La hipercolesterolemia familiar (HF) es una enfermedad hereditaria, relativamente frecuente y asociada al desarrollo de ateroesclerosis y enfermedad coronaria prematuras. En este trabajo, describimos el hallazgo de una nueva mutación (−47C>A) en la región promotora del gen del receptor de las lipoproteínas de baja densidad (rLDL), principal encargado de este fenotipo. Esta mutación se identificó en una familia uruguaya con un fenotipo típico de HF, en la cual aparecen individuos heterocigotos y homocigotos para la mutación debido a la existencia de consanguinidad. El cambio nucleotídico ocurre en un sitio conservado y funcionalmente relevante del promotor; región en la que anteriormente se han descrito diversas mutaciones que provocan descensos drásticos en la actividad transcripcional del gen. No se han detectado otras variantes en las regiones analizadas del gen.
Los análisis genéticos del rLDL asociados a otros genes de susceptibilidad permiten establecer un perfil genómico de riesgo cardiovascular, de aplicación muy necesaria en el tratamiento clínico de familias con HF.
Familial hypercholesterolemia (FH) is an inherited disease, relatively frequent and associated with premature development of atherosclerosis and coronary heart disease. We report a family with several members affected by FH whose phenotype was presumably caused by a substitution of a cytosine by adenine in the promoter region (−47C>A) of the LDL receptor gene (LDLR). This mutation was identified in an Uruguayan family with a typical phenotype of HF in which there are hetero and homozygous individuals for the mutation, due to inbreeding. This mutation, witch has not previously been described, is located on a conserved and functionally relevant domain of the promoter. In this region several mutations have been previously described and it has been demonstrated that they cause drastic decrease in LDLR gene transcriptional activity. No other sequence variants have been detected in the sequenced LDLR gene regions.
A molecular analysis of LDLR gene together with other susceptibility genes allows establishing a genomic profile of cardiovascular risk, highly applicable in the clinical management of families with FH.
La hipercolesterolemia familiar (HF) (OMIM #143890) es una enfermedad hereditaria, autosómica, generalmente con una presentación dominante, asociada al desarrollo de ateroesclerosis y enfermedad coronaria. La frecuencia estimada es de 1:500 en la forma heterocigota, mientras que en su presentación homocigota la frecuencia desciende a valores de 1:1.000.000. Los pacientes con HF suelen presentar valores de colesterol total (CT) y colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad (cLDL) muy elevados, así como xantomas tendinosos y/o arco corneal como manifestación del depósito tisular de colesterol1.
En más del 80% de los casos, la causa genética de la HF se encuentra principalmente en mutaciones del gen del receptor de las lipoproteínas de baja densidad (rLDL) ubicado en el cromosoma 19 y hasta la fecha se ha informado de más de 900 mutaciones patogénicas2. Otros loci, como el de la apolipoproteína (Apo) B100 (mutación R3500)3 y el de PCSK94 también se han correlacionado con la etiopatogenia de la HF dominante.
El estudio concomitante de los datos clínicos, bioquímicos y moleculares, realizado en una población de 57 pacientes, nos permitió encontrar en una familia con HF una mutación aún no descrita en la región regulatoria (promotor) del gen del rLDL. En esta familia, donde aparece consanguinidad, hallamos individuos que presentan la mutación en forma homocigota y otros en forma heterocigota, con claras diferencias en los valores séricos de colesterol total y cLDL.
Pacientes y métodosEstudiamos a los integrantes de una familia con antecedentes de dislipemia grave con valores de colesterol muy elevados y episodios cardiovasculares tempranos estudiados previamente por Alallón et al5. Luego de establecer el diagnóstico de HF en el paciente índice y tras obtener el consentimiento escrito, se le realizó un estudio genético. A partir del ácido desoxirribonucleico (ADN) extraído de sangre periférica se realizó la amplificación por PCR de los 18 exones y la región promotora del gen del rLDL. Las condiciones y primers utilizados fueron los descritos por Hobbs et al6. Después, los productos amplificados se secuenciaron de forma automática en un equipo ABI PRIS 377 (Perkin Elmer) con los mismos oligonucleótidos utilizados para la amplificación.
Una vez que se encontró la mutación en la región promotora del gen del rLDL en el paciente índice, se secuenció esta región a partir de los productos amplificados por PCR de los ADN de los familiares que participaron en este estudio.
También se analizó a los pacientes para la determinación de la mutación ApoB R3500Q7 y para los polimorfismos Cys112Arg y Arg158Cys del gen de la ApoE por análisis de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP)8.
Todos los integrantes de la familia dieron su consentimiento informado por escrito y el Comité de Ética de la Comisión Honoraria para la Salud Cardiovascular aprobó el estudio.
