La rhBMP-2 fue suministrada por Noricum (lote B02B05) como en procedimientos previos12.

Con relación a los transportadores empleados, las muestras implantadas presentan el siguiente código:

• -

  Alginato más quitina: doble control (DC).

• -

  Alginato-rhBMP-2 más quitina: control de quitina (CQ).

• -

  Alginato más quitina-rhBMP-2: control de alginato (CA).

• -

  Alginato-rhBMP-2 más quitina-rhBMP-2: doble muestra (DM).

El alginato se preparó (Alginic Acid, A28309 Sigma Aldrich) al 2% en ácido acético al 1%. Se dejó agitando 2h a temperatura ambiente y se filtró por 0,22μm en esterilidad preparando proporciones de 200μl de volumen final en campana de flujo laminar vertical.

La muestra CQ se preparó con alginato 160μl y 40μl de proteína rhBMP-2 (1mg/ml). Se dejó en agitación a 4°C o/n (over night). Al día siguiente se mezcló con 3mg aproximadamente de quitina (Chitin, C3641 de Sigma Aldrich) en polvo estéril por radiación gamma. Mediante pipeteo constante se mezcló nuevamente para posteriormente realizar el filme en condiciones estériles. El solvente se dejó secar 24h (técnica de evaporación de solvente).

La muestra CA se preparó igual, pero el alginato no llevaba la proteína rhBMP-2, sino que esta se añadió a 3mg de quitina. La quitina con proteína (40μl) se llevó a agitación o/n a 4°C. El alginato fue preparado al día siguiente y se mezcló con la quitina y proteína preparando filmes en las mismas condiciones.

La muestra DC se preparó el mismo día de los filmes, mezclando 200μl de alginato al 2% con 3mg de quitina para posteriormente realizar el filme. Se dejó secar 24h hasta el día siguiente.

La muestra DM contiene proteína en los 2 transportadores; 140μl de alginato al 2% y 40μl de rhBMP-2. Se llevó a agitar a 4°C o/n junto con otro tubo de ensayo que contenía los 3mg de quitina y 40μl de proteína. Al día siguiente se mezclaron los contenidos de ambos tubos de ensayo y se preparó el filme.

Los filmes se implantaron tras sumergirlos en cloruro cálcico al 0,2M y filtrado previo en condiciones estériles.

Los animales intervenidos fueron sometidos a una inducción anestésica con medetomidina 0,3mg/kg (Domtor®, Pfizer, Madrid, España) y fentanilo 0,3mg/kg (Fentanest®, CERN Pharm, Barcelona, España), ambos intraperitoneales. El mantenimiento se realizó con isoflorano al 2% (Isoflo®; Esteve, Barcelona, España). Se administró una primera dosis de antibioterapia al iniciar la anestesia (enrofloxacino 5mg/kg/24h s.c.) y al finalizar la cirugía se administró una dosis de antiinflamatorio (meloxicam 0,2mg/kg/24h s.c.) y analgésico (buprenorfina 0,1mg/kg/12h s.c). Con el animal en decúbito supino fijando el miembro a intervenir en abducción y rotación interna se procede a la incisión quirúrgica de la piel de la zona anterior del hombro mediante el empleo de microscopio microquirúrgico Leica MC 1 (Leica Microsystems, Schweiz). A continuación se diseca el plano subcutáneo hasta llegar al músculo deltoides, que se abre mediante una incisión en «T» desinsertando los vientres anterior y medio, quedando expuesto el tendón supraespinoso; este se marca con Prolene® 5-0 (Ethicon, Johnson and Johnson, EE.UU.) y a continuación se secciona con la punta de un bisturí del n.o 11 perpendicular a su eje mayor y a una distancia de 4mm de su inserción, resecando el muñón tendinoso resultante hasta el troquíter y desbridando, con el bisturí, los restos del mismo en su inserción, provocando su retracción (fig. 1). Durante la técnica quirúrgica se tuvo especial cuidado en mantener intactos el resto de tendones del manguito y las estructuras de la articulación escapulohumeral. Finalmente se reinsertó el deltoides al acromion, clavícula y trapecio con Poliglactin 910 (Vicryl® 5-0) y se cerró la piel con puntos simples de sutura.

Figura 1.

