T. reesei (anamorfo de Hypocrea jecorina) ha sido el modelo de microorganismo celulolítico por excelencia. Fue aislado en las islas Salomón durante la Segunda Guerra Mundial como el agente causal de la infección masiva del material a base de algodón del ejército de los Estados Unidos. Inicialmente fue identificado como Trichoderma viride, codificado como QM6a y conservado en el Centro de Investigación y Desarrollo del Ejército de los Estados Unidos en Natick, Massachusetts32,48. Su potencial como productor de celulasas fue reconocido por Mandels y Reese en 195741, más tarde fue clasificado como una nueva especie y renombrado como T. reesei en honor al investigador del laboratorio de Natick, Elwyn T. Reese48. Desde entonces, este microorganismo ha sido objeto de numerosas investigaciones. En Japón, por ejemplo, la obtención de mutantes hiperproductores de celulasas es parte de un proyecto nacional para la generación de combustibles alternativos al petróleo desde 197046. Como resultado de este proyecto se han obtenido 2 mutantes importantes producto de una mutagénesis clásica, KDG-12 y PC3-7, que muestran una alta productividad de celulasas, resistencia a la represión catabólica por glucosa y alta inducibilidad por sorbosa28. Otro mutante hiperproductor de celulasas muy utilizado es RUT-C30, obtenido en la Universidad Rutgers, en Nueva Jersey, en 1977. Esta cepa fue generada mediante la combinación de mutagénesis clásica y radiación UV, y es capaz de producir de 15 a 20 veces más celulasas que QM6a, además de evitar la represión catabólica por glucosa48. Estos mutantes no solo han servido para la producción de enzimas celulolíticas a escala industrial, sino que también han sido utilizados como modelos para entender la regulación de la expresión de estas enzimas en T. reesei.

El genoma de T. reesei tiene un contenido de guanina-citosina del 52%, un tamaño de 33,9Mb y 9.129 genes que corresponden al 40,4% codificante. La longitud promedio de un gen es de 1.793pb, con 3,1 exones por gen (longitud promedio del exón, 508pb; longitud promedio del intrón, 120pb). Dentro de este genoma se han identificado 200 genes que codifican para glicosil hidrolasas42, de los cuales 2 codifican para celobiohidrolasas (EC.3.2.1.91), 7 para endoglucanasas (EC.3.2.1.4) y 15 para β-glucosidasas (EC.3.2.121) (tabla 3), cuya expresión es dirigida simultáneamente por inductores específicos, como la celulosa o subproductos de esta, y reprimidos simultáneamente por altos niveles de glucosa17,42,46.

Encontrar la respuesta a la pregunta: «¿Cómo la celulosa, siendo un sustrato insoluble, es capaz de inducir la expresión de enzimas celulolíticas?» ha sido objeto de numerosas investigaciones. La primera hipótesis sobre la que se trabajó es que la baja expresión basal de celulasas hace que se libere glucosa y celobiosa y que estos subproductos solubles actúan como inductores de la actividad enzimática. Al respecto, Mandels y Reese encontraron en 1960 que la glucosa no es un inductor, muy al contrario, actúa como un inhibidor, y que la celobiosa, aunque induce, lo hace muy pobremente40. Estos mismos investigadores, en 1962 reportaron que la soforosa (β-D-glucosa-[1,2]-D-glucosa), una impureza de la glucosa obtenida de la hidrólisis ácida del almidón, induce 2.500 veces más la expresión de celulasas comparada con la celobiosa, que parecía ser el inductor natural lógico39. Esta observación fue confirmada por Sternberg y Mandels, quienes estudiaron, además, los factores que afectan la inducción, encontrando que la cinética, así como el efecto del pH y la temperatura sobre este, son muy similares a lo encontrado cuando la inducción se realiza con celulosa, evidenciando que la soforosa podría ser el inductor natural58. Esto último se confirmó en estudios posteriores, en los que se demostró la formación de soforosa in vitro en suspensión de células lisadas de T. reesei68 y la presencia de una β-glucosidasa constitutiva localizada en la membrana plasmática, que podría ser la responsable de dicha formación67.

