La microbiología forense se ha desarrollado paralelamente a la evolución de los métodos diagnósticos y al descubrimiento de nuevos agentes infecciosos. El estudio de la patología infecciosa en la autopsia tiene interés en 2 situaciones diferentes: la autopsia clínica y la autopsia médico-legal o forense. En ambas, la patología infecciosa puede acompañarse de la presunción clínica que sugiera este diagnóstico, o bien ser este un hallazgo macroscópico en la autopsia. Además, en otras ocasiones en las que la patología infecciosa puede pasar desapercibida clínicamente y durante la evisceración en el momento de la autopsia, la aplicación de protocolos sistemáticos de análisis microbiológico y/o histológico permitirá llegar al diagnóstico etiológico. Es este el caso de la participación de patología infecciosa en la patogenia de algunas muertes súbitas-inesperadas (MS) como la meningitis bacteriana, la miocarditis viral, la bronquiolitis, el shock séptico y la bronconeumonía. Principalmente en la infancia, la MS es una secuela reconocida de distintos agentes infecciosos, cuyo desenlace dependerá de la combinación de varios factores1.

Los principales motivos médico-legales de solicitud de análisis microbiológico en la autopsia forense son: 1) la muerte inesperada en el adulto, con sospecha de origen infeccioso; 2) la muerte súbita infantil (MSI); 3) la investigación de supuesta mala praxis por sospecha de infección hospitalaria, y 4) la muerte cardiaca en la que se sospecha una miocarditis viral2. En la autopsia clínica, el interés en el análisis microbiológico radica en la necesidad de confirmar una infección sospechada o la aplicación de protocolos en los donantes de órganos o tejidos3.

En microbiología post mórtem, además del hándicap de la contaminación, común a la microbiología clínica, existe la dificultad de que microorganismos aislados en muestras procedentes de autopsia pueden tener significados diversos y opuestos, ya que los mismos pueden corresponder a un patógeno, a la flora normal de esa zona corporal, a una bacteriemia transitoria no causante de enfermedad próxima al momento de la muerte, a una contaminación durante la toma de muestra, a una diseminación agónica y/o a una translocación post mórtem secundaria (diseminación pasiva)4.

En general se acepta que la translocación secundaria post mórtem no interfiere en los resultados del análisis si las muestras se obtienen lo antes posible (idealmente dentro de las primeras 24h del deceso) y el cuerpo se mantiene refrigerado a 4°C hasta la autopsia. No obstante, la presencia de contaminantes externos procedentes de la toma de muestra es el inconveniente más grave y repetido. Todo ello ha generado cierta controversia sobre la validez del cultivo post mórtem, haciendo que este haya sido tradicionalmente relegado a un segundo plano. A pesar de ello, el establecimiento de criterios específicos de interpretación del cultivo en muestras de autopsia y la aplicación del diagnóstico molecular, que permite la detección directa de los ácidos nucleicos de los distintos patógenos en dichas muestras, han hecho que el análisis microbiológico recupere su rol protagonista en la patología de la autopsia5.

En las meningoencefalitis la muestra preferente es el líquido cefalorraquídeo (LCR) tomado con pipeta estéril o mediante punción con aguja y aspirado en jeringa en el foramen magnum, aunque también es posible el hisopado de la superficie cerebral o la toma de un pequeño fragmento de cerebro remitido en frasco estéril con solución fisiológica.

Se deben tomar muestras de sangre (hemocultivo) y bazo.

Macroscópicamente la superficie peritoneal se muestra opaca y con exudado purulento.

Las características macroscópicas de las infecciones que pueden presentarse como MSI ya han sido descritas7. Estas infecciones incluyen:

Las membranas ovulares y la superficie amniótica fetal suelen mostrarse opacas y ligeramente verdosas, aunque el aspecto también puede ser normal. Se recomienda la toma de muestra de membranas ovulares y pulmón para bacteriología.

La prevalencia de los distintos patógenos y de las infecciones causadas por estos dependerá de la causa de la inmunodeficiencia y del mecanismo inmune afectado.

Se deben tomar 5 cm de la porción más distal. Porciones mayores dificultan el procesamiento en el laboratorio. Se envían en frasco/tubo estéril.

Se realiza utilizando hisopo con medio de transporte para aerobios y anaerobios (bacteriología) y otro con medio de transporte para virología.

