Fundamentos: Estudiar la actividad in vitro de ocho fluoroquinolonas sobre biocapas de Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa formadas sobre sondas urinarias de látex siliconizado.
Material y métodos: Se estudiaron las fluoroquinolonas norfloxacino, ciprofloxacino, ofloxacino, levofloxacino, clinafloxacino, esparfloxacino, trovafloxacino y moxifloxacino, frente a dos cepas de E. coli (CBR-3 y CBR-4) y dos cepas de P. aeruginosa (HUS-3 y PBR-2). Se determinaron los valores de concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB) de bacterias en suspensión, siguiendo las recomendaciones del NCCLS, y de biocapas de 6 y 24 h formadas sobre sondas urinarias de látex siliconizado. Para determinar los valores de CMI y CMB de las biocapas se utilizaron como inóculo segmentos de sondas urinarias, sobre los que se habían formado biocapas de 6 o 24 h respectivamente.
Resultados: Los valores de CMI de ciprofloxacino frente a biocapas de 24 h de E. coli y P. aeruginosa fueron iguales a los de las bacterias en suspensión. Para el resto de fluoroquinolonas estudiadas, los valores de CMI frente a las biocapas bacterianas fueron dos o más veces mayores a los obtenidos frente a bacterias en suspensión, excepto ofloxacino y E. coli CBR-4, trovafloxacino y E. coli CBR-3, y levofloxacino y trovafloxacino frente a P. aeruginosa PBR-2, en estos casos los valores de CMI fueron iguales en bacterias adheridas y en suspensión. Para todas las fluoroquinolonas evaluadas, los valores de CMB frente a las biocapas de E. coli y P. aeruginosa fueron de 8 a > 4.096 veces los obtenidos para bacterias en suspensión.
Conclusiones: Las biocapas bacterianas de E. coli y P. aeruginosa sobre látex siliconizado son más resistentes a la actividad bactericida de las fluoroquinolonas evaluadas que las bacterias en suspensión.
Objetives: To evaluate the in vitro activity of eight fluoroquinolones against Escherichia coli and Pseudomonas aeruginosa biofilms on siliconized latex urinary catheters.
Material and methods: The MICs and MBCs of norfloxacin, ciprofloxacin, ofloxacin, levofloxacin, clinafloxacin, sparfloxacin, trovafloxacin, and moxifloxacin for two strains of E. coli (CBR-3 and CBR-4) and two strains of P. aeruginosa (HUS-3 and PBR-2) were determined according to the NCCLS guidelines. The susceptibility of bacteria attached to siliconized latex catheters to fluoroquinolones was also evaluated. Catheter segments containing 6 or 24 hours old biofilms were used as inocula for the studies of antimicrobial activity against bacterial biofilms.
Results: MICs of ciprofloxacin for planktonic and attached bacteria were equal. MICs values for the others fluoroquinolones increased two or more times when bacterial biofilms were used as inocula, except for ofloxacin and E. coli CBR-4, trovafloxacin and E. coli CBR-3, and levofloxacin and trovafloxacin and P. aeruginosa PBR-4; in these cases the MIC values for planktonic and attached bacteria were similar. When bacteria attached to siliconized latex were used as inocula, MBCs values increased 8-> 4,096-fold for all the fluoroquinolones evaluated.
Conclusions: E. coli and P. aeruginosa biofilms on siliconized latex were more resistant to the bactericidal activity of fluoroquinolones than planktonic bacteria.
Introducción
Las infecciones urinarias asociadas al uso de sondas urinarias constituyen actualmente una de las principales infecciones nosocomiales1. Escherichia coli es el microorganismo que con más frecuencia se aísla en las infecciones urinarias asociadas al uso de sondas (causa aproximadamente el 25% de ellas), aunque los factores de virulencia descritos para las cepas uropatógenas no parecen tener gran importancia en este tipo de infecciones. Otros microorganismos que con frecuencia producen infecciones asociadas al uso de sondas urinarias son Pseudomonas aeruginosa, enterococos y otras especies de enterobacterias2 . Las bacterias causantes de la infección colonizan la superficie de la sonda urinaria, se adhieren a ella y se multiplican, formando biocapas en las que los microorganismos se encuentran inmersos en una matriz protectora. Esta matriz está constituida por materiales bacterianos extracelulares, conocidos como glucocálix o slime, y por proteínas y sales de la orina2. En este ambiente, las bacterias están protegidas de los mecanismos de defensa del paciente (arrastre mecánico de la orina, fagocitosis por leucocitos polimorfonucleares, etc.) y de la actividad de los antimicrobianos1,3-6. Varios estudios han demostrado que cuando las bacterias crecen formando biocapas sobre biomateriales son más resistentes a la acción de los antimicrobianos que cuando se encuentran en suspensión4,5,7-11.
