El polimorfismo −1131 T>C del promotor del gen de la apolipoproteína A5 altera la unión de NRF2 (nuclear respiratory factor-2) y disminuye la actividad del promotor

Introducción

El papel que desempeñan los triglicéridos (TG) ingeridos en la dieta en la aparición de aterosclerosis es controvertido. Sin embargo, recientemente se ha descrito que los valores de TG en estado posprandial son un factor de riesgo independiente para la aparición de esta enfermedad. Recientemente, se ha identificado la apolipoproteína (Apo) AV como una proteína clave en la regulación del metabolismo de los TG. El polimorfismo −1131 T>C del gen de la ApoA5 se ha asociado con cambios en los valores plasmáticos de TG y de ApoAV. El objetivo de este trabajo fue determinar el papel del polimorfismo −1131 T>C en la expresión del gen ApoA5.

Material y métodos

Con el fin de estudiar la influencia de este single nucleotide polymorphisms (SNP) en la expresión de este promotor, se han utilizado construcciones de genes reporteros de ambos alelos. Mediante experimentos de retardo en gel se demostró que este polimorfismo también altera la secuencia de unión a NRF-2.

Conclusiones

Nuestros resultados indicaron que la actividad del promotor de ApoA5 que porta la variante T del SNP –1131 T>C es mayor que la del promotor que lleva el alelo C. Además, este cambio de nucleótido se traduce en un cambio de afinidad proteínas-ácido desoxirribonucleico. Estos resultados indican que un cambio en la actividad del promotor del gen ApoA5 podría ser la causa del incremento de los valores plasmáticos de TG asociados con el alelo C.

Introduction

Postprandial triglycerides (TG) have been established as an independent risk factor for atherosclerosis, even though the role of fasting TG in the pathogenesis of this disease remains controversial. Recently, apolipoprotein AV (ApoAV) has been identified as a key player in TG metabolism. The –1131 T>C polymorphism in the ApoA5 gene promoter has been associated with changes in plasma triglyceride and ApoAV levels. Our objective was the functional analysis of the SNP –1131 T>C located on ApoA5 promoter to clarify his effect on ApoA5 expression.

Material and methods

In order to test if this SNP influences promoter function, we have performed reporter gene assays. Our results indicated that the promoter carrying the T allele is stronger than its C- allele variant. Additionally electrophoretic – mobility shift assays showed that the variant also produces a change in a NRF-2 binding site.

Conclusions

Together, these results suggest that a change in the activity of ApoA5 promoter could be responsible for the increases in plasma TG levels associated with the C allele.

Introducción

La apolipoproteína (Apo) AV es una apolipoproteína plasmática que participa de la formación de las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) y de alta densidad (HDL), así como de los quilomicrones. El gen ApoA5 se localiza en el brazo largo del cromosoma 11 humano y forma parte de una agrupación génica que incluye los genes de las ApoA1, ApoC3 y ApoA4. Experimentos llevados a cabo con ratones transgénicos indican un papel importante de la ApoAV en la homeostasis de los triglicéridos (TG). Además, ratones knock out para ApoA5 presentan valores más bajos de proteína ApoAV y valores más elevados de TG en plasma que los ratones control^1,2. Por otra parte, la sobreexpresión de ApoA5 en ratones, tanto de origen humano como murino, disminuye la cantidad de TG en sangre^1,3,4, lo que está de acuerdo con los efectos observados con algunas mutaciones puntuales, las cuales originan proteínas truncadas a partir de este gen, y que resultan en el incremento de los valores de TG en plasma^5–7. Además, también se ha descrito que en ausencia de ApoA5 se incrementa la síntesis de VLDL, que son sustratos pobres de la lipoproteína lipasa (LPL)², e incluso se ha descrito que la ApoA5 funciona como un coactivador de la LPL^4,8. Todos estos datos podrían explicar el incremento de los valores plasmáticos de TG observados cuando disminuye la cantidad de ApoA5.

