La diabetes mellitus es una enfermedad endocrina metabólica crónica, cuyo principal problema cardiovascular es la afectación vascular coronaria y periférica, que constituye una de las principales causas de morbimortalidad en estos enfermos. La temprana disfunción endotelial que se produce en el enfermo constituye uno de los factores de riesgo para el desarrollo de la vasculopatía difusa y grave que caracteriza a esta enfermedad.
El efecto crónico de la diabetes produce alteraciones graves en la capa endotelial de los vasos sanguíneos. Las células endoteliales tienen un papel importante en la regulación del tono vascular mediante la producción de factores relajantes derivados del endotelio (EDRF)1,2. Sin embargo, se ha comprobado que existe un deterioro de la relajación dependiente del endotelio tanto en diabetes experimental3-6 como en pacientes con diabetes de tipos 1 y 27.
Algunos autores han demostrado la importancia del tratamiento sustitutivo con insulina para prevenir esta disfunción endotelial, sobre todo en estadios tempranos de la enfermedad8. Por otro lado, el trasplante de islotes pancreáticos se está realizando de forma experimental como posible tratamiento definitivo de la enfermedad en un futuro no muy lejano. Una de las líneas de investigación sobre este tema pretende averiguar si esta intervención también revertiría el daño endotelial y enlentecería la progresión de la aterogénesis en estos pacientes. En este sentido, en el presente estudio nos planteamos investigar si, mediante la terapia quirúrgica de trasplante de islotes pancreáticos singénicos, es posible revertir la disfunción endotelial provocada por la diabetes, y modificar con ello la historia natural de la vasculopatía asociada a la enfermedad.
MATERIAL Y MÉTODOS
Material
Como modelo experimental se ha utilizado la rata Wistar con un peso medio de 403,25 ± 76,3 g, en un número de 8 en cada grupo. El estudio se llevó a cabo según las normas que rige el Convenio Europeo para la protección de los animales utilizados con fines experimentales, recibiendo protección en todos sus extremos, según el Real Decreto 223/1.988, BOE. 18 y la Orden del 13 de octubre de 1989.
Diseño experimental
El modelo experimental de diabetes mellitus se consiguió mediante la inyección intravenosa de 45 mg/kg de estreptozotocina en la cola de la rata. A las 24 h del procedimiento, y de forma regular a lo largo del estudio, se confirmó la existencia de diabetes mediante la medición de las concentraciones de glucosa.
Los animales se dividieron de forma aleatorizada en tres grupos de 8 animales cada uno y se estudiaron a las 16 y 18 semanas: a) grupo control; b) grupo de ratas con diabetes de 16 semanas, y c) grupo de ratas con diabetes de 16 semanas, trasplantadas y estudiadas 2 semanas después del trasplante.
El trasplante se realizó mediante inyección intraportal de islotes pancreáticos frescos de ratas donantes singénicas (1.200-1.500 islotes/receptor). En las ratas donantes, para la extracción de los islotes, se canuló el conducto pancreático y éstos se aislaron por digestión con colagenasa y centrifugación con gradiente de Ficoll.
En el grupo de ratas diabéticas trasplantadas se normalizaron las concentraciones de glucemia a las pocas horas del trasplante, y la euglucemia se mantuvo durante las 2 semanas del estudio.
Análisis de la función vascular y protocolo farmacológico
Una vez sacrificados los animales, un fragmento de aproximadamente 2 a 2,5 cm de longitud y 3 a 4 mm de diámetro de la aorta torácica descendente fue cuidadosamente disecado y sumergido en una placa de Petri con solución salina de Krebs modificada de composición (en mM), de NaCl, 120; KCl, 3; MgSO4, 1,2; KH2PO4, 1,2; CaCl2, 2,5; NaHCO3, 28; glucosa, 5, y gaseada con carbógeno (95% O2 + 5% CO2) hasta conseguir una solución con un pH de 7,36-7,40. En este medio, la aorta torácica fue liberada de todo el tejido adiposo y conectivo circundante, cortada en anillos de 4 a 5 mm de longitud (un total de 4 anillos por segmento disecado) utilizando una lupa quirúrgica y montada en una cámara de órganos compacta de cuatro copas vasculares (QOB Cibertec, S.A., Madrid, España). Los anillos se suspendieron en las copas vasculares a través de su luz vascular con dos alambres de tungsteno (uno fijo y otro libre conectado a un transductor de fuerza isométrica), con cuidado de no manipular la superficie interna de la capa endotelial para su ensayo de función vascular, que contenía la misma solución salina, gaseada y a una temperatura constante de 37 °C. Los anillos aórticos se mantuvieron durante un tiempo de estabilización de 60 min a una tensión basal de 2,0 g realizando un recambio de la solución de Krebs de las copas cada 15 min. La tensión basal se determinó como la tensión óptima a la que se obtenía la mejor contracción submáxima en nuestro laboratorio de función vascular. Los cambios en la tensión isométrica se monitorizaron y recogieron mediante conexión a transductores de fuerza isométrica modelo Piodem UF-1, a través de una tarjeta de adquisición y conversión de datos analógico/digital y un amplificador de señales PRE-206, Cibertec, S.A., para registrar los valores mediante el programa REG * PC3 en un PC con la posibilidad de posteriormente exportar los resultados a la hoja de cálculos Excel. Los cambios de la fuerza isométrica se midieron en gramos.
