Se ha comparado la integridad del material genético extraído del DBS considerando distintas temperaturas y grado de humedad durante la toma de la muestra, el transporte y el almacenamiento de los DBS. También se ha evaluado la eficacia de las distintas técnicas en DBS almacenados durante distintos tiempos hasta su uso, comparando las metodologías en DBS, DPS y plasma y empleando distintos números de círculos de sangre seca en la extracción. Aunque normalmente se usan dos círculos para CV y resistencias, la sensibilidad puede aumentar extrayendo ARN de un mayor número de círculos, al relacionarse con una mayor cantidad de muestra de sangre seca a partir de la cual se hará la extracción.

Para una mejor recuperación del ARN viral para la detección de resistencias o de CV es muy importante señalar que los DBS deben ser almacenados lo antes posible en un congelador a –20°C, y preferiblemente a temperaturas menores (ultracongelador de –80°C). Ello contribuirá a mantener la integridad del ARN de la muestra hasta su procesamiento. Sin embargo, cuando la criopreservación no es posible, los DBS pueden ser almacenados o transportados a temperatura ambiente hasta 14 días después de su toma. Después de ese tiempo deben ser procesados o almacenados a –80°C (preferentemente) o a –20°C hasta su uso. Cabe destacar que, en muestras con baja CV, a mayor tiempo de almacenaje a temperatura ambiente, mayor es el riesgo de degradación del ARN viral del DBS.

Se sabe que el ADN es más estable que el ARN, y ello se aplica también a los DBS11. El ARN viral se degrada a mayor tiempo de almacenaje del DBS hasta su uso y, por tanto, la eficacia de cuantificación viral o de detección de resistencias puede verse afectada41. El ARN en los DBS y DPS puede ser estable al menos durante un año a –70°C18,40 o incluso más. Debemos recalcar que la estabilidad del ARN viral recuperado y el rendimiento de la cuantificación de CV y monitorización de resistencias a partir del DBS será mayor cuanto menores sean la temperatura, la humedad y el tiempo de almacenamiento del DBS hasta su procesado. La sensibilidad del ensayo aumentará cuanto mayor sea el volumen de sangre en cada círculo y el número de círculos usados para la extracción del ARN. Por otro lado, cuanto menor sea el tamaño de la región del VIH a amplificar, mayor será la eficacia de amplificación por PCR necesaria para la monitorización de resistencias y diagnóstico genético en niños. Si es posible, los DBS deberían ser almacenados una vez secos en nevera o preferentemente en congelador en el punto de recogida de muestras, almacenados en bolsas de plástico cerradas e individuales, y deberían contener una bolsa de material desecante para reducir la humedad hasta su uso.

La cuantificación de la CV del VIH en plasma sanguíneo es la herramienta de laboratorio recomendada para monitorizar la respuesta al TAR en pacientes infectados, detectar fracaso terapéutico y evaluar la necesidad de cambio de tratamiento. Sin embargo, en contextos con bajos recursos, esta técnica no se implementa y se siguen otros parámetros para este seguimiento. La cuantificación de la CV también ha sido empleada para el diagnóstico temprano en niños7,30,31,34. Valores de CV indetectables en plasma reflejan un adecuado control de la replicación viral en pacientes en TAR. Por el contrario, niveles detectables de viremia pueden indicar un mal control de la infección, fallos de adherencia o emergencia de virus con mutaciones de resistencia a fármacos en uso.

Existen 2 metodologías disponibles para medir ARN del VIH-1 en las que se basan las técnicas de cuantificación viral comerciales en plasma. La primera metodología requiere una extracción previa de ácidos nucleicos de la muestra infectada para su amplificación posterior. La amplificación puede realizarse por transcripción inversa o RT-PCR (Amplicor HIV-1 Monitor) que puede emplear amplificación a tiempo real (Amplicor COBAS® TaqMan® HIV-1; Abbott Real Time™ m2000rt) y mediante la técnica NASBA (NucliSENS EasyQ® HIV-1). La segunda metodología se basa en métodos de amplificación de señal (VERSANT® HIV-1 RNA bDNA) y no requiere extracción previa de ácidos nucleicos.