Se coloca el cadáver en decúbito ventral. En los adolescentes y adultos, se limpia la zona posterior del cuello con yodo povidona o con alcohol isopropílico de 70¿ y se inserta una aguja de calibre 1-2 en la línea media, bajo el hueso occipital, inclinando la aguja hacia las cavidades orbitales. El LCR se recoge en tubo estéril, separando 2 alícuotas, cada una de 1ml, una para virología y otra para bacteriología. Esta muestra puede complementarse con una porción de cerebro obtenida inmediatamente después de quitar la calota craneana, con instrumental estéril.

Para evitar la contaminación por translocación bacteriana, es recomendable que la sangre para hemocultivo se obtenga antes de la manipulación del intestino. En el adulto es mejor obtener una muestra de sangre periférica por punción de la vena yugular externa, antes de la apertura del cadáver. Previamente se esteriliza la piel con espray de alcohol isopropílico. Luego de dejar secar unos minutos, se aspira sangre utilizando aguja y jeringa estéril de 20ml. En el niño pequeño (de hasta 4-5 años) y en el lactante es difícil acceder a la vena yugular y suele obtenerse una muestra de sangre por punción del corazón derecho, al que se accede tras abrir el saco pericárdico11. Se esteriliza la zona a punzar con espray o toallitas embebidas en alcohol isopropílico antes de aspirar sangre con una aguja y jeringa estéril de 10ml. Una vez obtenida la muestra, la sangre se inyecta directamente en 2 frascos de hemocultivo, para aerobios y anaerobios. Luego de obtenida la muestra para hemocultivo, que deberá ser siempre la primera muestra de sangre, y de acuerdo con las circunstancias del caso, se tomará muestra de sangre con EDTA para posibles análisis moleculares.

Se obtiene mediante la sedimentación y posterior centrifugación de la sangre recogida en tubo con activador del coágulo.

En caso de secreciones, líquidos o derrames (pleurales, peritoneales o pericárdicos): enviar 2-3ml en frasco o tubo estéril.

Si no hay sospecha clínica del diagnóstico de endocarditis, la apertura del corazón contaminará las válvulas cardiacas. Si al abrir el corazón la presencia de vegetaciones sugiere endocarditis, igualmente deberán enviarse la/s válvula/s afectada/s al laboratorio de microbiología. Es aconsejable realizar también un hisopado de la válvula afectada. La muestra de miocardio para virología se obtiene tras cauterización o tras pasar espray con alcohol isopropílico de 70¿ de la superficie pericárdica; se coloca 1 cm3 de tejido cardiaco en tubo de transporte universal estéril con solución fisiológica estéril.

Al realizar la evisceración de la lengua y de los órganos del cuello, se deberá tomar muestra mediante hisopado (con medio de transporte para bacteriología) de laringe y tráquea.

Su superficie puede esterilizarse con alcohol o aplicando una espátula calentada en mechero de Bunsen. La muestra de pulmón para virología y bacteriología consiste en 2 cubos de 1-2 cm3 obtenidos con bisturí estéril. Cada muestra se coloca en frasco estéril, agregando solución fisiológica estéril en el caso de la destinada a virología.

La superficie del tejido se esteriliza con alcohol isopropílico o aplicando una espátula calentada en mechero de Bunsen. Con bisturí estéril se toma un cubo de 1-2 cm3 para bacteriología y otro para virología (este último con solución fisiológica).

Obtenida por medio de punción y aspirado directo de la vejiga con jeringa estéril. De no obtenerse orina por aspirado, debe intentarse la apertura de la vejiga por el techo, utilizando pinza y tijeras estériles. Una vez abierta, se aspiran unos 5-10ml de orina, que se recogen en un recipiente universal estéril.

Abrir el colon descendente en forma aséptica. Suspender el mismo sobre 2 recipientes para cultivo de heces (frasco estéril de 40ml), uno para microbiología y otro para virología. Enviar aproximadamente 5ml en cada frasco. Si se observa la presencia de patología intestinal macroscópicamente y se identifican úlceras, debe enviarse muestra de estas para cultivo.

Se accede a su interior con bisturí y tijeras estériles. Se extraen 2-3ml del exudado purulento con pipeta estéril. También se puede aspirar el centro del absceso con jeringa estéril de 20ml. Ambas muestras se introducen en frasco estéril.