Aunque se había identificado la soforosa como el inductor natural de la síntesis de celulasas, seguía sin respuesta la pregunta de cómo se induce esta síntesis. En 1987, Kubicek estudió la inducción de endoglucanasas en conidios, micelio y protoplastos de T. reesei y encontró que la celulosa induce la síntesis de endoglucanasas solamente en conidios, mientras que otros celooligosacáridos son capaces de inducir esta síntesis en micelio, conidios y protoplastos. Además, Kubicek encontró que cuando se inhibe la β-glucosidasa localizada en la membrana plasmática, se bloquea la síntesis de endoglucanasas cuando se utiliza celulosa o celooligosacáridos como inductores, para conidios o protoplastos y micelio, respectivamente, mientras que la inducción por soforosa no se ve afectada30. Este mismo investigador, en 1988 reportó la presencia de celobiohidralasas unidas a la superficie de los conidios, concluyendo así que estos expresan todas las enzimas del complejo celulolítico33. Recientemente, estudios de expresión génica mediante microarrays permitieron comparar la expresión de 900 genes durante la transición de hifa a conidio, encontrándose aumentada en este último la transcripción de los genes involucrados en transporte, síntesis de metabolitos secundarios, lipasas, proteasas y, particularmente, celulasas y hemicelulasas, confirmando de esta manera el papel de los conidios en la hidrólisis de celulosa y hemicelulosa43.

Lo anteriormente expuesto se puede resumir en el modelo propuesto por Suto y Tomita en 2001, que comprende 6 etapas: primera, los conidios entran en contacto con la celulosa y las celulasas en su superficie la degradan a celooligosacáridos, que son luego hidrolizados a glucosa y transglucosilados a soforosa por una β-glucosidasa constitutiva; segunda, los conidios germinan y la glucosa como fuente de carbono y la soforosa como inductor entran en la célula. La β-glucosidasa, unida a la membrana plasmática, convierte los celooligosacáridos en soforosa y glucosa; tercera, la soforosa induce la síntesis de celulasas que son secretadas fuera de la célula; cuarta, las celulasas secretadas degradan la celulosa causando un aumento en la cantidad de celooligosacáridos y de glucosa; quinta, la glucosa es asimilada, los celooligosacáridos son hidrolizados a glucosa y transglucosilados para formar soforosa; y sexta, el ciclo continúa hasta que el sustrato se agota64 o el sistema es reprimido por represión catabólica, como se explicará más adelante (fig. 2).

Figura 2.

Modelo de inducción de celulasas en Trichoderma reesei. Los números se corresponden con los usados en la explicación en el texto.

BGL: β-glucosidasa; CBH: 1,4-β-D-glucano celobiohidrolasa; EGL: endo-1,4-β-D-glucanasa.

Traducida de Suto y Tomita64, reproducida con permiso.

(0.31MB).

Aunque ya se ha contestado parte de la pregunta inicial, aún no se ha respondido cómo es regulado este sistema. A este respecto, la presencia obligatoria de un inductor (en este caso, soforosa) para la expresión de estas enzimas implica una regulación a nivel de promotor. Hasta la fecha se han identificado 4 activadores transcripcionales (Xyr1, Ace2, Bgl1 y el complejo HAP2/3/5) y 2 represores (Ace1 y el represor catabólico por carbono Cre1)32,46 (tabla 4).