La determinación de CV en plasma presenta altos costes y limitaciones técnicas para países con bajos recursos, y se necesitarían ensayos baratos, rápidos y fáciles de usar en países con instalaciones limitadas. Por ello se han desarrollado métodos no comerciales de menor coste22,32,43–47. Algunos están basados en la primera metodología: Generic HIV-1 viral load (Biocentric), Primagen Retina-Rainbow, RT-PCR manuales (caseras o in house) o RT-PCR a tiempo real32,44,47. Otras técnicas de cuantificación alternativas miden la actividad de la transcriptasa inversa de VIH-1 (Cavidi ExavirLoad v2 y v3)48. No obstante, la detección de falsos positivos, las necesidades de equipamiento caro y de personal cualificado siguen siendo las principales barreras para su puesta en práctica en laboratorios poco equipados o con poca experiencia en estas técnicas45. Las ventajas e inconvenientes de varios métodos de cuantificación de CV comerciales y no comerciales ya han sido publicadas43.

Las técnicas de cuantificación de CV del VIH-1 presentan diferencias en precisión y sensibilidad. Aunque la mayor parte de los artículos muestran buena correlación entre los valores de CV de plasmas y DBS5–18, algunos han observado falsos positivos10, atribuidos al efecto del ADN proviral en la cuantificación a partir de DBS en algunas muestras con CV plasmática baja5,8,13. El bajo volumen de sangre recogido en los DBS puede limitar la sensibilidad de la cuantificación de CV si se compara con la cuantificación convencional usando volúmenes de plasma mucho mayores. La sensibilidad de cualquier técnica puede disminuir si la muestra no ha sido bien conservada y principalmente en muestras con CV más bajas. No es fácil definir en qué grado las diferencias de sensibilidad empleando DBS vs. plasma observadas en estos estudios pueden ser atribuidas al método de extracción, al ensayo de CV específico, a la conservación de la muestra o incluso a la experiencia del laboratorio, al observarse también variabilidad de resultados entre laboratorios empleando las mismas muestras40. La tabla 4 resume algunos trabajos representativos que comparan la CV a partir de plasma y DBS empleando varias técnicas, principalmente comerciales. A pesar de todo, el rango de sensibilidad y la correlación de los valores de plasma deben ser determinados para cada ensayo comercial y versión. Independientemente del uso de plasma o sangre seca, es importante que no se cambie de técnica de cuantificación de viremia a la hora de monitorizar a un paciente durante su seguimiento clínico.

La cuantificación de CV en DBS no puede alcanzar los mismos niveles de sensibilidad que empleando plasma. Mientras que en el DBS se emplean normalmente uno o 2 círculos de sangre seca, cada uno saturado por 50-100μl de sangre total, la nueva generación de ensayos de CV emplea 1ml de plasma equivalente a 2,5ml de sangre total. Por tanto, empleando plasma se pueden alcanzar límites de detección de 40-50 copias ARN-VIH/ml (1,3-1,7log) y en DBS se establece próximo a las 1.000 copias ARN-VIH/ml (3log)6,7,14, aunque algunos estudios detectaron hasta 200 copias ARN-VIH/ml (2,3log)15,32.

La Organización Mundial de la Salud (OMS) recomienda el empleo de DBS en instalaciones con recursos limitados para la vigilancia de resistencias transmitidas a fármacos del VIH-1 en pacientes naïve y para monitorizar resistencias en pacientes en TAR19. La tabla 5 resume algunos de los estudios que evalúan resistencias genotípicas a antirretrovirales empleando DBS18,20–29. La tasa de éxito de amplificación de material genético del VIH empleando DBS difiere según la CV de las muestras, y depende de las condiciones de almacenamiento de los DBS antes de su procesamiento, del método de extracción de ARN empleado y de la longitud de la región de pol del VIH amplificada. Como ocurre para la CV, la eficacia de amplificación para resistencias en DBS es mayor con CV superiores a 3log de copias ARN-VIH/ml, reduciéndose drásticamente en muestras con CV indetectables (<1,7log), como ocurre usando plasma.