Se han estudiado diversas variantes del gen ApoA5 con el fin de explicar las diferencias de concentración de TG en sangre descritas en varias poblaciones. En muchos estudios de asociación realizados utilizando single nucleotide polymorphisms (SNP) de ApoA5 como marcadores, se ha puesto de manifiesto que 3 de estos SNP (56 C>G, 553 G>T y − 1131 T>C) destacan en las asociaciones genotipofenotipo^9,10. De todos estos SNP del gen ApoA5, el polimorfismo − 1131 T>C (rs662799) es el más estudiado, ya que el alelo minoritario − 1131 C se ha asociado con concentraciones mayores de TG en mujeres del estudio Framingham¹¹, asociación que se confirmó posteriormente en varones en el estudio LOCAT¹². El efecto del SNP − 1131 T>C se ha demostrado en poblaciones de diferente origen étnico¹³ y está afectado por la ingesta de ácidos grasos omega 6¹⁴. Estudios recientes llevados a cabo con la cohorte de EPIC-Norfolk han confirmado que el alelo -1131C se asocia con concentraciones altas de TG y, lo que es aún más interesante, con concentraciones bajas de ApoA5, lo que indica que este polimorfismo podría estar afectando a la expresión de este gen¹⁵.

Con el fin de comprobar si el polimorfismo localizado en la posición − 1131 del promotor de ApoA5 produce algún cambio funcional en el ámbito molecular, hemos medido la actividad luciferasa de ambos alelos y analizado la potencia de ambos promotores en células originarias de hepatoma humano (HepG2). Por otra parte, se ha demostrado en este trabajo que el cambio de nucleótido provocado por la presencia del SNP − 1131 T>C altera la unión del factor de transcripción NRF2 (nuclear-respiratory factor 2), lo que indica un posible mecanismo por el cual este SNP podría alterar la cantidad de TG plasmáticos.

Material y métodos

Construcción de plásmidos reporteros

Se clonó un fragmento de promotor del gen ApoA5 de un tamaño de 1379 pb, que comprende desde las coordenadas − 1316 a + 63 relativas al sitio de inicio de transcripción como se describe en Prieur et al¹⁶. El fragmento se amplificó por reacción en cadena de polimerasa (PCR; los oligonucleótidos empleados para la realización del clonaje fueron: directo 5'-CCGAGCTGGCCTACATTTAC-3' y reverso: 5'-ATGCCCTCCCTTAGGACTGT-3'), y fue clonado en el plásmido sin promotor pGL3 basic (Promega). Se construyó un plásmido reportero con cada uno de los alelos en posición − 1131, su secuencia se confirmó por secuenciación y se determinó que este polimorfismo era la única diferencia entre ellos.

Cultivo celular y transfección transitoria

La línea celular de hepatocarcinoma humano, HepG2, se creció en Dulbecco's Modified- Eagle's Medium (DMEM) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS). Se sembraron 3 × 10⁶ células/pocillo en placas T6 un día antes de la transfección. La transfección se hizo con el reactivo FuGene (Roche) según las instrucciones del fabricante. Se empleó 1 μg de plásmido reportero por pocillo. Como control interno se cotransfectaron 50 ng del plásmido pSV40-Renilla (Promega), en el que el gen de la luciferasa de Renilla se encuentra bajo el control del promotor temprano de pSV40. La actividad luciferasa se midió a las 48 h tras la transfección. La preparación de los extractos celulares para la medición de la actividad luciferasa se hizo utilizando el kit Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega) de acuerdo con las indicaciones del fabricante. Los experimentos se realizaron por triplicado y al menos se emplearon 3 muestras diferentes de ácido desoxirribonucleico (ADN) para cada alelo.

Experimentos de retardo en gel

Los extractos nucleares se prepararon a partir de células HepG2 en semiconfluencia. La secuencia de los oligonucleótidos de doble cadena empleados para la realización del ensayo de retardación de la movilidad electroforética (EMSA) fueron: 5'-GGAACTGGAGCGAAAGTAAGATTTGCC-3' (directo) y 5'-GGCAAATCTTACTTTCGTCCAGTT-3' (reverso) para el alelo T; y 5'-GGACTGGAGCGAAAGTGAGATTTGCC-3' (directo) y 5'GGCAAATCTCACTTTCGTCCAGTT-3' (reverso) para el alelo C. La preparación de los extractos nucleares, el marcaje de los oligos y las condiciones de electroforesis se realizaron según el protocolo descrito en Mozas et al¹⁷. Se añadieron 2 μg de anticuerpo anti-NRF2 (sc-722; Santa Cruz Biotechnology) a la mezcla para la realización del superretardo. El protocolo detallado se describe en Ordovas et al¹⁸. Para competir de manera inespecífica, se emplearon oligonucleótidos del gen SLC30A8: 5'-GGCAGCCAGCTGGGACAG-3' (directo) y 5'-GGCTGTCCCAGCTGGCTG-3' (reverso).