Se accede a este a través de la base del cráneo. Una vez retirado el cerebro, se corta con sierra a ambos lados del techo del peñasco del hueso temporal. Después se «levanta» el peñasco utilizando instrumental para cortar hueso. Se inspecciona el oído medio y puede tomarse muestra para bacteriología mediante hisopo con medio de transporte.

Se deberá manipular con pinzas estériles. Una vez localizadas las membranas periféricas y la superficie amniótica fetal, se puede realizar: a) toma mediante hisopo con medio de transporte de la superficie amniótica de las membranas periféricas, o b) toma mediante bisturí de tejido de la superficie fetal o amniótica del parénquima placentario.

Mantener a temperatura ambiente sin refrigerar ni congelar. Cuando no es posible el envío inmediato de la sangre al laboratorio, se recomienda emplear tubos con polianetol sulfonato sódico como anticoagulante o, en su defecto, tubos con citrato sódico.

Si no es posible su envío inmediato, la alícuota para bacteriología se mantendrá en estufa a 35-37°C o se incubará en un frasco de hemocultivo, que se mantendrá en idénticas condiciones hasta su procesamiento. Si no se dispone de estufas, se mantendrá a temperatura ambiente, no refrigerándose nunca la muestra destinada a bacteriología. La alícuota para virus o análisis moleculares se enviará en frío, y si el envío se retrasa más de 24h, se deberá conservar a –70°C.

Los análisis más frecuentes en microbiología post mórtem son las técnicas de detección de antígeno, el cultivo bacteriológico y las técnicas moleculares, aplicadas fundamentalmente a bacteriología y virología. En la mayoría de los estudios post mórtem las técnicas antigénicas se consideran análisis orientativos o preliminares que necesitan confirmación, bien mediante cultivo o con técnicas moleculares. Con menor frecuencia se requieren otros análisis, como tipificación epidemiológica, serología, identificación de parásitos y cultivos fúngico y viral.

En el análisis microbiológico post mórtem es fundamental mantener una estrecha comunicación entre el laboratorio y el médico peticionario con el fin de orientar los análisis a realizar. El laboratorio deberá instaurar diferentes protocolos de trabajo específicos para las distintas etiologías sospechadas en la autopsia, siendo imprescindible disponer de una información lo más completa posible sobre antecedentes y hallazgos de autopsia. Dichos protocolos generarán decisiones diagnósticas que se pueden plasmar en algoritmos12 donde se priorizarán determinados tipos de análisis según las muestras disponibles y la relación coste-beneficio. Las muestras post mórtem tienen carácter único, por lo que cuando deban someterse a más de un tipo de análisis, estos se realizarán secuencialmente, teniendo en cuenta el volumen de muestra recibido, con el fin de no agotarlas en un primer análisis. Por ello el procesamiento inicial en el laboratorio conlleva, además de la inoculación en medios de cultivo, el alicuotado y la preparación para otro tipo de análisis (antigénicos, moleculares o serológicos fundamentalmente) que puedan diferirse en el tiempo.

Son la primera aproximación al análisis microbiológico post mórtem. Las técnicas antigénicas —aglutinación en látex, inmunocromatografía e inmunofluorescencia— deberían realizarse en los casos con elevada sospecha de infección, informándose el resultado con fines de profilaxis y/o tratamiento, y siempre considerando su coste-beneficio. No obstante, estos tests suelen ser poco eficientes cuando en la autopsia no se han detectado hallazgos macroscópicos sugestivos de infección. En el LCR, en el líquido pleural, en el peritoneal o en la orina también se realizará al menos una tinción de Gram como primera aproximación al caso.

La selección del tipo de muestras a inocular dependerá del cuadro clínico que se quiere investigar. A diferencia de las muestras en individuos vivos, el volumen/tamaño de la muestra post mórtem que se toma para análisis microbiológico no suele ser un problema, con la excepción de determinados fluidos biológicos que, en ocasiones, son escasos y difíciles de tomar. Tal es el caso de la sangre, que puede estar coagulada, o puede ser escasa en lactantes; o del LCR, cuya toma puede revestir cierta dificultad.