ResultadosCaso clínicoSe analizó a una familia detectada a partir del caso índice JSC de sexo masculino de 55 años de edad, referido para su evaluación a la policlínica de genética, debido a una dislipemia grave, diagnosticada a los 31 años, con cifras máximas de CT de 714mg/dl (tabla 1). El paciente es hipertenso leve, ex fumador, presentó desarrollo progresivo de xantomas en codo y dorso de mano, xantelasmas y halo corneano. A los 30 años tuvo un infarto agudo de miocardio (IAM). A los 42 años se demuestra por coronariografía una lesión de 3 vasos (lesión suboclusiva en descendente anterior, múltiples lesiones suboclusivas en circunfleja y ectasia del tronco coronario derecho), por lo que se le realizaron 2 bypass. A los 52 años, ante la reaparición de la sintomatología, se le realiza una nueva coronariografía que muestra: lesión moderada de tronco de coronaria izquierda; lesión proximal de circunfleja; segundo ramo marginal ocluido en tercio medio; descendente anterior ectásica con lesión grave en tercio proximal; ramo diagonal ectásico que se ocluye en tercio medio; coronaria derecha ectásica con irregularidades difusas de la pared con lesión moderada en tercio proximal; puente venoso aorta-descendente posterior ocluido. El ecocardiograma mostró hipertrofia del ventrículo izquierdo, disfunción diastólica, doble lesión de válvula aórtica calcificada con estenosis moderada e insuficiencia leve.
Datos fenotípicos de los individuos analizados en el ámbito molecular. Se muestran las características de los 12 individuos analizados
| N.º en general | Sexo | Edad | Estado rLDL | CT (mg/dl) | cLDL (mg/dl) | cHDL (mg/dl) | TG (mg/dl) | ApoE | Signosa | CVb |
| I | M | 83 | Heterocigoto | 327 | 257 | 32 | 161 | E3/E3 | + | - |
| II | M | 51 | Heterocigoto | 190 | SD | SD | 105 | E3/E3 | - | - |
| III | V | 55 | Homocigoto | 714 | 629 | 42 | 430 | E2/E3 | + | + |
| IV | M | 48 | Homocigoto | 482 | 430 | 20 | 148 | E3/E3 | + | + |
| V | V | 47 | Heterocigoto | 380 | SD | SD | SD | E3/E3 | + | + |
| VI | M | 45 | Homocigoto | 646 | 570 | 50 | 130 | E3/E3 | + | - |
| VII | V | 25 | Heterocigoto | 292 | SD | SD | SD | E3/E3 | - | - |
| VIII | M | 26 | Heterocigoto | 200 | SD | SD | SD | E3/E3 | - | - |
| IX | V | 23 | Heterocigoto | 360 | SD | SD | SD | E3/E4 | - | - |
| X | M | 16 | Heterocigoto | 320 | SD | SD | SD | E3/E3 | - | - |
| XI | M | 22 | Heterocigoto | 246 | SD | SD | SD | E3/E3 | - | - |
| XII | V | 5 | Normal | 158 | SD | SD | SD | E3/E3 | - | - |
ApoE: apolipoproteína E; cHDL: colesterol unido a lipoproteínas de alta densidad; cLDL: colesterol unido a lipoproteínas de baja densidad; CT: colesterol total; CV: cardiovascular; M: mujer; rLDL: receptor de las lipoproteínas de baja densidad; SD: sin datos TG: triglicéridos; V: varón.
Los valores de perfil lipídico mostrados son sin medicación hipolipemiante.
De la historia familiar destaca (fig. 1): el caso índice es hijo de un matrimonio consanguíneo (los padres son primos hermanos). La madre (83) presenta dislipemia e hipertensión, estenosis aórtica grave, sin elementos de isquemia miocárdica. El padre falleció por cáncer vesical a los 83 años, se desconocen otros datos. Tenía un hermano gemelo monocigótico que falleció a los 38 años por IAM; otro hermano varón falleció a los 29 años por muerte súbita cardiovascular, así como 2 hermanas dislipémicas: una con cifras de CT > 400mg/dl y otra hermana (45) dislipémica (con cifras de CT su periores a 600mg/dl) y a la que se ha revascularizado mediante bypass. Hijo (27) con CT > 300mg/dl, así como varios sobrinos; 2 hijos fallecidos por enfermedad neoplásica.
genealogía de la familia analizada. El paciente índice (paciente III) está indicado por una flecha. Los miembros de la familia homocigotos para la mutación –47C>A son marcados con símbolos llenos, los heterocigotos con símbolos semillenos. Los individuos marcados con un punto son casos con presumible hipercolesterolemia familiar (por cifras de colesterol total o antecedentes de enfermedad arteriosclerótica temprana), pero en los que no se tiene confirmación en el ámbito molecular. Los números romanos debajo de algunos individuos remiten a la tabla 1. Los números a la derecha del símbolo corresponden a la edad.
El diagnóstico positivo de HF se basó en valores elevados de CT con predominio de cLDL, antecedentes de enfermedad arteriosclerótica prematura y un patrón de herencia compatible con transmisión dominante. Por otra parte, el análisis genealógico explica el hallazgo de individuos con una expresión más grave en la generación IV (fig. 1), con posibles portadores de una mutación en homocigosis.