Algunos autores han evaluado con anterioridad la actividad de algunas fluoroquinolonas sobre biocapas bacterianas. Pascual et al8 obtuvieron incrementos de más de 64 veces en los valores de la concentración mínima bactericida (CMB) de ciprofloxacino y norfloxacino frente a P. aeruginosa cuando las bacterias están adheridas a látex siliconizado; en cambio, otros autores obtuvieron reducciones de hasta el 95% de biocapas de P. aeruginosa con ciprofloxacino12,13. Algunas de las nuevas fluoroquinolonas presentan mayor actividad y espectro antibacteriano que las clásicas; sin embargo, no se dispone de suficientes datos sobre la actividad de estos nuevos compuestos sobre biocapas bacterianas.
El objetivo de este estudio es determinar la actividad de ocho fluoroquinolonas: norfloxacino, ciprofloxacino, ofloxacino, levofloxacino, clinafloxacino, esparfloxacino, trovafloxacino y moxifloxacino, frente a biocapas de E. coli y P. aeruginosa formadas sobre sondas urinarias de látex siliconizado.
Material y métodos
Cepas bacterianas
Se han estudiado dos cepas de E. coli: CBR-3 (sensible a ciprofloxacino) y CBR-4 (resistente a ciprofloxacino) y dos cepas de P. aeruginosa: HUS-3 (sensible a ciprofloxacino) y PBR-2 (resistente a ciprofloxacino), aisladas de orina de pacientes ingresados en el Hospital Universitario Virgen Macarena de Sevilla. La identificación y determinación preliminar de la sensibilidad se realizaron mediante el sistema WalkAway (Dade Beiring, Sacramento, EE.UU. Paneles Neg Combo 3I), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Sondas urinarias
Se usaron sondas urinarias de látex siliconizado (Sondas Foley pediátricas, ISB, 34600 PERAK, Malasia) cortadas en segmentos de 0,5 cm de longitud en condiciones de esterilidad.
Antimicrobianos
Se han evaluado las siguientes fluoroquinolonas: norfloxacino (Sigma, España), ciprofloxacino (Bayer, Alemania), ofloxacino (Hoechst, Alemania), levofloxacino (Roussel, Francia), clinafloxacino (Parke-Davis, EE.UU.), esparfloxacino (Rhône-Poulenc, Francia), trovafloxacino (Pfizer, EE.UU.) y moxifloxacino (Bayer, Alemania).
Formación de las biocapas
Para la formación de biocapas bacterianas se incubaron 100 segmentos de sonda en frascos de 50 ml de caldo Mueller-Hinton ajustado en Ca+2 (concentración final: 25 mg/ml) y Mg+2 (concentración final: 15 mg/ml) durante 1 h a 37 °C, a los que se añadió un inóculo bacteriano, en fase de crecimiento logarítmico, hasta obtener una concentración final de 2,5 * 105 unidades formadoras de colonias (UFC)/ml. Los frascos se incubaron a 37 °C en reposo durante los tiempos evaluados (6 y 24 h). Para determinar el número de bacterias viables adheridas, tras cada tiempo de incubación se extrajeron tres segmentos de sonda; cada segmento se lavó tres veces con tampón fosfato pH = 7,2 (PBS) frío y estéril (2 ml en cada lavado) y se depositó en un tubo con 1 ml de PBS. Para desprender las bacterias adheridas a los segmentos de sonda, los tubos se sonicaron durante 1 min (baño de sonicación, 45 kHz) y después se agitaron durante 15 s en vórtex. Tras realizar diluciones seriadas del contenido de cada tubo, se sembraron 10 µ l para recuento en placas de Mueller-Hinton agar. Cada experimento se realizó por duplicado en días diferentes.
Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI) y CMB
Se determinaron los valores de CMI y CMB de biocapas de 6 y 24 h de dos cepas de E. coli y dos cepas de P. aeruginosa adheridas a sondas urinarias de látex siliconizado. De forma paralela se determinaron los valores de CMI y CMB de suspensiones bacterianas con igual número de bacterias que el de las biocapas estudiadas. Los valores de CMI frente a bacterias en suspensión se determinaron mediante microdilución en placa, siguiendo las recomendaciones del NCCLS. Para determinar la CMI frente a bacterias adheridas se utilizaron como inóculo segmentos de sonda en los que se había formado una biocapa de la cepa a estudiar. La CMI se definió como la concentración de antimicrobiano en la que no se apreciaba crecimiento visible en el medio de cultivo que rodeaba al segmento de sonda. El valor de CMB de las bacterias en suspensión se determinó por recuento de bacterias viables; para determinar la CMB de bacterias adheridas se desprendió la biocapa del segmento de sonda de la forma descrita con anterioridad, y se consideró como valor de CMB aquella concentración de antimicrobiano que mató al 99,9% del inóculo inicial.
