Giardia intestinalis (G. intestinalis) es un protozoario causante de enfermedad diarreica y síndrome de malabsorción en humanos y otros mamíferos. Presenta alta diversidad genética evidenciada en el reconocimiento de 7 genotipos (A-G). Los genotipos A y B están comúnmente asociados a humanos y a animales domésticos como perros. El objetivo de este trabajo fue realizar la primera caracterización genética preliminar de G. intestinalis en muestras fecales de humanos y perros de 2 ciudades de la costa Caribe colombiana.
MétodosPara la toma de muestras humanas fueron seleccionadas algunas zonas con altas cifras de enfermedad diarreica aguda, recolectando muestras de heces en niños menores de 7 años con diagnóstico coprológico positivo para G. intestinalis. Las muestras de heces de perros fueron recolectadas en las zonas donde residían los niños incluidos en el estudio. Los quistes fueron purificados por gradiente de sacarosa y posteriormente se obtuvo el ADN por extracción con solventes orgánicos. La caracterización molecular se realizó amplificando el gen triosa fosfato isomerasa (tpi) por PCR-semianidada.
ResultadosFueron obtenidas 202 en total; de estas, 111 (13 de perros y 98 de niños) fueron positivas en el examen coprológico. La distribución de los genotipos en las muestras positivas fue: el 5,1% pertenecieron al genotipo A presente solo en humanos y el 92,3% al genotipo B. El genotipo B tuvo presencia en humanos y animales.
ConclusionesEl genotipo más frecuente tanto en muestras de humanos como animales fue el B, con lo cual podría especularse un ciclo de transmisión zoonótica.
Giardia intestinalis (G. Intestinalis) is a protozoan that causes diarrheal disease and malabsorption syndrome in humans and other mammals. It presents a high genetic diversity evidenced in the recognition of 7 genotypes (A-G). Genotypes A and B are commonly associated to humans and domestic animals such as dogs. The aim of this study was to conduct a preliminary genetic characterization of G. intestinalis in humans and dogs from two cities on the Caribbean coast of Colombia.
MethodsSampling areas were selected according to the highest numbers of acute diarrheal disease. Stool samples were collected from children under 7 years old, with positive medical tests for G. intestinalis. Cysts were purified by sucrose gradient and DNA samples were isolated by extraction with organic solvents. Molecular characterization was performed by amplifying the gene triose phosphate isomerase (tpi) by using a semi-nested PCR.
ResultsA total of 202 samples of DNA were obtained; of these, 111 were positive in coproparasitological analysis (13 dogs and 98 children). Genotype distribution in positive samples was: 5.1% belonged to genotype A and 92.3% to genotype B. Genotype B was present in humans and animals.
ConclusionsThe most common genotype in both human and animal samples was genotype B, suggesting a zoonotic transmission cycle.
Giardia intestinalis (G. intestinalis) es un parásito intestinal flagelado que tiene la capacidad de infectar a una amplia diversidad de hospedadores. Tiene una distribución mundial y es el agente causal de la giardiasis, una de las enfermedades intestinales más comunes en los humanos1–3. El análisis de esta parasitosis, utilizando genes específicos como marcadores moleculares, ha permitido determinar la alta variabilidad genética de G. intestinalis, estableciendo 7 genotipos (A-G) de los cuales los genotipos A y B están asociados con infecciones en humanos y otros mamíferos mientras que los restantes (C y G) muestran una especificidad elevada con el huésped (mamíferos no humanos)4.
La prevalencia de esta enfermedad es mayor en países de economías emergentes que en países industrializados y la Organización Mundial de la Salud estima que alrededor de 200 millones de personas de Asia, África y América Latina presentan giardiasis sintomática y cada año se diagnostican alrededor de 500.000 nuevos casos5. En Colombia, se estima que la frecuencia de giardiasis es aproximadamente del 28% en la población infantil, siendo esta la más afectada por el parásito6. A nivel del Caribe colombiano solo se conoce un registro de G. intestinalis reportado en el 2008 en el municipio Loma de Piedra, departamento de Bolívar. Este estudio reporta 67 casos que representan el 17% de la población en general, pero no se conoce el genotipo circulante7.
La infección por Giardia tiene un gran impacto en la salud pública dada la relación que existe entre la ocurrencia de esta parasitosis y los hábitos y condiciones socioeconómicos de las poblaciones afectadas. Adicionalmente, han sido reportados genotipos comunes infectando a animales domésticos y a humanos en la misma área geográfica, razón por la que se postula que estos genotipos tienen potencial zoonótico, sin embargo, no existe suficiente información al respecto. Por lo anterior, el objetivo de este trabajo fue iniciar la identificación y caracterización genotípica de los parásitos en muestras de heces de niños y perros en 2 ciudades del Caribe colombiano.
Este estudio aporta información al conocimiento de la biología de la infección en el Caribe colombiano, actualmente muy escasa o inexistente. Este tamizaje facilitará el conocimiento de genotipos presentes en humanos y sus mascotas que puedan tener relación zoonótica, a la vez que contribuye al cumplimiento y mejora del plan territorial del departamento de Bolívar, Colombia.
