S. aureus es un microorganismo que, además de colonizar habitualmente a los seres humanos, puede comportarse como un patógeno oportunista y ser la causa de una gran diversidad de infecciones. En 2013, los datos de la European Antimicrobial Resistance Surveillance Network (EARS-Net) mostraban una prevalencia de SARM en bacteriemias del 22,6% en España y del 18% en el total de los países europeos participantes. En España, existen variaciones importantes en su prevalencia dependiendo del área geográfica y del tipo de hospital. Las implicaciones clínicas y epidemiológicas obligan a establecer sistemas de detección adecuados10. El principal mecanismo de resistencia a la meticilina es la producción de una proteína de unión a la penicilina (PBP2a), codificada por el gen mecA, que presenta baja afinidad por los antibióticos β-lactámicos, a excepción de una nueva clase de cefalosporinas como es la ceftarolina o el ceftobiprole. En el año 2011 se describió un gen homólogo denominado mecC11. Se han aislado cepas de SARM-mecC en multiples países, incluido España, procedentes de humanos y de una gran variedad de animales. La detección del gen mec permite la diferenciación de otras cepas de S. aureus, muy poco frecuentes, con bajo nivel de resistencia a la meticilina debido tanto a alteraciones de las PBP (moderately resistant S. aureus [MODSA]) como a hiperproducción de β-lactamasa (bordeline oxacillin-resistant S. aureus [BORSA]). El protocolo que se desarrolla en este procedimiento se refiere a S. aureus que contiene el gen mec.

Enterococcus faecalis (∼80-90%) y Enterococcus faecium (∼5-10%) son las especies que causan la mayoría de las infecciones en humanos. Estos microorganismos son responsables de aproximadamente el 10% de las infecciones relacionadas con la asistencia sanitaria. Además, es importante su resistencia intrínseca a múltiples antibióticos, y su capacidad de desarrollar resistencias a otros antibióticos, bien por adquisición de genes localizados en plásmidos o transposones (ej.: resistencia a glucopéptidos) o por mutaciones cromosómicas (ej.: resistencia a fluoroquinolonas). En EE. UU. se produjo un rápido aumento de brotes nosocomiales de ERG que condujo a una situación endémica en ciertos hospitales. En contraste, en Europa, el ERG se aisló inicialmente de fuentes comunitarias (personas sanas y animales) debido al amplio uso de avoparcina, un glucopéptido utilizado como promotor de crecimiento de animales de granja hasta su prohibición en 1997. Los datos del EARS-Net en 2013 mostraban importantes diferencias en la prevalencia de ERG en los distintos países europeos. En España la prevalencia de E. faecium resistente a vancomicina fue del 0,9% en 2013. A pesar de este bajo porcentaje, con cierta frecuencia se describe la aparición de brotes hospitalarios.

La resistencia adquirida a glucopéptidos en enterococo está mediada por 9 operones diferentes denominados van (vanA, vanB, vanC, vanD, vanE, vanG, vanL, vanM, vanN). Dos de ellos, el vanA y el vanB, son los más frecuentes en E. faecalis y E. faecium con diferencia. El gen vanA confiere resistencia inducible de alto nivel a vancomicina y teicoplanina mientras que el gen vanB confiere resistencia inducible de alto o moderado nivel a vancomicina y permanece sensible a teicoplanina. Las especies de E. faecium o E. faecalis con resistencia a vancomicina (CMI >4mg/l) son las de mayor interés epidemiológico y requieren vigilancia microbiológica12.

