Sujetos y Métodos: Hemos practicado un análisis molecular a 14 miembros de nuestras 4 familias afectadas de MEN 2 A mediante SSCP, digestión con enzimas de restricción y secuenciación de los fragmentos de ADN presuntamente mutados, previamente amplificados por PCR, y hemos relacionado los hallazgos genéticos con la presentación clínica y los tests bioquímicos.
Resultados: Hemos detectado 11 casos de MEN 2 A. Todos ellos presentan la mutación en el exón 11, codón 634: seis con TGC(634)CGC y cinco con TGC(634)TAC. Fenotípicamente los 11 son MEN 2 A (2). Los pacientes con la mutación TGC(634)TAC presentaban carcinoma medular de tiroides (CMT) en todos los casos, feocromocitoma en 2 casos e hiperparatiroidismo (HPT) en ningún caso. Aquellos con la mutación TGC(634)CGC tenían CMT en todos los casos, feocromocitoma en 4 casos y HPT en ninguno. El estudio genético permitió, además, el diagnóstico precoz de una paciente de 15 años de edad con test bioquímico no diagnóstico.
Conclusiones: Confirmamos la eficacia del análisis genético como método de estudio en el MEN 2 A. Por otra parte, dado que nuestros resultados difieren de los aportados en la bibliografía internacional pero coinciden con los de otras tres series españolas, sugerimos la existencia de diferencias poblacionales en la asociación genotipo-fenotipo en el MEN 2 A.
Subjects and methods: We have performed molecular analysis to 14 members of our four families with MEN 2 A using SSCP, digestion with restriction enzymes and sequencing of the DNA fragments probably mutated, previously amplified by PCR, and we have related the genetic findings with the clinic presentation and the biochemical test.
Results: We have detected 11 cases of MEN 2 A. All of them present the mutation in the exon 11, codon 634: Six with TGC(634)CGC mutation and 5 with TGC(634)TAC. All the patients have the phenotype MEN 2 A (2). The patients with TGC(634)TAC mutation, had medular thyroid carcinoma (MTC) in all cases, pheochromocytoma in 2 cases and nobody had hyperparathyroidism (HPT). The other patients with TGC(634)CGC mutation, had MTC in all cases, pheochromocytoma in 4 cases and HPT in none case.
Moreover, the genetic analysis allow us to do the early diagnosis of a young girl, 15 years old, with negative biochemical test.
Conclusions: We confirm the efficiency of genetic analysis as a method for study of MEN 2 A. Furthermore, since our results defer of the provided in the international literature but coincide with the data of other 3 spanish studies, we suggest the existence of populational differences in the association genotype-phenotype in MEN 2 A.
a neoplasia endocrina múltiple tipo 2 A (MEN 2 A) es una enfermedad hereditaria caracterizada por carcinoma medular de tiroides (CMT), feocromocitoma e hiperparatiroidismo (HPT). El patrón de herencia es autosómico dominante, con un grado de penetrancia elevado y expresión variable.
Tradicionalmente, a partir de un primer caso ("caso índice"), el estudio familiar para descubrir a otros miembros afectados de MEN 2 A se ha llevado a cabo mediante pruebas de estímulo para calcitonina con pentagastrina sola o pentagastrina más calcio, determinación de calcio y fósforo en plasma y analítica de orina de 24 h para catecolaminas y metanefrinas.
En 1993, Mulligan et al1 y Donis-Keller et al2 describieron, casi simultáneamente, la presencia de mutaciones germinales del protooncogén RET como responsables de MEN 2 A. Desde entonces el estudio genético ha venido a completar y a facilitar, para el médico, la evaluación de las familias con casos de MEN 2 A, ya que se ha comprobado su fiabilidad y una mayor eficacia para detectar portadores que las pruebas bioquímicas clásicas3.
En los últimos 2 años se han diferenciado tres categorías dentro del MEN 2 A según su fenotipo4: MEN 2 A (1): familias con CMT, feocromocitoma y HPT; MEN 2 A (2):
familias con CMT y feocromocitoma en al menos un miembro y sin HPT en los pacientes o familiares de riesgo, y MEN 2 A (3): familias con CMT y HPT en al menos un miembro y sin feocromocitoma en los pacientes o familiares de riesgo. Así mismo, se ha intentado establecer una relación fenotipo-genotipo que permitiera pronosticar el comportamiento clínico de una mutación determinada5,6.
Aportamos los resultados del estudio genético en todos los casos de MEN 2 A diagnosticados hasta el momento en Navarra (comunidad que cuenta con unos 550.000 habitantes) y su relación genotipo-fenotipo para contribuir con nuestros datos al mejor conocimiento de este novedoso enfoque (relación mutación-clínica) de la enfermedad.