MétodosEste estudio fue realizado entre julio de 2008 y julio de 2009 en las ciudades de Cartagena de Indias y Sincelejo. Cartagena pertenece al departamento de Bolívar, norte de Colombia, posee 895.400 habitantes aproximadamente (censo DANE 2005) y está localizada a 10° 26’ latitud norte-75° 33’ longitud oeste y 2m sobre el nivel del mar. Sincelejo es una ciudad del departamento de Sucre. Está ubicada al noroeste del país, en la Costa Caribe colombiana de 9° 18’ latitud norte, 75° 23’ latitud oeste y 213m sobre el nivel del mar (fig. 1).
Inicialmente se realizó una encuesta epidemiológica, a partir de la cual se eligieron como sitios de muestreo las áreas de las ciudades que presentaron la mayor incidencia de quistes de G. intestinalis. La información y las muestras de materia fecal humana de niños menores de 7 años infectados fueron obtenidas del Centro de Atención Primaria de la Esperanza y del Hospital Infantil Napoleón Franco Pareja para la ciudad de Cartagena donde se tomaron 52 muestras de niños. El Hospital Regional de Sincelejo y el Centro de Salud la Campiña permitieron la obtención de 46 muestras de niños en la ciudad de Sincelejo. Se realizó una visita a las localidades de procedencia de los niños incluidos en el estudio, seleccionando los hogares que tuvieran perros como mascotas y se tomó la muestra de heces del animal; un total de 104 muestras fueron obtenidas en ambas ciudades (tabla 1). Las normas éticas para los humanos y los animales fueron aplicadas, y se obtuvo el consentimiento de los padres y propietarios de los perros para el uso de las muestras en el estudio.
Las muestras colectadas fueron almacenadas en formol tamponado para el análisis coprológico y molecular. Los quistes fueron purificados y se rompieron por el método de Polverino, con algunas modificaciones8.
El ADN genómico fue aislado utilizando la técnica de extracción con solventes orgánicos: fenol, cloroformo, alcohol isoamílico (25:24:1)9. La calidad y cantidad del ADN fueron verificadas con la lectura espectrofotométrica y electroforesis en geles de agarosa.
Para la amplificación del gen triosa fosfato isomerasa (tpi) de G. intestinalis, se realizaron 2 pruebas de PCR-semianidada, con cebadores específicos para los genotipos A y B10,11 más algunas modificaciones. Inicialmente se realizó una primera reacción con una mezcla de cebadores para amplificar simultáneamente los 2 genotipos usando un cóctel de reacción de buffer de PCR 1x, 3mM Cl2Mg, 0,25mM de cada cebador en ambas direcciones, DMSO al 2,5% y 0,625 U/μl de Taq ADN polimerasa Techno Scientific® y 4μl del ADN extraído de los quistes, con un volumen final de reacción de 25μl. Las condiciones de la amplificación fueron desnaturalización a 94°C por 4min, seguida de 30 ciclos de temperatura iniciando con 94° (30s), 52°C (30s) y 72°C (60s), con extensión final a 72°C durante 10min. La segunda PCR fue realizada con el fin de amplificar los genotipos de G. intestinalis por separado, empleando los cebadores específicos para cada genotipo con el mismo cóctel de reacción mencionado anteriormente. Para cada prueba fueron incluidos 2 controles negativos (agua destilada y ADN de Entamoeba histolytica) y un control positivo (ADN de la cepa universal WB Clon 6; donación del Doctor Moisés Wasserman del grupo de Investigación en Ciencias Básicas Bioquímicas de la Universidad Nacional de Colombia). Por último, se realizó una electroforesis en gel de agarosa al 1,5% y una tinción con bromuro de etidio a una concentración de 5μg/ml para comprobar la amplificación del gen de interés. El análisis estadístico fue realizado utilizando el programa Gradpha Prisma.
ResultadosUn total de 202 muestras de heces fueron recogidas, 98 de las cuales provenían de niños menores de 7 años, todas positivas para la presencia de G. intestinalis; y 104 provenían de perros que cohabitaban con los niños infectados, siendo positivas para el parásito solo 13 muestras. La prevalencia de G. intestinalis en perros fue del 11,9%.
A partir del ADN aislado de las muestras se lograron amplificar en total 65 muestras positivas, 61 de las cuales pertenecían a humanos y 4 a perros. Los resultados de la genotipificación del parásito utilizando el gen tpi mostraron que el 5,1% de las muestras tuvieron genotipo A, todas provenientes de humanos, y que el 92,3% de las muestras presentaron genotipo B, tanto en humanos como en perros (tabla 2).
Muestras positivas por coprología y distribución de genotipos A y B de Giardia intestinalis en muestras de humanos y Canis familiaris
| Ciudad | Muestras positivas por cropología Canis familiaris | Genotipo | Muestras de niños | Positivas por cropología | Genotipo | ||
| A | B | A | B | ||||
| Sincelejo | 4 | 0 | 1 | 46 | 46 | 0 | 25 |
| Cartagena | 9 | 0 | 3 | 52 | 52 | 5 | 31 |
| Total | 13 | 0 | 4 | 98 | 98 | 5 | 56 |
El conocer y entender los diferentes ciclos de vida de los parásitos que presentan algún tipo de relación zoonótica resulta de gran interés para crear y desarrollar estrategias de control eficaces. Una de las formas de conocer la epidemiología y transmisión de los parásitos es el estudio a nivel molecular de sus genotipos poblacionales.