La diseminación de enterobacterias resistentes a cefalosporinas de amplio espectro, principalmente BLEE, se ha convertido en una de las principales amenazas para el tratamiento antibiótico de las infecciones producidas por estas bacterias. En España, E. coli y K. pneumoniae productores de BLEE, sobre todo del tipo CTX-M-15 y SHV-12, se han extendido rápidamente en los últimos años y han alcanzado prevalencias globales de alrededor del 15%. Aunque menos frecuentes, las AmpC-p están emergiendo como una amenaza adicional a la actividad de las cefalosporinas de amplio espectro. Las principales tipos de AmpC-p son CIT y DHA, que afectan a principalmente a E. coli, K. pneumoniae y Proteus mirabilis. La frecuente asociación de la producción de BLEE y AmpC-p con resistencia a otros antibióticos no β-lactámicos ha generado un aumento en el consumo de antibióticos carbapenémicos y la aparición de cepas resistentes a ellos. En la actualidad, una de las mayores amenazas en el campo de la resistencia a antibióticos es la rápida diseminación de cepas MDR y XDR productoras de carbapenemasas. Estas enzimas son capaces de hidrolizar la casi totalidad de los antibióticos β-lactámicos, incluidos los carbapenémicos. La mayoría se agrupan, según la clasificación molecular de Ambler, en: 1) clase A, principalmente enzimas del tipo KPC; 2) clase B o metalo-β-lactamasas (MBL), principalmente enzimas del tipo VIM, IMP y NDM y 3) clase D, principalmente OXA-48. Un estudio multicéntrico realizado en 2013 (proyecto GEIH-GEMARA-REIPI) mostró que OXA-48 (71,5%) y VIM-1 (25,3%) fueron las carbapenemasas más frecuentes en enterobacterias en España y K. pneumoniae (74,4%) la especie más afectada1. Además, se detectó una amplia diseminación de algunos clones de alto riesgo de K. pneumoniae como ST11/OXA-48, ST15/OXA-48, ST405/OXA-48 y ST11/VIM-11. Aunque menos frecuentes, otras carbapenemasas como las KPC y NDM también están aumentando en España y generan importantes brotes intra- e interhospitalarios13. A finales de 2015, España presentaba un escenario de diseminación interregional de EPC13. Las alternativas terapéuticas en estos casos son muy escasas y casi nunca óptimas.

Mientras que la vigilancia de la colonización por enterobacterias productoras de BLEE y carbapenemasas debería abarcar cualquier especie, la vigilancia de las AmpC-p debería realizarse en aquellas especies que no poseen AmpC cromosómicas y han demostrado su capacidad de diseminar estas enzimas: fundamentalmente K. pneumoniae y P. mirabilis.

A. baumannii es un patógeno oportunista implicado en infecciones como neumonía asociada a ventilación mecánica, endocarditis, infecciones de la piel y partes blandas, meningitis e infecciones del tracto urinario, entre otras, especialmente entre los pacientes admitidos en las UCI.

El género Acinetobacter se compone de 30 especies con un nombre asociado y 9 especies genómicas definidas a través de estudios de hibridación ADN-ADN. Entre ellas, A. baumannii muestra una extraordinaria capacidad para adquirir resistencia a múltiples antibióticos. En el último estudio multicéntrico nacional (proyecto GEIH-GEMARA-REIPI-Ab2010) en el que se incluyeron 446 aislados de A. baumannii obtenidos de 43 hospitales españoles3, se detectó una alta prevalencia de reducción de sensibilidad a la mayoría de los antimicrobianos: >94% (ceftazidima, piperacilina y ciprofloxacino), 82-86% (carbapenemas y tetraciclina) y 60-70% (tobramicina, sulbactam, gentamicina y doxiciclina). En comparación con los datos obtenidos en un estudio previo realizado en 201014, estos aislados fueron más resistentes a ceftazidima, carbapenemas, doxiciclina, sulbactam y colistina; la mayoría fueron MDR o XDR. En este mismo estudio se puso de manifiesto como la tasa de incidencia de la colonización o infección por A. baumnanii se incrementó significativamente desde el 0,14 en 2000 al 0,52 en 2010 (p<0,001). Además, el estudio epidemiológico a través de MLST puso de manifiesto un incremento del grupo clonal ST2 en 2010, el cual mostró mayor resistencia a imipenem y se asoció a un mayor riesgo de sepsis6.

En A. baumannii se han descrito diferentes tipos de β-lactamasas, pero son las carbapenemasas adquiridas de clase D (OXA-23, -24, -58, -143 y -235) las que tienen un mayor impacto clínico y epidemiológico. La reducción en la permeabilidad, la hiperexpresión de sistemas de expulsión activa, la producción de enzimas modificantes de aminoglucósidos y cloranfenicol, metilasas, y modificaciones del sitio de interacción de la diana también están implicados en la resistencia a antibióticos en A. baumannii.

Los factores epidemiológicos implicados en la adquisición hospitalaria de Acinetobacter spp. son bien conocidos. Su implicación en brotes hospitalarios se ve favorecida por su capacidad de sobrevivir en desecación, transmitirse de paciente a paciente a través de las manos del personal y contaminar el ambiente hospitalario. En España, se han descrito brotes por A. baumannii portadores de las carbapenemasas OXA-23, OXA-24 y OXA-58.

