Fundamento. El sistema lisis-centrifugación (Isolator system) es una técnica con excelentes resultados en la recuperación de micobacterias en muestras de sangre. Este sistema está compuesto fundamentalmente por saponina (SAP), polipropilenglicol (PPG) y polianetol sulfonato de sodio (SPS). El objetivo de este estudio fue determinar el efecto de SAP, PPG y SPS sobre el crecimiento de Mycobacterium avium, M. kansasii, M. tuberculosis y M. xenopi en los medios de cultivo líquidos MGIT y Septi-Chek AFB.
Métodos. Se prepararon en dos concentraciones SAP, PPG y SPS, y se añadieron en cantidad de 0,1 ml (individualmente, en parejas y en combinación los tres) en los medios líquidos MGIT y Septi-Chek AFB. Posteriormente los medios de cultivo líquidos fueron inoculados individualmente con dos concentraciones diferentes (103 y 105 unidades formadoras de colonias [UFC]/ml) de cada una de las cuatro micobacterias utilizadas en este estudio. Los medios fueron incubados a 37ºC y diariamente se vigiló el crecimiento.
Resultados. SAP, PPG y SPS no anularon el crecimiento de las micobacterias, pero sí lo retardaron (mayor tiempo en la detección del crecimiento con relación al control positivo). Las concentraciones finales de SAP, PPG y SPS que retardaron el crecimiento de las micobacterias fueron variables, dependiendo de la especie e inóculo micobacteriano, e igualmente del medio líquido utilizado.
Conclusiones. Las sustancias que componen el sistema lisis-centrifugación (SAP, PPG y SPS) en forma individual y combinada retardaron el crecimiento de M. avium, M. kansasii, M, tuberculosis y M. xenopi en concentraciones de 103 y 105 UFC/ml, en los medios de cultivo líquidos MGIT y Septi-Chek AFB. Estos resultados sugieren la necesidad de plantear estrategias para disminuir las concentraciones de estas tres sustancias, presentes en el sedimento de la sangre procesada por el sistema Isolator, que finalmente van a ser añadidas a los medios líquidos MGIT y Septi-Chek AFB.
Background. The lysys-centrifugation system (Isolator system) is a technique with excellent results in the recovery of mycobacteria from blood specimens. This system consists mainly of saponin (SAP), polypropylenglycol (PPG), and sodium polianthol sulfonate (SPS). The objective of this work was to determine the effect of SAP, PPG, and SPS on the growth of Mycobacterium avium, M. kansasii, M. tuberculosis, and M. xenopi in fluid culture media MGIT and Septi-Chek AFB.
Methods. Two concentrations each of SAP, PPG, and SPS were prepared, and were added in 0.1 ml amounts (alone, in pairs and in combination) to fluid media MGIT and Septi-Chek AFB. Fluid culture media were then in individually inoculated with two different concentrations (103 and 105 CFU/ml) of each of the four mycobacterial strains used in this study. Culture media were incubated at 37 ºC and were checked for growth daily.
Results. SAP, PPG, and SPS did not inhibit growth of mycobacteria but growth of these strains was indeed retarded (a lengthier time was required for detection of bacterial growth compared with the positive control). Final concentrations of SAP, PPG, and SPS which retarded mycobacterial growth varied, depending upon species, mycobacterial inoculum size, and fluid culture media used.
Conclusions. Components included in the lysy-centrifugation system (SAP, PPG, and SPS), either alone or in combination retarded growth of M. avium, M. kansasii, M. tuberculosis, and M. xenopi in 103 and 105 CFU/ml concentrations in fluid culture media MGIT and Septi-Chek AFB. These results suggest that strategies should be adopted to decrease the concentrations of these three components, present in the sediment of the processed blood by the Isolator System, which eventually are going to be added to fluid media MGIT and Septi-Check AFB.