Si la sangre no puede ser procesada inmediatamente tras su recogida, la inoculación directa en frascos de hemocultivo podría favorecer la proliferación de bacterias de fácil crecimiento procedentes de una pequeña contaminación durante la toma de muestra, todo ello en detrimento de un patógeno con altos requerimientos nutritivos. Por ello se recomienda que, adicionalmente en estos casos, la sangre se recoja en tubos tipo Vacutainer con SPS o en su defecto citrato sódico. Además, una vez en el laboratorio, una alícuota de la sangre se sembrará directamente en: a) caldo cerebro-corazón/tioglicolato, y b) placas con medios enriquecidos y selectivos; así se aumenta la sensibilidad para recuperar determinados patógenos.

De forma genérica, las muestras se inocularán directamente en medios convencionales, enriquecidos y selectivos, para bacterias aerobias y anaerobias facultativas; cuando así se requiera, se emplearán medios anaerobios enriquecidos y selectivos, y opcionalmente medios complementarios para otros microorganismos menos frecuentes. Además, se inocularán en un medio líquido de enriquecimiento tipo caldo cerebro-corazón/tioglicolato. Las heces se inocularán en medios básicos para patógenos entéricos y selenito. El Thayer Martin o similar se empleará también en sangre, LCR, tejidos y exudados respiratorios ante la sospecha de meningococemia o meningitis bacteriana aguda. Cuando se sospeche una infección fúngica, las muestras se inocularán adicionalmente en Agar Sabouraud con antibióticos. Las condiciones y tiempos de incubación son similares a los de las muestras en vivos.

La evaluación de los resultados de los cultivos post mórtem es compleja y requiere criterios específicos de interpretación que, aunque se basan en los empleados tradicionalmente ante mórtem, presentan variaciones que tienen en cuenta las características especiales de las muestras de autopsia13. Así, se considera que el cultivo post mórtem de una única muestra raramente aporta información suficiente que permita establecer la significación clínica a partir de un resultado positivo. Por ello se recomienda analizar los resultados de, al menos, 5 muestras de tejidos diferentes, considerando que si el mismo organismo se aísla en los 5 tejidos, este puede tener significado clínico14. Por otra parte, los aislamientos obtenidos en el bazo tienen la misma significación clínica que los procedentes de la sangre, por lo que ese tejido se suele emplear para corroborar los resultados del hemocultivo15.

La rapidez y la independencia de la infectividad del virus son las ventajas de los métodos antigénicos, y la limitación principal es su baja sensibilidad. Las técnicas moleculares están reemplazando al cultivo viral, que requiere infraestructura y mantenimiento más complejos. Por ello en las muestras post mórtem los estudios virológicos emplean fundamentalmente técnicas moleculares y antigénicas, siendo excepcional el cultivo viral.

Los análisis moleculares se han convertido en la piedra angular de la microbiología post mórtem en la mayoría de las situaciones, y son tremendamente útiles ante una infección bacteriana fulminante para confirmar o descartar determinados patógenos (meningococo, neumococo o Streptococcus del grupo B), previamente al cultivo, pues sus resultados pueden estar disponibles en pocas horas16,17.

El laboratorio de microbiología molecular debe permanecer separado del resto de áreas de trabajo, el acceso debe ser controlado y la puerta de acceso debe permanecer cerrada. Las áreas requeridas son la mismas que para cualquier otro laboratorio de microbiología molecular: área de preparación de reactivos, área pre-PCR, área de amplificación y área de post-PCR. El flujo de trabajo será unidireccional, desde el área pre-PCR al área de amplificación y al área de post-PCR. Los extractos de ácidos nucleicos se almacenarán en un área separada de los reactivos y controles de PCR.

La técnica manual más utilizada en la extracción de ácidos nucleicos es la que emplea membranas de sílice, con tiocianato de guanidina en la lisis. También existen diversas plataformas automáticas adaptables a las necesidades de cada laboratorio. La estrategia diagnóstica por excelencia es la PCR a tiempo real, que se puede combinar con otras técnicas moleculares, como la PCR multiplex y la detección mediante arrays. Se emplean principalmente PCR dirigidas a regiones específicas de las especies más frecuentes de patógenos18, aunque de forma complementaria se puede realizar la amplificación y posterior secuenciación de la región 16S rARN de las eubacterias15.

Su principal aplicación post mórtem es el diagnóstico virológico en donantes de órganos y tejidos. La limitación en la obtención de muestras pareadas para el estudio de seroconversión hace que su empleo en casos de MSI y en los de muerte inesperada infecciosa se haya visto desplazado por las técnicas moleculares.