Después del tiempo de estabilización, cada anillo fue precontraído con 105 M de fenilefrina y, una vez alcanzada la meseta de contracción máxima, se provocó la relajación con acetilcolina (105 M) para confirmar la integridad de las células endoteliales. Posteriormente se añadió un vasodilatador independiente de endotelio nitroprusiato (104 M).
L-Phenylephrine Hydrochloride (P-6126), Acetylcholine Chloride Crystalline (A-6625) y Sodium Nitroprusside Dihydrate (S-0501) fueron suministrados por Sigma (Alcobendas. M. España).
Estadística
Todos los datos se expresan como la media ± desviación estándar. Los cálculos de la vasodilatación a acetilcolina se realizaron como el porcentaje respecto a la tensión máxima alcanzada en la precontracción inicial. Los datos se analizaron mediante el paquete estadístico SPSS 8.0 utilizando el test para comparación de medias independientes de Student. Se consideraron significativos los valores de p < 0,05.
RESULTADOS
Con respecto a la situación de la diabetes, las concentraciones sanguíneas de glucosa aumentaron en los animales no tratados en comparación con los del grupo control, pero se normalizaron en las ratas sometidas a trasplante de islotes pancreáticos (fig. 1).
Nuestros resultados en la evaluación de la función endotelial demuestran una vasodilatación media frente a la acetilcolina en el grupo control del 29% ± 4,95, con respecto a la contracción máxima alcanzada.
En el grupo con diabetes, la vasodilatación media a acetilcolina fue de 19,5% ± 3,81. Se encontró significación estadística al comparar la vasodilatación alcanzada en el grupo control frente al diabético, con un descenso importante en éste (p < 0,01).
En el grupo trasplantado, la vasodilatación media a acetilcolina fue de 25% ± 3,78 y se encontraron diferencias significativas al compararla con la vasodilatación observada en el grupo diabético (p < 0,05). Esto demostró la recuperación de la respuesta endotelial a la acetilcolina en el grupo trasplantado (fig. 2).
Por el contrario, al comparar la vasodilatación media a acetilcolina en los grupos control y trasplantado no se hallaron diferencias significativas al ser similares (tabla 1).
En la figura 3 se observa la respuesta vasodilatadora al nitroprusiato en los tres grupos, obteniéndose el 100% de vasodilatación en todos los casos.
DISCUSION
La disfunción endotelial vascular es una complicación que se ha detectado en numerosos estudios clínicos y experimentales en relación con la diabetes mellitus.
Algunos investigadores han demostrado la inhibición de la vasodilatación dependiente del endotelio en animales y humanos diabéticos9, aunque este hallazgo no es constante en todos los estudios10. La diversidad en estos resultados puede deberse a la gran variabilidad metodológica utilizada en este campo, tanto en el modelo experimental como en los protocolos de estudio de la función endotelial empleados por los diversos investigadores. Sin embargo, la mayoría de los estudios sobre grandes vasos, como es nuestro caso, sí demuestran una alteración de la vasodilatación dependiente del endotelio en modelos experimentales de diabetes mellitus11,12.
Nuestros resultados demuestran que la contractilidad del músculo liso vascular y la dilatación inducida por nitroprusiato no dependiente del endotelio no se encontraron alteradas (fig. 3). Esto refleja que la capa muscular lisa del vaso permanece intacta en esta enfermedad. Sin embargo, las principales lesiones parecen producirse tempranamente en el endotelio, ya que encontramos un descenso significativo del porcentaje de dilatación alcanzado por sustancias que requieren de la acción de las células endoteliales para inducir vasorrelajación (fig. 2).