Introducción
En la técnica de lisis-centrifugación (Isolator System, Wampole Laboratories, Division of Carter-Walllace, Incorporated, Cranbury, N. J.), la sangre obtenida por punción venosa estéril se inocula en un tubo que contiene polianetol sulfonato de sodio (SPS) componente que funciona como anticoagulante, saponina (SAP) sustancia que lisa células blancas y rojas y permite la liberación intracelular de las micobacterias, y polipropilenglicol (PPG) sustancia antiespumante. Después de que la sangre extraída se ha mezclado con estas tres sustancias en el tubo, se centrifuga y el sedimento obtenido es sembrado en un medio de cultivo adecuado que puede ser líquido, generalmente BACTEC 12B (Becton-Dickinson, Diagnostic Instruments Systems, Sparks, Md), y/o sólido1,3.
Recientemente se informó que la inoculación del sedimento de la sangre procesada por el sistema Isolator, en frascos BACTEC 12B, inhibía el crecimiento de Mycobacterium avium - intracellulare4, y además que el efecto inhibidor era causado principalmente por PPG y a la acción combinada de éste con SAP y SPS5.
El sistema MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube; Becton Dickinson Microbiology Systems, Cockeysville, Md.) es un nuevo medio de cultivo líquido que lleva incorporado un componente de rutenio que emite fluorescencia detectable a 365 nm a medida que disminuye la tensión parcial de oxígeno del medio como consecuencia del crecimiento bacteriano6. Este medio se constituye en una alternativa a los medios de cultivo radiométricos, más aún en países subdesarrollados donde sería útil adoptarlos en la rutina de los laboratorios.
Si se plantea el uso del sistema lisis-centrifugación acoplado a medios de cultivo líquidos, como el MGIT y el Septi-Chek AFB (Becton Dickinson and Co, Cockeysville, Md.), para la recuperación de micobacterias en sangre, se podría pensar que las sustancias que componen el sistema lisis-centrifugación también afectarían negativamente el crecimiento de las micobacterias en estos dos medios de cultivo.
Por esto, el objetivo de este trabajo fue determinar con un modelo experimental el efecto de SAP, PPG y SPS en el crecimiento de M. avium, M. kansasii, M. tuberculosis y M. xenopi en concentraciones de 103 y 105 unidades formadoras de colonias [UFC]/ml en los medios MGIT y Septi-Chek AFB.
Material y métodos
Preparación del inóculo
Se utilizaron cuatro cepas micobacterianas (M. avium, M. kansasii, M. tuberculosis y M. xenopi) aisladas, identificadas y gentilmente cedidas por el Instituto Nacional de Salud. Cada una de las cuatro micobacterias se inoculó en tubos MGIT para obtener crecimiento hasta una turbidez similar al tubo 1 de la escala de McFarland, a partir del cual se estandarizaron concentraciones de 103 y 105 UFC/ml por medio de diluciones y siembras en el medio 7H10.
Adición de SAP, PPG Y SPS
De cada uno de los componentes del sistema Isolator se prepararon dos concentraciones finales, antes de su inoculación en los medios líquidos, utilizando como diluyente agua destilada estéril. Así, SAP (Sigma Chemical Co, St. Louis, Mo.) de 14 y 28 mg/ml, SPS (Sigma Chemical Co, St. Louis, Mo.) de 10 y 15 g/l, y PPG (ICN Biomedicals, Inc., Aurora) de 4 y 8 ml/l. Las preparaciones y cantidades de los componentes agregados en los medios líquidos MGIT y Septi-Chek AFB se dispusieron de la siguiente manera: a) de cada una de las concentraciones en forma individual se añadió 0,1 ml; b) se combinaron en pareja, en partes iguales cada uno de los componentes preparados, y de cada mezcla se agregó 0,1 ml en los medios líquidos, y c) los tres componentes en las concentraciones más altas fueron combinados y 0,1 ml de esta mezcla fue inoculada en los medios líquidos.