SUJETOS Y MÉTODOS
Hemos practicado un estudio genético a 14 sujetos pertenecientes a 4 familias con MEN 2 A detectadas a partir de un caso índice. El número de miembros de cada familia susceptibles de estudio (el caso índice más los familiares de primer grado residentes en Navarra), el número de casos analizados genéticamente y los casos diagnosticados de MEN se exponen en la tabla 1. Las características de cada sujeto afectado se exponen en la tabla 2. No se analizaron aquellos familiares de primer grado vivos que residían en otras comunidades autónomas o no aceptaron participar en el estudio.
Todos los pacientes analizados o, en el caso de los niños, sus padres, dieron su consentimiento, una vez informados de las características del estudio, para participar en éste.
El estudio bioquímico comprendía: calcio y fósforo en sangre, calcitonina tras pentagastrina más calcio y catecolaminas y metanefrinas en orina de 24 h. Los resultados de los sujetos analizados se comparaban con los estándar de nuestro laboratorio y el test de calcitonina tras pentagastrina más calcio se consideraba positivo cuando el pico era superior a 150 pg/ml (medida por RIA, Nichols Institute).
Para el análisis molecular, se obtuvo ADN genómico de sangre periférica (20 ml en EDTA). La amplificación de los exones 10, 11, 13 y 16 del protooncogén RET se realizó por medio de cebadores específicos de acuerdo con protocolos previamente descritos7. Las mutaciones puntuales del RET fueron detectadas por PCR, polimorfismo conformacional de cadena simple de ADN (PCR-SSCP) y análisis de restricción. El SSCP fue realizado en un gel con un 6% de poliacrilamida bajo dos diferentes condiciones con subsiguiente tinción de plata. Los productos de PCR fueron desnaturalizados por el calor en un tampón que contenía formamida, enfriados en hielo y trasladados a un gel de poliacrilamida no desnaturalizante. Los fragmentos de ADN de cadena simple se separaron según su estructura secundaria. Las mutaciones puntuales conducen a cambios en dicha estructura secundaria y las secuencias mutadas son detectables por su migración aberrante en la electroforesis en gel.
El análisis de restricción con Cfo I, Rsa I y Fok I (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, EE.UU.) se evaluó por electroforesis en un gel con un 9% de poliacrilamida y se visualizó por tinción con bromuro de etidio.
El ADN correspondiente a los patrones anormales de SSCP fue reamplificado con los mismos primers, purificado con el equipo QIA quick PCR purification (Quiagen, EE.UU.) y sujeto a secuenciación directa usando el equipo ABI PRISMO dye terminator cycle (Perkin-Elmer Corp., EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, para identificar la base mutada.
Los pacientes y sus familiares procedían de las consultas externas de la Sección de Endocrinología del Hospital de Navarra y habían sido atendidos entre 1987 y 1998. Las piezas quirúrgicas fueron analizadas en el Servicio de Patología del Hospital Virgen del Camino y el análisis molecular se llevó a cabo en el Departamento de Patología del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau de Barcelona entre 1994 y 1997.
RESULTADOS
Con el análisis molecular hemos hallado mutaciones en el protooncogén RET en 11 pacientes. Todos ellos presentaban la mutación en el exón 11, codón 634. Seis pacientes presentaban el triplete CGC (que codifica para la arginina) y los otros seis el triplete TAC (que codifica para la tirosina) en lugar del normal TGC (que codifica para la cisteína del dominio extracelular rico en este aminoácido) (fig. 1 y tabla 2). Los que tenían el codón TAC TGC(634)TAC estaban afectados de CMT en los 5 casos (100%), de feocromocitoma en 2 casos (40%) y de HPT en ningún caso. Los que tenían el codón CGC TGC(634)CGC presentaban CMT en los 6 casos (100%), feocromocitoma en 4 casos (66%) e HPT en ningún caso (tabla 2).
El estudio genético permitió el diagnóstico precoz de una paciente de 15 años de edad, con test bioquímico (pentagastrina más calcio) no diagnóstico. Fue intervenida, detectándose un CMT de 2 mm de diámetro. Actualmente está libre de enfermedad según sus concentraciones de calcitonina basal y tras estímulo.
Con estos datos, tenemos registrados en Navarra 11 casos de MEN 2 A, todos pertenecientes a familias con fenotipo MEN 2 A (2). La distribución por familias se expone en la tabla 1.