P. aeruginosa es una de las causas más frecuentes de infección nosocomial y de infección respiratoria crónica en pacientes con fibrosis quística. La prevalencia de cepas MDR supera el 30% a nivel mundial, incluyendo los hospitales españoles; aproximadamente la mitad de las cepas MDR serían, además, XDR2. Esta creciente prevalencia se debe a la extraordinaria capacidad de P. aeruginosa para seleccionar mutaciones cromosómicas que generan resistencia y a la creciente producción de determinantes de resistencia exógenos15.

El principal mecanismo de resistencia a las penicilinas o cefalosporinas es la selección de mutantes con hiperproducción constitutiva (desrepresión) de la cefalosporinasa cromosómica inducible AmpC16. Entre los mecanismos de resistencia mutacionales destaca también la inactivación de la porina OprD, que confiere resistencia a imipenem y sensibilidad disminuida al meropenem. Finalmente, la hiperexpresión de alguna de las múltiples bombas de expulsión, principalmente MexAB-OprM y MexXY-OprM, contribuye de forma notable a los fenotipos de resistencia16. Aunque proporcionalmente es mucho menos común que la resistencia mutacional, cada vez es más frecuente la detección de elementos genéticos transferibles portadores de genes de carbapenemasas o BLEE. Estudios recientes demuestran que la mayoría de las cepas productoras de carbapenemasas o BLEE pertenecen a los denominados clones de alto riesgo, principalmente los ST235, ST111 o ST1752,5. Particularmente relevantes son las MBL, cuya prevalencia en España ha aumentado más de 10 veces (del 0,08 al 1%) en 5 años (2003-2008) y han sido responsables de importantes brotes epidémicos16. Las MBL descritas en P. aeruginosa incluyen las VIM, IMP, SPM, GIM, SIM, NDM, AIM y FIM17. La MBL detectada con mayor frecuencia en España es, con gran diferencia, la VIM-2. Entre las carbapenemasas de clase A destacan las de tipo GES y, entre las BLEE, las de tipo OXA18.

Los métodos comerciales para la detección de SARM que se han aprobado para uso diagnóstico han sido validados principalmente para muestras nasales (tabla 2)21,25. La detección de ERG se realiza principalmente en muestras de torundas rectales/perianales.

Las pruebas moleculares para la detección de SARM deben distinguir entre colonización por SARM y una colonización mixta por SASM y por estafilococco coagulasa negativa resistente a la meticilina. Algunas pruebas moleculares combinan la detección de un gen específico de S. aureus y del gen mecA, y otras tienen como diana la región de unión SCCmec-orfX. Aunque esta región se ha considerado específica de SARM, presenta cierta variabilidad, lo que puede generar una disminución en la sensibilidad de determinados métodos. Por otra parte, algunas cepas de SASM pueden contener fragmentos de la estructura del SSCmec remanentes (gen mec-negativo) y dar falsos positivos. Además, la mayoría de los ensayos moleculares comerciales no detectan el gen mecC. En general, estos métodos tienen una alta sensibilidad y un alto valor predictivo negativo. En lugares con baja prevalencia, los resultados negativos son útiles para descartar SARM, mientras que los resultados positivos requieren confirmación mediante cultivo. En lugares con alta prevalencia, estos métodos se podrían utilizar como prueba definitiva para identificar portadores de SARM.

Respecto a los métodos comerciales que se han desarrollado para la detección de ERG (BD GeneOhm VanR [BD Diagnostics, aprobado por el FDA], LC vanA/vanB detection assay [Roche Diagnostics, uso en investigación], y Xpert vanA/vanB [Cepheid, uso en investigación]) tienen como dianas moleculares los genes vanA y vanB. Estos métodos muestran una limitada sensibilidad y, sobre todo, una baja especificidad debido a la presencia del gen vanB en otras especies bacterianas. La realización de estas pruebas en muestra directa para detección rápida de genes vanA y vanB no excluye la realización del cultivo de vigilancia de ERG.

La detección de ADN de SARM en muestras clínicas se informará como: «SARM positivo: se detecta ADN de SARM»; se interpreta como colonización nasal por SARM. Si no se detecta se informará como: «SARM negativo: no se detecta ADN de SARM»; se descarta la colonización nasal por SARM.

En el caso de los ensayos moleculares para la detección de ERG, la información de los resultados es la siguiente: «Se detecta el gen vanA, vanB, o ambos. Se requiere cultivo para confirmar los resultados»; o bien «No se detectan los genes vanA/vanB. Se requiere cultivo para confirmar los resultados».