Los ensayos de resistencia genotípica comerciales en pol (ViroSeq HIV-1 genotyping system; Abbott Molecular y TruGene HIV-1 genotyping assay; Siemens Healthcare Diagnostics) se han empleado para determinar resistencias en DBS18,25,26,28. Estos amplifican la proteasa y transcriptasa inversa virales en uno o 2 amplicones de 1,8kb (ViroSeq) y 1,3kb (TruGene), respectivamente. Sin embargo, son más numerosos los estudios que detectan resistencias en DBS empleando métodos no comerciales o caseros de amplificación basados en nested RT-PCR, de menor coste y que parecen ser tanto o más eficientes que ViroSeq o TruGene al tener mayores tasas de éxito de amplificación (tabla 5). Ello se debe a que en muchas ocasiones los PCR caseros amplifican la proteasa y transcriptasa inversa por separado, y la amplificación de regiones más cortas es más eficaz que las largas empleando DBS.

El éxito de amplificación del fragmento de 1,8kb por ViroSeq usando DBS fue variable en diversos estudios, dependiendo de las condiciones de almacenamiento del DBS a su uso y de su CV. En un estudio, ViroSeq consiguió amplificar el 79% de muestras con CV mayores de 5,1log copias RNA-VIH/ml, del 42,8% entre 4,2-5log, y ninguna amplificación con CV inferiores a 4,1log18. En otro estudio, ViroSeq amplificó las 46 muestras con viremias entre 2,7 y 5,8log en DBS almacenados a –20°C durante 6 meses, pero la amplificación falló en 26 de ellas cuando los DBS de los mismos pacientes se almacenaron a 4°C durante 12 meses hasta su uso26. En otro trabajo, ViroSeq amplificó el 75% de muestras con viremias mayores a 4log, pero solo el 13% con viremias inferiores28 en DBS almacenados a –20°C cerca de 4 meses, transportados a temperatura ambiente durante 20 días y guardados otro mes a –20°C hasta su procesamiento. Otros lograron genotipar por ViroSeq las 38 muestras en DBS con viremias mayores de 3,3log, pero solo el 54,5% con CV inferiores en DBS transportados y almacenados a –20°C durante una media de 5 meses, aunque consiguieron genotipar el 95% de las 46 muestras empleando una técnica no comercial de RT-PCR23. TruGene pudo amplificar el 90,5% de muestras en DBS con viremias mayores a 3,7log25.

Por todo ello, a pesar de que los kits comerciales son eficientes en muestras con altos niveles de viremia, como en pacientes en fracaso terapéutico o en la mayoría de los pacientes sin tratamiento, los ensayos de nested RT-PCR caseros que amplifican la proteasa y transcriptasa reversa por separado parecen dar más amplificaciones positivas en un porcentaje mayor de muestras con CV bajas. Además, el coste de las técnicas no comerciales normalmente es bastante inferior a las comerciales. En cualquier caso, cualquier técnica de detección de resistencias, tanto casera como comercial, requiere una buena integridad del ARN y, por tanto, las mismas condiciones favorables de conservación de los DBS.

Además de analizar el éxito de amplificación a partir de muestras de DBS, la mayoría de los estudios tienen como objetivo comparar las secuencias generadas a partir de DBS y plasma de las mismas muestras. Existe una alta concordancia (83-99,9%) entre mutaciones de resistencia a fármacos encontradas en plasma y DBS en los diversos estudios18–28 (tabla 5). Algunas mutaciones adicionales solo fueron detectadas en DBS principalmente como mezclas de aminoácidos incluyendo el residuo mutante y salvaje, pudiendo también deberse a la influencia del ADN proviral amplificado de las células infectadas junto al ARN viral en el DBS. Ello reflejaría mutaciones archivadas en el ADN proviral y que podrían volver a expresarse en las condiciones adecuadas de presión selectiva.