Inoculación de las micobacterias en los medios
Después de la adición de los componentes en los medios líquidos, se procedió a la inoculación de las micobacterias. Los medios de cultivo líquidos MGIT y Septi-Chek AFB fueron inoculados en forma separada con 100 µ de la concentración 103 UFC/ml y 50 µ de la concentración 105 UFC/ml de cada una de las micobacterias que representan, respectivamente, 100 y 500 UFC. También se montaron controles positivos y negativos de crecimiento. El control positivo de crecimiento estuvo compuesto por el medio líquido respectivo más 0,1 ml de agua estéril y el inóculo de cada una de las micobacterias, sin la adición de ninguna sustancia. El control negativo estuvo compuesto por el medio líquido más 0,1 ml de agua estéril sin el inóculo micobacteriano y sin la adición de ninguna sustancia. Todas las pruebas fueron realizadas por duplicado. Los medios de cultivo fueron incubados a 37 ºC y examinados día a día hasta las 8 semanas. La vigilancia del crecimiento de las micobacterias en el medio MGIT se realizó en forma manual con una lámpara de luz ultravioleta (365 nm) para observar la emisión de fluorescencia, también se vigiló visualmente la turbidez y la formación de copos en el medio. En el medio Septi-Chek AFB, del cual sólo se utilizó la parte líquida, la vigilancia del crecimiento se realizó macroscópicamente basado en la turbidez del medio y en la presencia de copos o cordones. De este medio al final de cada semana se hicieron extendidos y pases ciegos a Löwenstein-Jensen. El crecimiento micobacteriano en los dos medios líquidos se confirmó por medio de la coloración de Ziehl-Neelsen. Todos los medios líquidos positivos o negativos al Ziehl-Neelsen fueron resembrados en Löwenstein-Jensen.
Resultados
En todas las pruebas se detectó crecimiento micobacteriano, lo que indica que ninguna de las tres sustancias evaluadas anuló el crecimiento de las micobacterias en los dos medios de cultivo líquidos utilizados; por lo tanto la recuperación de las micobacterias en los dos medios de cultivo líquidos fue del 100%. Lo que sí se observó en algunas pruebas fue un retraso en el crecimiento micobacteriano con relación al control positivo de crecimiento (medio líquido con la micobacteria sin la adición de SAP, PPG y SPS). Este tiempo de retraso, considerado como un efecto negativo ocasionado por SAP, PPG y SPS, se midió en días promedio de pruebas realizadas por duplicado, fue mayor en el Septi-Chek AFB en comparación al MGIT (Chi cuadrado, p < 0,05) (tablas 1 y 2).
Las concentraciones finales de las sustancias (SAP, PPG y SPS) incorporadas en los medios líquidos se estableció en función de la cantidad de caldo que posee el MGIT (4 ml) y el Septi-Chek AFB (20 ml) (tablas 1 y 2). Los controles positivos de crecimiento permitieron determinar las concentraciones mínimas de SAP, PPG y SPS (en forma individual, en combinación en pareja y las tres mezcladas en su mayor concentración) que retardaron el crecimiento de las micobacterias en los medios líquidos MGIT y Septi-Chek AFB.
Las concentraciones mínimas de SAP, PPG y SPS, que retardaron el crecimiento de M. avium en el medio MGIT fueron, respectivamente, iguales en los dos inóculos (103 y 105 UFC/ml), 0,7 mg/ml, 0,1 ml/l y 0,25 g/l (tabla 3). Las concentraciones mínimas de SAP, PPG y SPS, que retardaron el crecimiento de M. avium en el medio Septi-Chek AFB fueron, respectivamente, 0,07 mg/ml, 0,02 ml/l y 0,05 g/l, con un inóculo de 103 UFC/ml, y 0,14 mg/ml, 0,02 ml/l y 0,08 g/l, respectivamente, con un inóculo de 105 UFC/ml (tabla 4).
Las concentraciones mínimas de SAP, PPG y SPS, que retardaron el crecimiento de M. kansasii en el medio MGIT fueron, respectivamente, 0,35 mg/ml, 0,2 ml/l y 0,25 g/l con un inóculo de 103 UFC/ml, y 0,7 mg/ml, 0,1 ml/l y 0,25 g/l, con un inóculo de 105 UFC/ml (tabla 3); y las que retardaron el crecimiento de M. kansasii en el medio Septi-Chek AFB fueron, respectivamente, iguales en los dos inóculos (103 y 105 UFC/ml), 0,14 mg/ml, 0,04 ml/l y 0,08 g/l (tabla 4).