Xyr1 es una proteína de unión al ADN con un cluster binuclear de cinc que se encuentra exclusivamente en hongos. Esta proteína se une al motivo GGCTA ubicado como una repetición invertida separada por 10pb (5’-GGCTAAATGCGACATCTTAGCC-3’) en la región promotora50. Inicialmente fue identificado como inductor de xilanasas; sin embargo, Stricker et al., en 2006, demostraron que la deleción de xyr1 en T. reesei no solamente restringe fuertemente la utilización del xilano, sino que también elimina la inducción de celulasas por celulosa y soforosa, indicando que Xyr1 es un activador general y esencial de la transcripción, que gobierna la expresión del sistema enzimático celulolítico (cbh1, cbh2, egl1 y bgl1) y participa en la regulación del sistema xilanolítico (xyn1 y xyn2) en T. reesei36,61. Aro et al., en 2001, aislaron un segundo activador de la expresión de celulasas, Ace2. Al igual que Xyr1, es una proteína de unión a ADN con un cluster binuclear de cinc, se une a la secuencia 5’-GGCTAATAA-3’ del promotor del gen cbh1 y regula los genes cbh1, cbh2, egl1 y egl2. La deleción de ace2 lleva a una disminución en la cantidad de ARNm de las celobiohidrolasas i y ii y de las endoglucanasas i y ii, y a una disminución en la actividad de celulasas totales, entre el 30 y 70%. Al contrario de lo que podría esperarse, la inducción de celulasas por soforosa no se ve afectada por la deleción de ace2, lo que indica que para la inducción por celulosa y soforosa se emplean al menos parcialmente diferentes mecanismos moleculares4. Recientemente se describió otro activador transcripcional, denominado Bgl1, con la misma estructura mencionada para los 2 anteriores. Bgl1 regula la transcripción temprana de genes específicos que codifican para β-glucosidasas46. Por otro lado, Zeilinger et al. (1988 y 2001) encontraron que la expresión del promotor cbh2 depende de la unión del complejo proteico HAP2/3/5 a la caja CCAAT, un elemento cis encontrado en las regiones promotoras de un gran número de genes eucariotas. Al parecer, el complejo proteico se encarga de la desestabilización de la cromatina necesaria para la activación de la transcripción74,75.

Los 2 reguladores negativos descritos hasta ahora son Cre1 y Ace1. Cre1 fue descrito por primera vez en 1995 por Strauss y et al. como una proteína de unión a ADN con la estructura típica de «dedo de cinc", Cys2His2, y algunas regiones ricas en prolina y aminoácidos básicos que pueden estar involucradas en la interacción con otras proteínas. Cre1 se une a la secuencia 5’-GCGGAG-3’, probablemente como un complejo proteico60, y se ha determinado que la fosforilación de la serina de la posición 241 es fundamental para la unión de Cre1 a la secuencia blanco10. La dinámica de represión catabólica de Cre1 ha sido mejor comprendida gracias al estudio del mutante RUT-C30, en el cual cre1 aparece truncado y solo codifica para una de las 2 regiones de «dedos de cinc» de la proteína Cre1. De esta manera, T. reesei RUT-C30 produce celulasas y hemicelulasas en un medio que contiene glucosa, y cuando se complementa la mutación con el gen cre1 de la cepa silvestre se restaura el fenotipo de represión por glucosa26. Nakari-Setälä et al. (2009) encontraron que el papel de Cre1 va más allá de la «simple» desrepresión por glucosa al demostrar que la deleción de cre1 en una cepa silvestre lleva al incremento tanto en la actividad como en la cantidad de ARNm de celulasas en un medio con glucosa, resultado esperado por la liberación de la represión catabólica. Sin embargo, también observaron que la producción de celulasas en el medio con glucosa fue mucho más baja que en un medio con celulosa para la cepa deficiente en cre1, así como un gran aumento en la producción de proteínas en el medio con celulosa, evidenciando que cre1 juega un papel en la modulación de la expresión de genes de celulasas bajo condiciones de inducción44.

Saloheimo et al., en 2000, aislaron un gen que codifica para otro factor de transcripción de genes de celulasas, al que denominaron Ace1. Esta proteína contiene 3 motivos «dedo de cinc» del tipo Cys2His2, y establecieron que in vitro se une al promotor cbh153. Posteriores estudios mostraron que la deleción de este gen aumenta de 2 a 30 veces la transcripción de los genes cbh1, cbh2, egl1 y egl2 y, en consecuencia, aumenta la habilidad del hongo para degradar la celulosa, indicando que Ace1 es un regulador negativo y que este mecanismo es independiente de Cre13.