Creación de la lesión tendinosa: a) marcado del tendón con Prolene® y sección proximal a su inserción en el troquíter; b) retracción del tendón en la lesión crónica.

(0.32MB).

Durante los 3 primeros días los animales recibieron tratamiento antibiótico, antiinflamatorio y analgésico según dosis previas. Durante todo el postoperatorio se les permitió movilidad libre dentro de las limitaciones propias de la estabulación. La superficie de cada jaula era de 800 cm2 y 14cm de altura, y la temperatura se mantuvo entre los 20–24°C con una humedad relativa del 65% y periodos de exposición a la luz de 12h. Los animales eran alimentados con una dieta estándar (Panlab SL) y agua según necesidad.

Se procedió a la aleatorización de los animales de experimentación mediante programa informático (Excel, Microsoft, Redmond, VA, EE.UU.).

Transcurridas 16 semanas del proceso anterior, ya generado el modelo de lesión crónica, como ha sido constatado en estudios previos23,24 se procede a la reparación tendinosa mediante sutura transósea con Prolene® 6/0 (Ethicon, Johnson and Johnson, EE.UU.) (fig. 2) de forma aislada o con el empleo adicional de un transportador de quitina/alginato sin/con rhBMP-2.

Figura 2.

Reparación del tendón: a) realización del túnel transóseo; b) sutura transósea; c) parche de transportador rhBMP-2; d) sutura con transportador híbrido con rhBMP-2.

(0.37MB).

Las ratas fueron divididas en 5 grupos en función del tipo de reparación tendinosa que se realizó:

Grupo I: grupo control C. Para la realización de este grupo de estudio se incluyeron un total de 10 ratas. Tras la sección se procedió a la reparación del tendón mediante sutura transósea con Prolene® sin aportarse otros tipos de materiales.

Grupo II: grupo doble control DC. Para la realización de este grupo de estudio se incluyeron un total de 10 ratas. Tras la sección tendinosa se procedió a la reparación del mismo a las 4 semanas mediante la misma sutura que en el grupo anterior, aportándose además un parche de alginato y quitina. Dicho parche se suturó con puntos sueltos alrededor del tendón mediante material no reabsorbible polipropileno 7/0 (Prolene® 7/0 Ethicon, New Jersey, EE.UU.). Los resultados se evaluaron de la misma forma que el grupo anterior con el mismo número de muestras.

Grupo III: grupo control alginato CA. En este grupo de estudio se incluyeron 10 ratas con una reparación tendinosa empleándose la sutura descrita previamente y un parche de quitina con BMP-2 y alginato sin BMP-2. El análisis de los resultados se corresponde al descrito en los grupos previos.

Grupo IV: grupo control quitina CQ. Para este grupo de estudio se intervinieron 10 ratas con sutura del tendón supraespinoso la cuarta semana de la sección del mismo. Se aportó además un parche con quitina sin BMP-2 y alginato con BMP-2.

Grupo V: grupo doble muestra DM. Para esta parte del estudio se suturaron 10 tendones del supraespinoso previamente seccionados. En el mismo acto quirúrgico se aportó un parche con quitina con BMP-2 y alginato con BMP-2 para analizar los resultados tanto histológicos (n=5) como biomecánicos (n=5).

Al finalizar el periodo de observación, los animales fueron sacrificados y consecutivamente se procedió a la extracción de las piezas mediante amputación interescapulotorácica. Las muestras se conservaron a –20°C hasta la realización del estudio biomecánico previo al cual se procedió a su descongelación a temperatura ambiente.

Se determinó la existencia de la lesión crónica durante la primera fase del procedimiento (ausencia de continuidad tendinosa y presencia de una brecha entre el tendón marcado y su inserción en el troquíter), y la presencia de reparación tendinosa (continuidad macroscópica del tendón lesionado), rerrotura (falta de continuidad) y atrofia muscular tras el sacrificio del animal de experimentación.