Las concentraciones mínimas de SAP, PPG y SPS, que retardaron el crecimiento de M. tuberculosis con un inóculo de 103 UFC/ml fueron, respectivamente, 0,7 mg/ml, 0,2 ml/l y 0,25 g/l, en el medio MGIT, y 0,07 mg/ml, 0,02 ml/l y 0,08 g/l, respectivamente, en el medio Septi-Chek AFB (tablas 3 y 4); y las que retardaron el crecimiento de M. xenopi con un inóculo de 103 UFC/ml fueron, respectivamente, 0,35 mg/ml, 0,2 ml/l y 0,38 g/l, en el medio MGIT, y 0,07 mg/ml, 0,02 ml/l y 0,05 g/l en el medio Septi-Chek AFB (tablas 3 y 4).
Ninguna de las sustancias evaluadas retardó el crecimiento de M. tuberculosis y M. xenopi con inóculos de 105 UFC/ml en el medio MGIT (tabla 3).
Las concentraciones mínimas de SAP, PPG y SPS, que retardaron el crecimiento de M. tuberculosis y M. xenopi con inóculos de 105 UFC/ml en el medio Septi-Chek AFB fueron, respectivamente, 0,07 mg/ml, 0,02 ml/l y 0,08 g/l, y 0,14 mg/ml, 0,02 ml/l y 0,05 g/l (tabla 4).
En las tablas 3 y 4 se detallan las concentraciones mínimas de SAP, PPG y SPS en forma combinada, que retardaron el crecimiento de M. avium, M. kansasii, M. tuberculosis y M. xenopi en los medios de cultivo líquidos.
Discusión
La presencia de micobacterias en pacientes con sida ha conducido al diseño de técnicas de diagnóstico rápidas y sensibles que permiten la recuperación, en poco tiempo, de estos microorganismos en muestras de sangre. Entre las técnicas actualmente disponibles para la recuperación de micobacterias en sangre, las más eficaces son las de lisis-centrifugación (sistema Isolator) y la radiométrica del sistema Bactec (Bottles Bactec 13A, Becton Dickinson Diagnostic Instrument Systems, Sparks, Md). En la técnica de lisis-centrifugación la sangre es lisada y el sedimento obtenido después de la centrifugación es inoculado, en un medio de cultivo adecuado que puede ser líquido (generalmente BACTEC 12B) y/o sólido, con el fin de obtener la propagación de los microorganismos1-3.
En 1994 Wasilauskas et al4 encontraron que el uso del sistema Isolator acoplado a las botellas BACTEC 12B inhibía el crecimiento de micobacterias del complejo M. avium. De 162 cepas del complejo M. avium aisladas en muestras de sangre, el 94% (n=152) fue recuperado en el medio sólido Löwenstein-Jensen, mientras que el 50% (n=81) fue recuperado en botellas BACTEC 12B. El tiempo promedio de detección de estas micobacterias fue mayor en el BACTEC 12B (24 días) en relación con el Löwenstein-Jensen (18 días). Ellos argumentaron que probablemente el bajo índice de recuperación en las botellas BACTEC 12B se debía a la acción inhibitoria de algún componente del sistema Isolator; y finalmente afirman que el sistema lsolator no se debe utilizar acoplado a las botellas BACTEC 12B4.
Posteriormente, Whittier et al7 informaron una baja recuperación de M. avium (60%) utilizando el sistema Isolator acoplado al BACTEC 12B, en comparación al 100% de recuperación de M. avium utilizando el sistema lsolator acoplado al Septi-Chek AFB.