La diabetes puede producir alteraciones tanto funcionales como estructurales del endotelio vascular, lo que podría constituir uno de los factores desencadenantes de la posterior aparición de aterosclerosis en esta enfermedad. Según nuestro estudio, en las etapas iniciales la disfunción endotelial inducida por la diabetes no debe obedecer a lesiones estructurales graves, ya que revierte en el grupo sometido a trasplante.
Los mecanismos implicados en la disfunción endotelial podrían ser varios. Por un lado, se ha postulado un aumento de la síntesis de sustancias vasoconstrictoras por parte de la célula endotelial lesionada y, de hecho, se ha descrito un aumento en la producción de tromboxano A2 en los vasos sanguíneos de ratas diabéticas5. Otra hipótesis más confirmada sobre la posible causa de esta disfunción es el descenso de la síntesis o liberación de sustancias vasodilatadoras, principalmente factor relajante derivado del endotelio, así como un aumento de su destrucción por radicales del oxígeno. Por último también se ha encontrado un defecto en el metabolismo de la arginina como factor implicado en estos hallazgos2.
De todos estos estudios se deduce que un adecuado control de las concentraciones de glucemia en los diabéticos podría prevenir o revertir la disfunción endotelial, con lo que se retrasaría y enlentecería la aparición de la vasculopatía diabética13. En esta línea, aunque el tratamiento crónico con insulina controla la glucemia en los pacientes diabéticos, se postula que este control es menos estable y sufre mayores fluctuaciones que en el caso del trasplante de islotes pancreáticos14.
Nosotros demostramos que mediante el trasplante singénico de islotes pancreáticos se revierte la alteración de la relajación dependiente del endotelio detectada a las 16 semanas de diabetes en anillos aórticos. Según nuestra revisión, sólo otros autores han encontrado resultados similares tras la intervención quirúrgica6,14,15. Sin embargo, refieren conseguir reversión en estadios más tempranos de la diabetes y plantean que, cuando la enfermedad está instaurada durante un tiempo más prolongado, los mecanismos implicados en la disfunción podrían modificarse y el procedimiento no sería tan efectivo.
La corrección de los trastornos endoteliales mediante el trasplante de islotes podría explicarse por diversas causas. Eliminar factores conocidos de disfunción endotelial como los episodios de hiperglucemia y conseguir concentraciones normales de insulina y de hemoglobina glucosilada constituirían algunas de las identificadas hasta el momento16.
En la figura 2 se observa cómo el grupo con diabetes presenta una curva de igual comportamiento con respecto a la del grupo control, aunque con deterioro de la respuesta vasorrelajante conseguida en el primero. Sin embargo, entre el grupo de ratas sometidas a trasplante y el control, aunque la vasodilatación máxima conseguida no presenta diferencias significativas, al estudiar la curva sí pueden apreciarse diferencias de interés. Así, el grupo con trasplante presenta un primer ascenso más lento en los primeros minutos. De esta forma, en el grupo de animales diabéticos trasplantados la respuesta vasodilatadora del endotelio es más lenta aunque, al final, similar a la del grupo control. En el segundo minuto de adición de acetilcolina, en el grupo control se alcanza aproximadamente la máxima dilatación y en el grupo diabético trasplantado sólo un 50%, precisándose el doble de tiempo para alcanzar el grado máximo de relajación. Por tanto, si bien la intervención revierte la capacidad de respuesta endotelial ante determinados fármacos vasorrelajantes, ésta es más lenta, lo que podría significar que no se produce por un mecanismo idéntico al del grupo control. Es posible que algunos de los factores implicados en la disfunción endotelial diabética sean corregidos por el trasplante, pero no otros, lo que conduce a una respuesta de diferente morfología ante la misma sustancia y a la misma concentración. En posteriores estudios, debería identificarse el mecanismo que sigue la vasodilatación mediada por el endotelio en cada grupo, así como los factores en los que difieren y las alteraciones, en caso de existir, que persisten a pesar del trasplante de islotes. Estos hallazgos serían importantes si el objetivo final de esta intervención quirúrgica, en lo que respecta a los vasos sanguíneos, es prevenir la vasculopatía grave, difusa y causante de una gran morbimortalidad que padecen estos enfermos.
En conclusión, hemos demostrado la existencia de una disfunción endotelial grave y temprana en el modelo experimental de diabetes mellitus, que consigue corregirse tras el trasplante singénico de islotes pancreáticos. En un futuro habrá que aclarar si este logro puede traducirse, en el ser humano, en un tratamiento eficaz de las lesiones micro y macrovasculares que caracterizan a la enfermedad.