La preparación de las muestras para su estudio biomecánico consistió en embutir la extremidad sobre una resina tipo epoxi (Araldit Rápido-Ceys®) dentro de unos tubos de plástico que se sujetaron por mordazas de la máquina de tracción, permitiendo realizar un ensayo de tracción uniaxial. Para aumentar la fuerza de rozamiento entre la extremidad y la resina se envuelve la escápula y el húmero con una goma elástica y se depositan unas gotas de pegamento sobre el contacto goma-extremidad. Es importante que el pegamento no llegue a la zona de la articulación. Una vez que la resina se haya enfriado y haya adquirido cierta resistencia, hacemos lo mismo en el extremo de la escápula. Para mantener la humedad durante todo este tiempo, se envuelve la articulación con una gasa húmeda y además se deja puesto un humificador para mantener esta también en el ambiente (fig. 3). Las muestras se introdujeron formando un ángulo de 90° (posición fisiológica). Los tendones del manguito rotador se pusieron a prueba en paralelo al eje longitudinal del tendón supraespinoso en su posición fisiológica. La velocidad de tracción durante las pruebas ascendió a 1,8mm/min. Las muestras se sometieron a ciclos de cargas de hasta 10 Newtons (N) para ratas de 451-600g y 5N para ratas con pesos de 300 a 450g; se descargaron hasta llegar al punto inicial y se repitió la carga de nuevo varios ciclos hasta llegar al punto de fallo.

Figura 3.

Método de preparación de las muestras para el estudio biomecánico: a) pieza anatómica; b) tubos de plástico; c) ambos extremos de la extremidad embutidos en las piezas de plástico mediante una resina; d) colocación de la pieza en la máquina de tracción.

(0.22MB).

Todos los ensayos biomecánicos se realizaron utilizando una máquina de tracción (Instron 5866®) que registraba los valores de carga máxima en N y de deformación en mm; secundariamente se calculó la rigidez del tendón ensayado. Las definiciones de los valores registrados fueron: carga máxima: fuerza necesaria para la rotura del tejido de forma permanente; deformación o deformidad: desplazamiento utilizado para modificar la forma inicial del tendón; rigidez: la rigidez del tendón reparado se define como la pendiente de la carga máxima dividida por el desplazamiento en el punto de fallo o carga máxima.

Para el estudio histológico, tras ser fijadas las muestras en una solución de formaldehído al 4%, descalcificadas con una solución de EDTA, embebidas en parafina y cortadas con microtomo, se realizaron tinciones con hematoxilina eosina, tricrómico de Masson y rojo sirio. La evaluación de las piezas fue realizada por un patólogo que desconocía el grupo experimental al que pertenecía la muestra. Para realizar la valoración de las tinciones histológicas, tanto en los casos de lesión crónica como en los casos de reparación, se utilizó una escala de valoración semicuantitativa basada en las empleadas en estudios previos25,26, con la cual se evaluaron los siguientes parámetros:

• 1.

  Matriz extracelular de colágeno: orientación de las fibras que discurren de forma paralela o bien edema y desorganización de las fibras.

• 2.

  Zona de transición de tendón a hueso: trabeculado de transición normal entre hueso y tendón, presencia de haces de colágeno con orientación menos uniforme o ausencia de zona de transición.

• 3.

  Inflamación de la bursa: presencia o ausencia de infiltrado inflamatorio en la bursa que rodea a la matriz tendinosa: linfocitos, mastocitos, macrófagos, etc.

• 4.

  Proliferación vascular: presencia de arteriolas que discurren de forma paralela a las fibras de colágeno, vascularización irregular o presencia de vasos de pared delgada que discurren de forma desorganizada, incluso perpendiculares a las fibras de colágeno.

• 5.

  Celularidad: presencia de tenocitos (células alargadas con un pequeño núcleo), presencia de células con núcleo redondeado y aumento de la celularidad.

• 6.

  Degeneración grasa: presencia o ausencia de adipocitos.

• 7.

  Metaplasia condroide: ausencia de condrocitos o presencia de condrocitos dentro de la matriz tendinosa.

Se estableció una escala general o score de 4 puntos, cuantificando cada parámetro previamente descrito mediante 4 valores que correspondían a: 0 normalidad, 1 leve, 2 moderado, 3 severo. Por lo tanto, el tejido normal puntúa 0 y el peor resultado suma 15 puntos. Los parámetros que se evaluaron se resumen en la tabla 1.

