Novel protocol for the transcriptomic analysis of endothelial extracellular vesicles in atherosclerosis

Abstract

Introduction

Despite the key role of the endothelium in atherosclerosis, there are no direct techniques for its analysis. The study of extracellular vesicles of endothelial origin (EEVs), might lead to the identification of molecular signatures and early biomarkers of atherosclerosis. The aim of this work was to set up the methods for EEVs separation and transcriptomic analysis.

Methods

We adapted an antibody-magnetic-bead based immunocapture protocol for plasma EEVs separation from control (G1), subclinical atherosclerosis (G2) and peripheral artery disease subjects (PAD) (G3), and modified an ultra-low input RNASeq method (n = 5/group). By bioinformatics analysis we compared the transcriptome of plasma EEVs with that of human aortic endothelial cells (TeloHAECs), and then, searched for differentially expressed genes (DEG) among EEVs of G1, G2 and G3. From those DEG, UCP2 was selected for further validation in plasma EVs (qPCR), and in vitro, in stimulated TeloHAECs (IL-1β, TNFα, oxLDL and hypoxia).

Results

The RNASeq analysis of plasma EEVs rendered 1667 genes enriched in transcripts expressed by TeloHAECs (NES: 1.93, p adjust = 1.4^e−73). One hundred seventy DEGs were identified between G2 vs G1, and 180 between G3 vs G1, of which 17 were similarly expressed in G2 and G3 vs control, including UCP2. IL-1β and TNFα (10 ng/mL, p < 0.05), hypoxia (1% O₂, p = 0.05) and oxLDL (100 μg/mL, p = 0.055) reduced UCP2 expression in TeloHAECs.

Conclusions

We set up a protocol for EEVs separation and sequencing that might be useful for the identification of early markers of endothelial dysfunction in atherosclerosis.

Resumen

Introducción

A pesar del papel clave del endotelio en la aterosclerosis, no existen técnicas directas para su análisis. El estudio de las vesículas extracelulares de origen endotelial (EEV) podría facilitar la identificación de firmas moleculares y biomarcadores tempranos de aterosclerosis. El objetivo de este trabajo fue establecer los métodos para la separación de EEV y su análisis transcriptómico.

Métodos

Adaptamos un protocolo de inmunocaptura con anticuerpos y microesferas magnéticas para la separación de las EEV del plasma de sujetos control (G1), con aterosclerosis subclínica (G2) y con enfermedad arterial periférica (G3), y modificamos un método de RNASeq para su análisis transcriptómico (n = 5/grupo). Comparamos el transcriptoma de las EEV plasmáticas con el de células endoteliales de aorta humana (TeloHAEC) e identificamos genes diferencialmente expresados (DEG) entre los grupos de pacientes, incluyendo UCP2, validado en EV plasmáticas (qPCR) e in vitro, en TeloHAECs tratadas con IL-1β, TNF-α, oxLDL e hipoxia.

Resultados

El RNASeq de las EEV plasmáticas detectó 1.667 genes enriquecidos en transcritos expresados por las TeloHAECs (NES: 1,93, ajuste p = 1,4^e−73). Se identificaron 170 DEG entre los grupos G2 vs. G1 y 180 entre G3 vs. G1, de los cuales 17 se expresaron de forma similar en G2 y G3 vs. control, incluyendo UCP2. El tratamiento con IL-1β y TNF-α (10 ng/ml, p < 0,05), hipoxia (1% O₂, p = 0,05) y oxLDL (100 μg/ml, p = 0,055) redujo la expresión de UCP2 en las TeloHAEC.

Conclusiones

Hemos puesto a punto un protocolo para la separación y la secuenciación de EEV que podría ser útil para la identificación de marcadores tempranos de disfunción endotelial en aterosclerosis.