Los estudios de caracterización genética de esta enfermedad han sido usados para evaluar el papel de los animales en la epidemiología de la infección humana, esclarecer el ciclo biológico del parásito, determinar los reservorios animales de G. intestinalis y desarrollar herramientas que permitan esclarecer la fuente de infección12,13. Por ejemplo, se conoce que los quistes de G. intestinalis se transmiten de humanos a animales y de animales a humanos, lo que ha establecido una posible transmisión zoonótica entre ciertos genotipos como el A y el B; sin embargo, esta hipótesis ha sido debatida por muchos autores como Plutzera et al.14, mientras que otros han establecido que el riesgo zoonótico está presente con algunos genotipos específicos como el A15,16.
A través de la caracterización molecular de G. intestinalis se han descrito múltiples estrategias con el fin de facilitar el diagnóstico efectivo del patógeno y aplicar así controles fitosanitarios particulares para cada cepa. Las técnicas desarrolladas para la caracterización de G. intestinalis tienen en común algunos procedimientos generales como la purificación de los quistes5,17 y técnicas eficaces para la obtención de un ADN de quistes de calidad que permita una excelente amplificación. De forma general, el ADN de parásitos extraído de las muestras fecales ha sido difícil de amplificar debido a la presencia de un alto nivel de ADN no específico o a la cantidad de inhibidores tales como polen, azúcares, bilirrubina, sales biliares y detritos en general5. En nuestro estudio estos inconvenientes fueron superados utilizando el gradiente de sacarosa para la separación, purificación y concentración de quistes de G. intestinalis eliminando la mayoría de los detritos de las muestras y obteniéndose una buena cantidad de quistes, superando técnicas convencionales como la flotación con sulfato de cinc8. La extracción de ADN fue optimizada implementando un pretratamiento a los quistes de G. intestinalis, ciclos de congelación-descongelación y efecto mecánico con arena de mar; esto permitió una rotura de la pared quística del parásito5,18 y obtener un ADN con buena pureza, lo que hizo posible la amplificación del gen tpi de G. Intestinalis, logrando establecer la presencia de los genotipos A y B de G. intestinalis en el Caribe colombiano.
A pesar de que los datos reportados en la literatura en relación con la presencia de genotipos A y B en humanos y en perros son contradictorios, nuestros resultados muestran la presencia del genotipo A (5,1%) solo en humanos, mientras que el genotipo B se encuentra indistintamente en perros (30,7%) y humanos (59,1%), lo cual concuerda con otros estudios19. Estos resultados nos permiten especular que pudiera asociarse a un posible ciclo de transmisión zoonótica para el genotipo B, en el Caribe colombiano, sin embargo, teniendo en cuenta la limitación del número de muestras utilizado en este estudio para los perros, no podemos obviar la existencia de otras posibles vías de transmisión de este genotipo. Además de este hallazgo, la amplificación del genotipo B en las muestras de Cartagena y Sincelejo se constituyen en el primer registro del genotipo para el país, resultados que concuerdan con otros estudios realizados en América Latina, en países tales como Nicaragua, Argentina y Guatemala11,15,20.
Estudios en humanos han revelado que el genotipo B presenta mayor especificidad por el huésped que el genotipo A, presentándose este último tanto en humanos como en perros en proporciones similares. Según los datos obtenidos en esta investigación, en el Caribe colombiano el genotipo más frecuente es el B, lo cual concuerda con datos epidemiológicos encontrados en otros países como Holanda, Francia y Bangladesh16,21. Sin embargo, estudios desarrollados en zonas de Cundinamarca, Boyacá y Amazonas mostraron una mayor frecuencia del genotipo A en humanos22.
Los datos obtenidos en este estudio permiten mostrar una prevalencia importante de G. intestinalis en nuestra región, lo cual representa un problema de salud pública por la amplia distribución del parásito y las deficientes técnicas de higiene, hábitos y condiciones socioeconómicas de nuestra población, por lo que se requieren estudios adicionales con diagnóstico molecular que incluya técnicas de fragmentos de restricción de longitud polimórfica y análisis de secuenciación para diferenciar minuciosamente los genotipos y subtipos del parásito que faciliten aclarar el potencial zoonótico de cada genotipo.
FinanciaciónUniversidad de Cartagena. Facultad de Medicina. Departamento de Posgrado de la Facultad de Medicina. Maestría Microbiología.
Conflicto de interesesLos autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
A la Universidad de Cartagena, Centro de Atención Primaria de la Esperanza, Hospital Infantil Napoleón Franco Pareja Cartagena, Hospital Regional de Sincelejo y Centro de Salud la Campiña por la disponibilidad de las muestras de este proyecto.