Se realizó durante el diseño del estudio un cálculo del poder estadístico empleando datos publicados previamente que detectaran diferencias de al menos un 25% en la carga necesaria hasta el fracaso o fallo de la reparación. De esta manera se determinó que eran precisos 10 especímenes por grupo para el estudio biomecánico, lo que proporcionaría una potencia estadística cercana al 80% con un error tipo I de 0,005.

El análisis de datos se inició con un estudio de la normalidad de las distribuciones. Para ello, debido al tamaño poblacional, se realizó el test de Saphiro-Wilk, comprobando así que no cumplía los requisitos de una distribución normal. Posteriormente, teniendo en cuenta las características y los datos obtenidos del estudio de la normalidad, para la comparación intergrupal se realizó el test no paramétrico Kruskal-Wallis. Se fijó el nivel de significación estadística en p<0,05.

Tras el primer tiempo del procedimiento quirúrgico se objetivó en la evaluación macroscópica la presencia de una rotura del tendón en su inserción en el troquíter con retracción del tendón en el 100% de los casos (fig. 4). Al reparar dicha lesión se consiguió restaurar la inserción tendinosa en el troquíter en todos los casos, sin embargo, en 3 de ellos esta sutura se encontraba con excesiva tensión. En la evaluación macroscópica final, después del sacrificio de los animales, se objetivó la continuidad del tendón en todos los animales salvo en 3 casos, en los que existía una rerrotura y que coincidían con los 3 casos en los que la sutura quedó a tensión. Así mismo, en 6 casos hallamos algún tipo de calcificación macroscópica (fig. 5).

Figura 4.

Aspecto macroscópico de las piezas: a) buen aspecto macroscópico; b) calcificación y atrofia muscular; c) rerrotura tendinosa.

(0.18MB).

Figura 5.

Tinción hematoxilina-eosina y tricrómico de Masson 50×: a) grupo I; b) grupo II; c) grupo III; d) grupo IV; e) grupo V.

(0.42MB).

En la tabla 2 se resumen las características macroscópicas de las piezas de estudio.

En el grupo I se observa metaplasia condroide y desorganización de las fibras de colágeno como consecuencia de la degeneración tendinosa así como un incremento de la vascularización. En el grupo II predomina la desorganización de las fibras de colágeno, la aparición de fibroblastos y la ausencia de una correcta transición hueso-tendón con ausencia de zonas fibrocartilaginosas, como sucede de forma natural en el tendón. En los grupos III y IV, a diferencia de los 2 anteriores, las fibras aparecen más ordenadas y la vascularización es menor (fig. 6). Finalmente, en el grupo V el componente inflamatorio es considerablemente menor y la transición tendinosa entre el hueso y el tendón presenta un aspecto muy similar al encontrado en condiciones fisiológicas.

Figura 6.

Reparación con transportador y rhBMP-2: a) tinción con hematoxilina-eosina. Zona de transición normal, presencia de haces de colágeno con orientación uniforme (++); b y c) tinciones con hematoxilina-eosina y rojo sirio. Matriz de colágeno con orientación paralela (+).

(0.35MB).

La puntuación histológica alcanzada por los grupos con transportador con o sin rhBMP-2 (grupos II, III, IV, V) resulta significativamente superior (p<0,05) a la alcanzada por el grupo con solo sutura (grupo I). A su vez, comparando la puntuación total alcanzada por los grupos que contienen rhBMP-2, en la escala de valoración histológica hemos hallado de manera estadísticamente significativa una menor puntuación del grupo V en relación con los grupos III y IV respectivamente. Los resultados se encuentran resumidos en la tabla 3.

Al realizar la comparación entre los 5 grupos se observó que los hombros del grupo V ofrecían menor rigidez que los hombros de los demás grupos, siendo las diferencias estadísticamente significativas solo en relación con los grupos I y II (p=0,029, p=0,003). La carga máxima media hasta el fracaso fue de 48,3N para el grupo I, 62,6N para el grupo II, 56N para el grupo III, 49,4N para el grupo IV y 62,9N para el grupo V. En la tabla 4 se recogen los resultados de dicha evaluación.

Los autores declaran que los procedimientos seguidos se conformaron a las normas éticas del comité de experimentación humana responsable y de acuerdo con la Asociación Médica Mundial y la Declaración de Helsinki.

Los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.

Los autores declaran que en este artículo no aparecen datos de pacientes.