Resultados y discusión

En trabajos previos realizados por el grupo de Prieur et al¹⁶, se mapeó el sitio de inicio de transcripción del gen ApoA5 y se describieron algunos elementos reguladores contenidos en él. El fragmento de 1379 pb que se ha clonado y utilizado en este trabajo, se extiende desde la posición − 1316 a + 63 desde el lugar de inicio de la transcripción, y contiene la mayoría de los elementos esenciales para la expresión de ApoA5 descritos hasta el momento.

Los resultados de los experimentos de transfección transitoria hechos con los plásmidos que contienen las 2 variantes alélicas del SNP − 1131 T>C, se muestran en la figura 1. Las células transfectadas con el plásmido reportero que porta el alelo T mostraron una ratio de actividad luciferasa mayor que las transfectadas con el plásmido correspondiente al alelo C (ratio = 1,83 ± 0,44; n = 5; p < 0,05), lo que implica que el alelo T es un promotor más potente.

Figura 1.

Efecto del single nucleotide polymorphism (SNP) – 1131 T>C en la actividad del promotor. El fragmento de 1379 pb que contiene el SNP se clonó en posición 5' del gen luciferasa del plásmido pGL3. La actividad luciferasa se midió en células HepG2. Los experimentos se realizaron 5 veces a partir de diferentes muestras de ácido desoxirribonucleico. Los resultados se expresan en unidades relativas de luciferasa (URL).

En otro trabajo del año 2003, se demuestra que los valores de ácido ribonucleico mensajero (ARNm) de ApoA5 se correlacionan con los valores transcripcionales de los FT receptor alfa del activador-proliferador del peroxisoma (PPARα) y HNF4α¹⁹. Estas proteínas actúan por unión a elementos DR-1 que constituyen los denominados elementos de respuesta a PPAR (PPRE). Actualmente, se sabe que la regulación llevada a cabo a través de estos elementos es compleja. De hecho, estos elementos pueden integrar diferentes acciones inducidas por receptores nucleares, como RXR, RAR, HNF4 o COUP, dependiendo de la secuencia del elemento regulador y el contexto en el que se halle el promotor. Ya se había descrito la implicación de PPARα en el incremento de expresión del gen ApoA5 en células hepáticas independientemente de la presencia de este SNP²⁰, así que para ver si había diferencias en la regulación de la expresión del gen ApoA5 entre los 2 alelos de este polimorfismo en presencia de alguno de estos FT, se cotransfectaron en células HepG2 ambas variantes del promotor de ApoA5 con plásmidos de expresión que contenían los FT HNF4α, y PPARγ. Como puede verse en la figura 2, las células cotransfectadas transitoriamente con el FT PPARγ y RXR, necesario para su unión al ADN, muestran un incremento de inducción de actividad promotora en ambas variantes, tanto en presencia como en ausencia de ciglitazona 3 μM (ciglitazona [CG]), un agonista específico de isoforma de PPARγ (ratio ApoA5 T/ApoA5 C + PPARγ/RXR: 2,8 ± 0,6; n=3, p > 0,05, mientras que la ratio ApoA5 T/ApoA5 C + PPARγ/RXR 3 μM CG: 2,9 ± 0,27, p < 0,05), pero en ninguno de los 2 casos se observaron diferencias de activación entre ambos alelos en presencia de estas proteínas reguladoras respecto a lo observado en células control, lo que nos indica que son otros factores los que están implicados en la expresión diferencial de este promotor observada entre ambos alelos. También se testó la influencia de HNF4α, pero en este caso no se observó incremento de la actividad luciferasa con ninguno de los promotores cuando se cotransfectó esta proteína (datos no mostrados).

Figura 2.

Efecto del factor de transcripción receptor gamma del activador-proliferador del peroxisoma (PPARγ) sobre la expresión de los alelos del single nucleotide polymorphism (SNP) -1131 T>C. Se observa en esta figura el incremento de expresión de ambos promotores en presencia de PPARγ y receptores retinoides X (RXR, del inglés retinoid X receptor) tanto en ausencia como en presencia del agonista específico de PPARγ, la ciglitazona (CG) a una concentración 3 μM. El aumento de actividad luciferasa observado es similar con ambos alelos.