Análisis molecularesSe analizó el ADN genómico de los integrantes de la familia estudiada en busca de mutaciones en el gen del rLDL. Se constató que el paciente índice presentaba, en la secuencia de ADN correspondiente al promotor proximal, una transversión C>A en la posición –47, en estado homocigota, al igual que 2 de sus hermanas, mientras que los hijos con diagnóstico clínico de HF eran heterocigotos para esta mutación (fig. 2). En las regiones analizadas del gen, no se detectaron otras variantes en la secuencia.
Esta mutación puede confirmarse mediante análisis de restricción de los productos amplificados por PCR: la presencia de una A en posición –47 destruye el sitio de restricción de la enzima MnlI. De esta forma, es posible realizar un diagnóstico más rápido de otros integrantes de la familia.
En relación con el polimorfismo analizado de la ApoE, el probando era E2/E3, uno sobrino era E3/E4 y los demás integrantes eran E3/E3.
El probando y los miembros de su familia eran homocigotos para el alelo normal de ApoB-100 en el codón 3500.
DiscusiónHemos identificado una mutación puntal –47C>A ubicada en la región promotora proximal de 245 pb del gen del receptor de LDL, en una familia con diagnóstico clínico de HF. El paciente índice y 2 de sus hermanos son homocigotos para esta mutación.
La mutación –47C>A se ubica en el promotor del rLDL en el sitio de unión proximal del factor de transcripción Sp1 (repetido R3), funcionalmente relevante para lograr la transactivación del gen del rLDL por esteroles9. El R3 es el miembro más proximal de una tríada de repetidos imperfectos y contiene 9/10 pb que emparejan con la secuencia consenso GC. La mutación –47C>A aquí descrita modifica la secuencia de R3 y la diferencia del consenso GC (fig. 3). Se ha informado acerca de varias mutaciones en el repetido R3 que producen también un fenotipo de HF y reducen marcadamente la actividad del promotor hasta un 5-15% del valor normal2,10,11. Adicionalmente, estudios de transfección mostraron que el reemplazo al azar en la región media de la secuencia del R3 conduce a una pérdida de actividad transcripcional12.
Secuencia nucleotídica de los elementos en cis del gen del receptor de las lipoproteínas de baja densidad que regulan la transcripción basal y mediada por colesterol. Estos elementos se disponen en 3 repetidos directos imperfectos de 16 pb ricos en GC. La mutación –47C>A aquí descrita se indica subrayada y en negrita.
Si bien no contamos con estudios in vitro que demuestren una disminución de la actividad transcripcional como consecuencia de la mutación –47C>A, consideramos que ésta es la causa del fenotipo HF encontrado en esta familia, debido a que: a) esta mutación no se encontró en otros pacientes con fenotipo de HF, ni en individuos sanos del Uruguay; b) la misma se da en un sitio conservado y funcionalmente relevante para la regulación de la transcripción del gen, como demuestra el análisis de otras mutaciones vecinas; c) se aprecia un efecto claro de dosis génica, ya que el fenotipo de los portadores heterocigotos de la mutación es más leve que el de los homocigotos (valores promedio de CT de 289 frente a 615mg/dl). Los pacientes homocigotos, además, tienen antecedentes de enfermedad cardiovascular arteriosclerótica prematura y valores de colesterol que en algunos casos exceden los 700mg/dl.
Suponemos que la mutación analizada no causa una disminución tan drástica de la actividad transcripcional como otras descritas, ya que: a) los valores de CT en homocigotos, si bien marcadamente elevados, no exceden los 714mg/dl; b) 2 individuos heterocigotos de sexo femenino de 51 y 26 años tienen valores de CT dentro del rango normal, y c) la expresividad clínica cardiovascular, si bien temprana y grave en relación con la población general, no es tan grave como la descrita en otros casos de HF homocigota.
Otro polimorfismo analizado fue el de la ApoE, reconocido factor modificador del riesgo cardiovascular y de dislipemias13. Si bien la mayoría de los pacientes son E3/E3, el probando, el cual ha tenido la expresión fenotípica más grave e hipertrigliceridemia, es E2/E3. Algunos estudios muestran que los pacientes con HF portadores del alelo E2 muestran un fenotipo dislipémico con más aumento de CT e hipertrigliceridemia y un riesgo mayor de afectación arteriosclerótica14.
En conclusión, en el marco de un programa sistemático para identificar mutaciones que causan HF en el Uruguay, encontramos una mutación puntual, no descrita previamente, en la región promotora del gen del rLDL. En esta familia, el diagnóstico molecular explica los fenotipos encontrados y permite identificar individuos que portan la mutación y, por lo tanto, tienen riesgo de desarrollar dislipemias graves y enfermedad cardiovascular. Esta información resulta de utilidad para la prevención, sobre todo en pacientes que aún no presentan signos de la enfermedad y que de otro modo podrían considerarse de forma errónea como de riesgo cardiovascular bajo.