Existen diferentes métodos moleculares que permiten detectar genes adquiridos de resistencia a β-lactámicos de amplio espectro en bacilos gramnegativos. Se clasifican en función del número de genes buscados (PCR simple o PCR múltiple) y de la técnica utilizada (PCR en tiempo real, microarray y pirosecuenciación). La amplificación de ADN mediante PCR simple permite la identificación de un solo gen y requiere de iniciadores específicos para la diana buscada. Aunque es posible distinguir variantes alélicas muy similares con el diseño de iniciadores que incluyan los lugares de variación entre alelos, en general, para la caracterización de variantes alélicas específicas se requiere una posterior secuenciación del amplicón o la utilización de la pirosecuenciación. Mediante una PCR simple con iniciadores degenerados se pueden detectar diferentes variantes de una misma familia.

La utilización de PCR múltiples permite la caracterización de diferentes mecanismos en una sola reacción de amplificación. En la última década se han propuesto diferentes PCR múltiples comerciales para la detección de genes que codifican AmpC-p, BLEE y carbapenemasas. Algunas de las limitaciones de estas técnicas son el tamaño poco discriminativo de los amplicones, la utilización de diferentes condiciones de amplificación, la amplificación cruzada con genes de β-lactamasas cromosómicas y, en general, la inclusión de un número limitado de genes.

El microarray es una metodología muy útil para analizar un gran número de genes en un mismo ensayo y detectar variaciones nucleotídicas de un alelo. Es una tecnología versátil, fácil de aplicar y de actualizar que ha demostrado una alta sensibilidad y especificidad.

La amplificación isotérmica mediada por bucle (loop-mediated isothermal amplification, LAMP) se puede aplicar para la detección molecular independiente de genes de BLEE y carbapenemasas.

En el caso de P. aeruginosa, la principal limitación para la detección de la MDR por técnicas moleculares es que frecuentemente está mediada por mutaciones cromosómicas. No obstante, son de utilidad para la detección de mecanismos de resistencia transferibles. Existen múltiples técnicas disponibles, muchas de ellas comerciales, aunque generalmente están optimizadas solo para enterobacterias, lo que posiblemente afecta a la eficiencia de la técnica y determina que la selección de las dianas genéticas seleccionadas no sean las más adecuadas para P. aeruginosa. Este hecho afecta especialmente a las BLEE, ya que las más frecuentes en P. aeruginosa (OXA, PER, GES, VEB, etc.) no suelen incluirse en los protocolos diseñados para enterobacterias.

En el caso de A. baumannii se considera como principal marcador molecular de la MDR la presencia de genes que codifiquen carbapenemasas del tipo OXA (familias OXA-23, -24-58, -143, -235 e ISAba1-OXA-51). No obstante, también habrá que considerar genes que codifiquen MBL como IMP, VIM, NDM y SIM. En este sentido, se ha definido y validado una PCR en tiempo real con sondas Taqman capaz de detectar de manera rápida las carbapenemasas de clase D presentes en A. baumannii. Se están haciendo esfuerzos desde la industria diagnóstica para implementar esta tecnología a partir de muestra clínica directa, en lugar de partir de la colonia aislada, lo que se traduciría en una importante reducción en los tiempos de respuesta.

Como se ha ido reflejando en el texto, se han comercializado en los últimos años numerosos métodos moleculares de detección rápida de BLEE, AmpC y carbapenemasas en muestras rectales; la tabla 3 resume algunos de los principales métodos comerciales disponibles.

La detección mediante métodos moleculares de un gen codificante de una β-lactamasa de amplio espectro sobre muestra clínica debe informarse especificando la metodología empleada, pero no la especie, la cual desconocemos con esta aproximación: «Mediante [método empleado] se detecta la presencia de un gen codificante de [mecanismo de resistencia]». En el caso de que se haya detectado sobre colonia bacteriana previamente identificada se debe informar también la especie: «Se aísla [nombre de la especie] productora de [mecanismo de resistencia]». Dependiendo del mecanismo y de la técnica empleada se podrá especificar la β-lactamasa concreta que se detecta o bien el grupo o familia al que pertenece. La detección de una β-lactamasa perteneciente a un grupo de BLEE, AmpC-p o carbapenemasas se informará como «Mediante [método empleado] se detecta la presencia de un gen codificante de [grupo/familia del mecanismo de resistencia]». La ausencia de detección se informará como «Mediante [método empleado] no se detecta la presencia de genes codificantes de [mecanismos de resistencia probados]».