DISCUSIÓN
En este estudio aportamos los datos del análisis de genética molecular en las 4 familias afectadas de MEN 2 A en Navarra. Todos nuestros casos corresponden a mutaciones en el exón 11, codón 634. Esto no es de extrañar puesto que es el codón más frecuentemente mutado en esta enfermedad (en el 80-90% de los casos)8. La sustitución de aminoácidos más habitual en la bibliografía9 es Cys-634-Arg. También es así en nuestros pacientes, aunque aquí las mutaciones Cys-634-Arg y Cys-634-Tyr se repartían de forma similar (el 54,5 y el 45,5%, respectivamente).
En cuanto a la relación genotipo-fenotipo, se ha publicado que las mutaciones en el codón 634 se asocian más frecuentemente al fenotipo MEN 2 A (1)6,9. En nuestra serie, por contra, las 4 familias con el codón 634 mutado presentaban un fenotipo MEN 2 A (2), es decir, no había HPT en ningún caso. Nuestros datos coinciden con los de una reciente publicación10 que agrupa a 9 familias pertenecientes a distintas regiones de España; seis de ellas con la mutación TGC(634)TAC, idéntica a cinco de nuestros casos, tenían también el fenotipo MEN 2 A (2) y la otra mutación del codón 634: TGC(634)TGG se asociaba a CMT familiar (sin feocromocitoma ni HPT). En ningún caso sus familias con mutación en el codón 634 tenían fenotipo MEN 2 A (1).
También en otra publicación anterior11 del Hospital Clínic en colaboración con el Hospital Vall d'Hebron, ambos de Barcelona, se describían 6 familias con mutación en el codón 634: cinco con TGC(634)TAC y una con TGC(634)CGC; tampoco ninguna de ellas tenía HPT. Recientemente12 se han presentado otras 9 familias con mutación en el codón 634. Todas ellas presentaban MEN 2 A (2) excepto una con C634W que era MEN 2 A (3), lo que supone 26 familias españolas descritas en la bibliografía, con mutación en el codón 634, sólo una de las cuales tiene hiperparatiroidismo.
La baja prevalencia de HPT en el MEN 2 A se ha explicado de diversas formas: a) dado que la penetrancia del HPT va aumentando con la edad12, una serie con individuos jóvenes ofrecería un menor número de casos. Siete de nuestros 11 pacientes son menores de 30 años, edad en que la penetrancia es del 14%13; no obstante, esta cifra sigue siendo muy superior a la hallada en las mencionadas series españolas10-12; b) existe la posibilidad de que la tiroidectomía total se acompañe de la extirpación de algunas glándulas paratiroides, lo que modificaría el curso de la enfermedad paratiroidea14, pero sería excepcional que esto sucediera en todos los casos, y c) ya que pacientes de la misma familia o de distintas familias con la misma mutación presentan distintos fenotipos, es probable que la función del RET pueda modificarse por otros factores genéticos o ambientales, dando lugar a diferencias individuales y poblacionales. En este sentido, Karga et al14 aluden a la abundancia de sol en Grecia y al aumento consecuente de vitamina D (inhibidor del gen de transcripción de la PTH)15, para explicar la baja frecuencia de HPT en su serie de 12 familias (8%). Por otra parte, según Eng et al4, en el MEN 2 A serían necesarias otras alteraciones genéticas somáticas en las glándulas afectadas, además de la mutación RET, para que se formaran los distintos tumores.
El Consorcio Internacional para el Análisis de Mutaciones en el RET8 también ha descrito una mayor asociación con feocromocitoma si la mutación es TGC(634)CGC que si es TGC(634)TAC. Este aspecto sí se cumple en nuestras familias ya que encontramos 4 pacientes con feocromocitoma de seis con la primera mutación (66%) frente a 2 de 5 pacientes (40%) con la segunda.
Por último, hemos podido confirmar la eficacia del análisis genético como método de detección familiar de miembros portadores, ya que hemos operado y detectado la presencia de un microcarcinoma medular en una paciente cuya respuesta al test de pentagastrina más calcio presentaba resultados no diagnósticos.
En resumen, aportamos los resultados del estudio genético realizado a las 4 familias afectadas de MEN 2 A registradas en Navarra. Las mutaciones halladas se ajustan a las esperables según los datos de la bibliografía, pero la relación genotipo-fenotipo difiere de lo publicado en el ámbito internacional y, sin embargo, coincide con los resultados de otras regiones españolas. Sin duda son necesarias más series y más amplias para extraer conclusiones fidedignas en cuanto a la relación genotipo-fenotipo en el MEN 2 A y para conocer si existen realmente diferencias poblacionales.