Resultados
Los valores de adherencia de las cepas estudiadas a 6 y 24 h fueron: 1,4 ± 0,36 * 104 y 6,5 ± 2,1 * 106 (E. coli CBR-3); 5,12 ± 1,7 * 104 y 1,2 ± 0,3 * 106 (E. coli CBR-4); 2,5 ± 0,25 * 104 y 3,8 ± 1,8 * 106 (P. aeruginosa HUS-3); 2,5 ± 0,41 * 104 y 2,7 ± 0,25 * 106 (P. aeruginosa PBR-2). Los valores medios para ambas especies corresponden a E. coli: 3,3 ± 2,4 * 104 y 4,0 ± 3,4 * 106 UFC/segmento tras 6 y 24 h de incubación, respectivamente; P. aeruginosa: 3,2 ± 1,6 * 104 y 2,6 ± 0,4 * 106 UFC/segmento tras 6 y 24 h de incubación, respectivamente.
Los valores de CMI y CMB de las ocho fluoroquinolonas evaluadas frente a dos cepas de E. coli y dos cepas de P. aeruginosa, en suspensión, se exponen en la tabla 1. Dos de las cepas estudiadas, una cepa de E. coli y otra de P. aeruginosa, fueron resistentes a ciprofloxacino (CMI >= 4 µ g/ml).
Los valores de CMI de ciprofloxacino fueron iguales frente a biocapas de 24 h de E. coli y P. aeruginosa y frente a bacterias en suspensión. Para el resto de las fluoroquinolonas evaluadas, los valores de CMI frente a biocapas de 24 h no fueron en ningún caso superiores a 8 veces los de las bacterias en suspensión (tabla 2).
Las fluoroquinolonas evaluadas presentan valores de CMB frente a biocapas de E. coli y P. aeruginosa significativamente superiores a los de las bacterias en suspensión (tabla 3). Los valores de CMB de las biocapas de 6 y 24 h, tanto en E. coli como en P. aeruginosa, son de 8 a > 4.096 veces mayores a los de las bacterias en suspensión (tabla 3). No observamos diferencias entre las fluoroquinolonas clásicas (norfloxacino, ofloxacino y ciprofloxacino) y las nuevas fluoroquinolonas, así como tampoco aparecen diferencias entre las cepas sensibles a ciprofloxacino en suspensión y las cepas resistentes a esta fluoroquinolona.
Discusión
Estudios previos demuestran que las bacterias que se encuentran formando biocapas son más resistentes a la acción de los antimicrobianos que cuando están suspendidas en un medio líquido1-3,7-11,14. Los mecanismos involucrados en este fenómeno no están totalmente determinados. Uno de los factores implicados es la producción de materiales glucoproteicos extracelulares, que impiden la penetración del antimicrobiano a través de ellos hasta las bacterias4-8. El crecimiento lento de las bacterias cuando están formando biocapas es otro de los mecanismos propuestos para explicar esta resistencia, ya que los antimicrobianos que actúan sobre bacterias en fase de crecimiento logarítmico serían poco efectivos en esta situación14.
La actividad bactericida de fluoroquinolonas sobre biocapas de E. coli y P. aeruginosa ha sido evaluada con anterioridad8,9,12,13,15-18. En este trabajo hemos evaluado la actividad de ocho fluoroquinolonas sobre biocapas de E. coli y P. aeruginosa formadas sobre sondas urinarias de látex siliconizado. Los datos de actividad bactericida de ciprofloxacino frente a biocapas de E. coli de que disponemos en la actualidad son contradictorios. Widmer et al erradicaron biocapas de 24 h de una cepa de E. coli, cuya CMI era de 0,02 µ g/ml, con concentraciones de ciprofloxacino de sólo el doble del valor de la CMB de las bacterias en suspensión15; en cambio, Evans et al no consiguieron destruir las biocapas de E. coli utilizando concentraciones de ciprofloxacino de hasta 50 µ g/ml16. Nuestros resultados son similares a los obtenidos por Evans et al. Aunque las CMI de norfloxacino, ofloxacino y ciprofloxacino frente a biocapas de E. coli fueron similares a las obtenidas frente a bacterias en suspensión (tabla 2), fueron necesarias concentraciones superiores a 8 veces el valor de la CMB de las bacterias en suspensión para obtener una actividad bactericida frente a las biocapas (tabla 3). Este incremento en los valores de CMB se produjo en igual medida en la cepa de E. coli sensible a ciprofloxacino y en la cepa resistente a ciprofloxacino.