Con el advenimiento de las «ómicas», se han realizado nuevos estudios sobre estos «viejos modelos» intentando dar una visión más holística. En 2011, Portnoy et al. demostraron que el papel regulatorio de Cre1 es mucho más complejo de lo que se había reportado hasta la fecha. Estos investigadores identificaron 207 genes regulados por Cre1, de los cuales 118 son regulados negativamente por este. Dentro de este grupo, un alto porcentaje corresponde a genes que codifican para permeasas de membrana, lo que indica que la represión catabólica actúa preferencialmente en la entrada de sustratos a la célula y constituye un mecanismo por el que los hongos pueden recuperar incluso trazas de fuentes de carbono a una velocidad alta. También encontraron que las permeasas que transportan compuestos de nitrógeno son reguladas por Cre1, hecho que evidencia que las proteínas y sus productos de degradación son sustratos preferidos para un metabolismo rápido de los hidratos de carbono49. Estudios del secretoma de T. reesei cultivado en celulosa como fuente de carbono han permitido identificar, además de celulasas y hemicelulasas, lacasas, glioxal oxidasas (una metaloenzima importante en la degradación de lignina), peptidasas y amidasas, lo que lleva a especular que el rompimiento de la celulosa por T. reesei puede ser asistido por oxidasas31, hecho que debe ser probado y que cambiaría el paradigma de los mecanismos de hidrólisis de la celulosa. Otro dato interesante es la detección de enzimas intracelulares (tales como deshidrogenasas) en los filtrados de los cultivos, indicando que la secreción de estas enzimas está acompañada de autolisis o fragmentación del micelio, si bien estos hallazgos aún carecen de mayor evidencia experimental31.

A. niger es un microorganismo muy utilizado en biotecnología dada su habilidad de secretar grandes cantidades de una gran variedad de ácidos orgánicos y de enzimas necesarias para la hidrólisis de biopolímeros, entre ellas, celulasas. El genoma de A. niger está organizado en 8 cromosomas, con un tamaño total de 33,9Mb, un contenido de guanina-citosina del 50,4% y 14.165 genes que codifican para proteínas, de los cuales 35 codifican para celulasas (tabla 3). Cada gen tiene una longitud promedio de 1.572pb y 2,57 intrones (tamaño promedio de un intrón: 97pb; tamaño promedio de un exón: 370pb)47. A. nidulans es considerado un microorganismo modelo y ha sido utilizado en el estudio de la fisiología celular en eucariotas en temas tales como regulación del metabolismo, desarrollo, control del ciclo celular, estructura de la cromatina y función del citoesqueleto, entre otros. Al igual que en A. niger, el genoma de A. nidulans está organizado en 8 cromosomas, tiene un tamaño total de 30,1Mb, un contenido de guanina-citosina del 50% y 9.541 genes que codifican para proteínas, de los cuales 39 codifican para celulasas (tabla 3), cada gen con una longitud promedio de 1.547pb y 3,6 exones (longitud promedio de un intrón: 97pb; longitud promedio de un exón: 370pb)19.

El primer reporte de un activador transcripcional de enzimas extracelulares en hongos filamentosos fue hecho para A. niger. En 1998, Van Peij et al.. identificaron una proteína de 875 aminoácidos con un cluster binuclear de cinc que se une a la secuencia 5’-GGCTAAA-3’ que aparece por triplicado en el promotor xlnA, a la que denominaron XlnR. Esta proteína activa la transcripción de los genes del sistema xilanolítico xlnA, xlnB, xlnC, xlnD y axeA, así como también la transcripción de genes que codifican para endoglucanasas, eglA y eglB, y celobiohidrolasas, eg1A y eg1B; indicando una posible coordinación en la regulación de las xilanasas y celulasas21,70,71. Aunque el gen xlnR es ortólogo de xyr1 de T. reesei, el mecanismo de regulación es diferente, mientras que en T. reesei Xyr1 induce la expresión de celulasas y algunas xilanasas a través de la inducción por soforosa39,40,58, en A. niger la transcripción de eglA, eglB, cbhA y cbhB es dirigida por XlnR por inducción de D-xilosa y no por soforosa u otro producto de degradación de la celulosa21. Al igual que en T. reesei, en este modelo se asume que una limitación por carbono lleva a una condición de desrepresión por el catabolito, y en este estado los azúcares monoméricos, D-xilosa para A. niger, o sus derivados, y soforosa para T. reesei, pueden actuar como inductores; la naturaleza de este azúcar monomérico determina el sistema enzimático que es inducido62. En A. niger el activador es expresado en presencia de xilano y lleva a una coutilización de la celulosa; en ausencia de xilano este sistema podría no ser activado o serlo pobremente, lo que conlleva un crecimiento reducido cuando la celulosa es la única fuente de carbono9.