El que el cambio de un solo nucleótido en una región reguladora resulte en diferencias en la expresión de un gen, podría explicarse por un cambio en la unión de las proteínas reguladoras de la transcripción a esa secuencia de ADN. Para comprobar si el SNP − 1131 T>C alteraba la afinidad de algún factor de transcripción por el ADN, se realizó un EMSA con oligonucleótidos específicos de cada alelo, los cuales se describen en el apartado de materiales y métodos. El EMSA que se muestra en la figura 3 es representativo de 7 experimentos realizados, y en todos ellos se obtuvo el mismo resultado. El EMSA realizado con el fragmento que porta el alelo T mostró 3 bandas retardadas. Esta unión se revirtió totalmente cuando se compitió con un exceso de cien veces de sonda fría. La formación de estos complejos proteína-ADN desaparecen cuando el análisis se realiza con los oligonucleótidos correspondientes al alelo C. Estos resultados son consistentes con la hipótesis de que este SNP produce la disminución de la activación del promotor debido a que altera la afinidad de unión entre complejos proteicos y el ADN.

Figura 3.

Las variantes − 1131 T>C afectan a la unión proteínaácido desoxirribonucleico. Los oligonucleótidos que portan los alelos del SNP − 1131 T>C y el protocolo del experimento de retardo en gel (análisis de retardación de la movilidad electroforética [EMSA]) se indican en Material y métodos. En el primer carril del EMSA para cada alelo no se incluyó extracto nuclear, mientras que en los otros 2 carriles se incubó la mezcla de reacción con 15 μg de extracto nuclear procedente de células HepG2. En el tercer carril se añadió a la mezcla de reacción un exceso 100x de sonda fría para competir el análisis.

Con el objeto de identificar qué factor de transcripción podría estar implicado en este cambio, se analizó la secuencia circundante a este SNP con 2 programas informáticos: Matinspector²¹ y MAPPER²². Ambas herramientas bioinformáticas indicaron que este cambio de base podría alterar la unión de NRF2, entre otros factores, a la secuencia de ADN. Esta posibilidad se confirmó tras realizar un super-retardo con el anticuerpo α-NRF2. En presencia de este anticuerpo, la intensidad de las bandas retardadas disminuyó de manera significativa, lo que indicaba que el factor de transcripción NRF2 podría estar formando parte de los complejos proteína-ADN (fig. 4) vistos en el retardo que se muestra en la figura 3. NRF2 es un factor de transcripción que controla la expresión de varios genes relacionados con la biogénesis y función mitocondrial en relación con los valores energéticos de la célula^23,24. La posibilidad de que hay una expresión coordinada del gen ApoA5 en función del estado energético de la célula podría ser una hipótesis interesante para realizar futuros estudios en este sentido.

Figura 4.

La proteína NRF2 forma parte de los complejos proteína-ácido desoxirribonucleico. Se empleó un anticuerpo específico para NRF2 en la reacción (calles 4 y 8 desde la izquierda). Un exceso de oligonucleótido frío 20x no específico se utilizó como control extra de la especificidad de las bandas retardadas (las 2 calles de la derecha). Se utilizaron 20 μg de extracto proteico para el realizar el análisis.

El efecto transcripcional del SNP − 1131 T>C ha sido objeto de cierta controversia. En una publicación inicial de Talmud et al²⁵ se indicaba que no había diferencias de expresión entre ambos alelos. Sin embargo, cuando este manuscrito estaba en preparación, un artículo del mismo grupo mostraba que el cambio por sí mismo o en combinación con otros SNP podría alterar la potencia del promotor²⁶. Nuestros resultados apoyan esta evidencia. El cambio − 1131 T>C del promotor de ApoA5 resultó en una menor actividad del promotor. Si el alelo C tuviese el mismo efecto in vivo debería esperarse una cantidad menor de ApoA5 en portadores de esta variante. Esto está de acuerdo con los resultados obtenidos en el estudio realizado con la cohorte de EPIC-Norfolk, en los que se demostró una asociación entre el alelo C y menores valores de ApoA5¹⁵, y encajaría con un modelo en el cual el aumento de los valores de TG y/o riesgo cardiovascular serían resultado de la disminución de la expresión del gen ApoA5.

Al contrario de lo que ocurre con las variantes genéticas de regiones codificantes, las mutaciones en regiones reguladoras tienen efectos más suaves en el fenotipo. De acuerdo con esto, su efecto podría observarse sólo en condiciones ambientales determinadas. Es más, los SNP reguladores son muy frecuentes; según estudios recientes se estima que aproximadamente un tercio de los SNP que se localizan en regiones reguladoras tendrían alguna consecuencia funcional en la regulación de la expresión genética^27,28. En resumen, las regiones reguladoras constituyen dianas obvias para la búsqueda de mutaciones involucradas en la aparición de enfermedades complejas, como la hiperlipemia.