Al igual que en el caso de E. coli, los datos de actividad bactericida de fluoroquinolonas sobre biocapas de P. aeruginosa disponibles son contradictorios; algunos autores obtienen una disminución significativa en el número de bacterias viables en biocapas de P. aeruginosa con concentraciones altas de ciprofloxacino, norfloxacino, ofloxacino y pefloxacino12,13,17. Dicha reducción es proporcional a la concentración de fluoroquinolonas utilizada, aunque la erradicación de la biocapa sólo se consigue con concentraciones muy elevadas de fluoroquinolonas. Yassien et al comprobaron que 100 µ g/ml de pefloxacino (10 veces el valor de la CMI de las bacterias en suspensión) eliminan totalmente las biocapas de 24 h de P. aeruginosa17. Otros autores obtienen similares resultados con ciprofloxacino13. En nuestro estudio, las concentraciones de norfloxacino, ofloxacino y ciprofloxacino menores o iguales a 10 veces el valor de la CMB de las bacterias en suspensión no destruyeron las biocapas de P. aeruginosa, siendo necesarias concentraciones superiores en más de 32 veces al valor de la CMB de las bacterias en suspensión de estas fluoroquinolonas para lograr la eliminación de las biocapas de P. aeruginosa, independientemente del patrón de sensibilidad a ciprofloxacino que presentara la cepa (tabla 3). Nuestros resultados con norfloxacino, ofloxacino y ciprofloxacino son similares a los obtenidos con anterioridad por otros autores, que obtienen valores de CMB para las biocapas de P. aeruginosa superiores en más de 64 veces el valor de la CMB de las bacterias en suspensión9,16,18.
Algunas fluoroquinolonas nuevas como levofloxacino o clinafloxacino presentan mayor espectro antimicrobiano y mayor actividad frente a enterobacterias y P. aeruginosa que las fluoroquinolonas clásicas; sin embargo, por el momento se desconoce la actividad de estos nuevos compuestos frente a biocapas bacterianas. En este estudio hemos evaluado la actividad bacteriostática y bactericida de levofloxacino, clinafloxacino, esparfloxacino, trovafloxacino y moxifloxacino frente a biocapas de E. coli y P. aeruginosa. Los valores de CMI de estas nuevas fluoroquinolonas fueron similares para bacterias en suspensión y bacterias adheridas a sondas urinarias de látex siliconizado, y similares a su vez a los de norfloxacino, ofloxacino y ciprofloxacino (tabla 2), excepto frente a biocapas de 6 horas de la cepa de E. coli sensible a ciprofloxacino (CBR-3). En esta cepa se produjo un incremento en los valores de CMI de levofloxacino, clinafloxacino, esparfloxacino, trovafloxacino y moxifloxacino de ocho o más veces el valor de CMI de las bacterias en suspensión (tabla 2). Actualmente estamos desarrollando nuevos estudios para descubrir el mecanismo que explique este fenómeno. Martínez et al han observado que, en presencia de látex siliconizado, P. aeruginosa se hace más resistente a los carbapenems por alteraciones en la expresión de diferentes proteínas de la membrana externa19. Al igual que las fluoroquinolonas más antiguas, la actividad bactericida de los nuevos compuestos frente a biocapas de E. coli y de P. aeruginosa fue inferior a la que presentaron frente a estos microorganismos en suspensión (tabla 3).
Para todas las fluoroquinolonas estudiadas, el incremento en los valores de CMB frente a biocapas de E. coli fue similar al que se produjo frente a biocapas de P. aeruginosa. Al comparar en cada especie cepas con distinta sensibilidad a ciprofloxacino no observamos diferencias en la actividad bactericida de las fluoroquinolonas evaluadas (tabla 3). La actividad bactericida frente a biocapas, sobre látex siliconizado, de E. coli y P. aeruginosa de las nuevas fluoroquinolonas evaluadas no fue mejor que la actividad de las fluoroquinolonas clásicas (norfloxacino, ofloxacino y ciprofloxacino).
Los resultados obtenidos en este estudio indican que tanto las anteriores como las nuevas fluoroquinolonas presentan buena actividad inhibitoria sobre biocapas de E. coli y P. aeruginosa; sin embargo, la actividad bactericida sobre estos microorganismos cuando se encuentran formando biocapas es escasa, siendo necesarias elevadas concentraciones, difíciles de alcanzar in vivo, para esterilizar la superficie de las sondas urinarias.