En A. niger, la expresión de genes xilanolíticos y celulolíticos es fuertemente reprimida por glucosa, fructosa y D-xilosa. Esta represión es mediada fundamentalmente por creA, que es el ortólogo de cre1 en T. reesei14,52. Ahora bien, si la D-xilosa es el inductor, ¿cómo puede ser al mismo tiempo el represor? De Vries et al. (1999) evaluaron esta dinámica comparando la expresión de genes xilanolíticos en una cepa silvestre y una mutante para creA y encontraron que el nivel de expresión de estos genes depende del balance entre la inducción por XlnR y la represión por CreA. La D-xilosa es liberada gradualmente del xilano, lo que lleva a una baja concentración de D-xilosa en el medio. Bajo estas condiciones la represión por D-xilosa mediada por CreA es baja y se detectan niveles altos de expresión. Cuando los niveles de D-xilosa en el medio alcanzan concentraciones de 70mM, la represión a través de CreA juega un papel más importante, resultando en una disminución de los niveles de expresión14. El mecanismo de represión mediado por CreA ha sido estudiado más detalladamente en A. nidulans, en el cual se han encontrado al menos 3 mecanismos involucrados: 1) la activación de la expresión del gen creA dependiente de monosacáridos; 2) autorrepresión del gen creA, dependiente de la formación de glucosa-6-P, y 3) regulación de la función de CreA por modificaciones traduccionales o postraduccionales11,59, las cuales pueden ser dadas por un mecanismo de ubiquitinación-desubiquitinación. Respecto a este mecanismo, los genes creB, creC34y creD6 se han aislado en A. nidulans. El primero codifica para una enzima desubiquitinante que forma un complejo in vivo con la proteína codificada por creC. Se ha propuesto que este complejo elimina la ubiquitina de CreA, modificando o estabilizando la proteína34, de manera que cumpla su función; de este hecho se deduce que mutaciones en los genes creB y creC llevan a una parcial desregulación de la represión por carbono32. Por otra parte, CreD contiene dominios arrestina y motivos PY altamente similares a las proteínas de Saccharomyces cerevisiae Rod1p y Ros3p, las cuales interactúan con la ubiquitina ligasa Rsp5p, indicando el posible rol de CreD en la ubiquitinación de CreA6.

N. crassa fue aislado por primera vez en 1843 como un contaminante en una cervecería en París, y desde 1940 ha sido un microorganismo modelo para estudios genéticos, bioquímicos y de biología de hongos51. Aunque su capacidad de degradar celulosa se conoce desde hace unos 30 años65, relativamente pocos estudios se han publicado respecto a la regulación de este sistema, por lo que se puede considerar un «nuevo modelo» en este tema específico. N. crassa tiene 7 cromosomas y las características más importantes de su genoma son: contenido de guanina-citosina del 50%, un tamaño de 38,7Mb y 10.082 genes que corresponden al 38,5% codificante. La longitud promedio de un gen es de 1.673pb, con un promedio de 1,7 intrones por gen (longitud promedio de un intrón: 134 nucleótidos)18. Se ha predicho que el genoma de N. crassa contiene 171 genes que codifican para glucosilhidrolasas, un 15,5% menos que T. reesei; sin embargo, de estos genes, 34 codifican para celulasas (tabla 3), un 42% más que T. reesei.

A diferencia de los 2 modelos presentados hasta ahora (T. reesi y A. niger/A. nidulans), poco se conoce acerca de la inducción y regulación de celulasas en N. crassa. El primer reporte fue hecho por Tian et al. en 2009, quienes mediante el uso de microarrays identificaron 114 genes, predominantemente involucrados en el metabolismo del carbono, que mostraron diferencias en la expresión cuando N. crassa fue cultivada sobre un sustrato lignocelulósico (Miscanthus) y sobre celulosa cristalina (Avicel®), en comparación con el crecimiento sobre sacarosa. Adicionalmente, fueron identificadas 22 proteínas, entre estas 9 de las 24 celulasas predichas, 5 hemicelulasas, 5 proteínas con actividad predicha sobre hidratos de carbono y 2 proteínas con función desconocida65. El hecho de que se expresen hemicelulasas sobre celulosa induce a especular que la celulosa podría ser el inductor primario, así como en T. reesei, en el que la inducción por celulosa induce también la expresión de hemicelulasas y xilanasas36,61. Sin embargo, esta hipótesis necesita ser comprobada. Por otra parte, en dicho estudio se identificó la celobiohidrolasa i como la proteína extracelular producida mayormente durante el crecimiento en Avicel® y en Miscanthus, y que la deleción del gen cbh1 causa deficiencias severas en el crecimiento sobre estos sustratos65, a diferencia de T. reesei, en el que el fenotipo más severo es causado por la deleción de cbh256.

Sun y Glass, en 2011, evaluaron el nivel de expresión de genes y la actividad de celulasas en un mutante para el ortólogo de cre1/creA en N. crassa. Cuando este mutante se sembró en un medio con celulosa cristalina (Avicel®) como única fuente de carbono, mostró una mayor velocidad en el consumo del sustrato en comparación con la cepa silvestre (3-4 frente a 5-6 días), el 30% más de proteínas secretadas al medio y el aumento del 50% en la actividad de endoglucasas, lo que indica el rol de cre1 en la represión de la expresión de celulasas63, al igual que sus ortólogos en T. reesei10,26,44,60 y en A. niger14,52. En este mismo estudio se identificaron 9 genes, blancos directos de Cre1, entre los que se encuentran el ortólogo de amyA de Aspergillus oryzae, involucrado en la degradación del almidón, el gen cbh1, 2 genes que codifican para xilanasas, un gen que codifica para una glucosidasa y un gen para un transportador de monosacáridos, lo que evidencia que Cre1 puede regular directamente algunos genes involucrados en el transporte de azúcares, además de genes que codifican para enzimas asociadas a la utilización de diversas fuentes de carbono63.

Recientemente se reportaron 2 nuevos factores de transcripción en N. crassa, requeridos para el crecimiento y la actividad enzimática sobre celulosa, pero no requeridos sobre hemicelulosa o xilano. Estos son clr1 y crl2, que codifican para factores de transcripción de la superfamilia del cluster binuclear de cinc específicos de hongos. Estos fueron identificados mediante la selección de mutantes con crecimiento deficiente en celulosa cristalina (Avicel®). Estos investigadores evaluaron 269 mutantes de N. crassa, cada uno de ellos con deleción de un gen para un posible factor de transcripción, incluyendo los ortólogos de xlnR/xyr1, ace1 y hap2, los cuales, en contra de lo que se esperaba, no mostraron ninguna diferencia en el crecimiento sobre Avicel® en comparación con la cepa silvestre8. De estos resultados se puede inferir que el homólogo de XlnR/Xyr1 no es necesario para la expresión de genes de celulasas en N. crassa, como sí lo es para A. niger21,70,71 y T. reesei36,61, lo que evidencia que las diferentes especies de hongos han desarrollado mecanismos diferentes en respuesta a distintos inductores, provenientes de fuentes complejas como la celulosa o la hemicelulosa. Por otra parte, Clr1 promueve la expresión de genes de celulasas, específicamente β-glucosidadas, y otros necesarios para la utilización de la celobiosa, así como la expresión de clr2, mientras que Clr2 induce la expresión de genes de otras celulasas y hemicelulasas, posiblemente formando un heterocomplejo con la molécula activa de Clr18.

Similar a lo publicado por Portnoy et al. (2011) para T. reesei49, la deleción de clr1 y clr 2 en N. crassa tiene efecto sobre un gran número de genes, indicando lo complejo de estos sistemas. Trescientos treinta y tres genes presentan expresión diferencial en estos mutantes, de los cuales 212 presentaron expresión aumentada en Avicel®, entre los que se encuentran 17 de 24 celulasas predichas, 11 de 19 hemicelulasas predichas, 22 de enzimas con actividad sobre polisacáridos, 56 de proteínas de la vía secretoria, 13 transportadores, 3 componentes del complejo de traslocación del retículo endoplasmático, 2 retículo endoplasmático disulfuro isomerasas, 2 proteínas chaperonas (HSP70, calreticulina), 7 enzimas citosólicas con actividad sobre disacáridos y un homólogo a xyr18. Se observa para N. crassa, al igual que para T. reesei, un gran número de genes que codifican para proteínas con funciones de secreción; ello evidencia que la modificación de estas vías es requerida para el incremento de la secreción de proteínas que acompañan el metabolismo de la celulosa.