En 1997 Benedict Wasilauskas and Robert Morrell5 descubrieron que la causa de la inhibición en la recuperación de M. avium en el medio BACTEC 12B (medio con 4 ml de caldo) se debía principalmente a la acción individual de PPG y a la acción combinada de éste con SAP y SPS. En este estudio, aunque no demostraron la concentración mínima inhibitoria de los componentes del sistema Isolator, sí encontraron que PPG (0,2 ml/l), SAP (0,7 mg/ml), PPG (0,2 ml/l) + SAP (0,7 mg/ml), PPG (0,2 ml/l) + SPS (0,38 g/l), PPG (0,2 ml/l) + SAP (0,7 mg/ml) + SPS (0,38 g/l) inhibían la recuperación de M. avium en el BACTEC 12B.
Nuestro diseño experimental permitió mostrar que las sustancias SAP, PPG y SPS, componentes del sistema Isolator, no anularon el crecimiento de M. avium, M. kansasii, M. tuberculosis y M. xenopi, con inóculos de 103 y 105 UFC/ml, en los medios líquidos MGIT y Septi-Chek AFB, pero sí condujeron a un retraso en días en el crecimiento de éstas. Este retraso no sólo depende de la especie y del inóculo micobacteriano sino además del medio de cultivo empleado.
Bruce A. Hanna et al8 presentaron una investigación en donde se muestra una recuperación eficiente de micobacterias en el medio MGIT, después de ser inoculados con el sedimento proveniente del sistema lisis-centrifugación. En este estudio realizado en 505 muestras de sangre, se recuperaron 44 micobacterias utilizando el sistema lsolator acoplado al MGIT, en comparación con las 40 micobacterias recuperadas utilizando el sistema Isolator acoplado al medio sólido Löwenstein-Jensen. Los investigadores concluyen que no existió ninguna inhibición en el crecimiento de las micobacterias en los tubos MGIT. Originalmente los tubos Isolator contienen aproximadamente 14 mg de SAP, 4,16 mg de PPG (densidad 1,04 g/l) y 7,65 mg de SPS5; cantidades que se reducen después del proceso de lisis y centrifugación de la sangre procesada. Los residuos de estas tres sustancias en 1 ml del sedimento de la sangre procesada podrían disminuirse a una quinta parte, SAP 2,8 mg, PPG 0,000832 mg y SPS 1,53 mg. Las cantidades finales de estas tres sustancias en el sedimento son variables y dependen del volumen de sangre inoculado y del proceso de centrifugación y eliminación del sobrenadante. Este grupo de investigadores8 tuvieron en cuenta éstas y otras observaciones1 con el fin de evitar inhibiciones en el crecimiento micobacteriano y utilizaron solamente 0,25 ml del sedimento de los tubos Isolator para inocularlo en el medio MGIT. Si hacemos cálculos los 0,25 ml del sedimento representan, respectivamente, concentraciones de SAP, PPG y SPS en el medio MGIT de 0,18 mg/ml, 0,05 ml/l, y 0,1 g/l que están por debajo de las concentraciones que en nuestro estudio mostraron no anular el crecimiento micobacteriano pero sí retardarlo.
También se observa en nuestro estudio que al aumentar el inóculo micobacteriano de 103 a 105 UFC/ml, se disminuye el número de pruebas afectadas negativamente en el tiempo de crecimiento de las micobacterias en los medios líquidos utilizados. Posiblemente este comportamiento sea debido a que al aumentar el número de UFC/ml la acción retardadora sea menos efectiva, lo que llevaría a pensar que sería más difícil la recuperación de micobacterias en muestras de sangre con una baja carga microbiana.
El SPS es una sustancia anticoagulante y un componente de los medios de cultivo diseñados para la recuperación de microorganismos en muestras de sangre. En un trabajo anterior9 se concluye que SPS, además de ser un potente inhibidor de la reacción en cadena de la polimerasa, es muy resistente a la remoción por los métodos tradicionales de purificación de ADN. Si en algún momento se desea amplificar ADN de micobacterias de muestras de sangre inyectadas en el sistema Isolator o de medios líquidos (BACTEC 12B, MGIT o Septi-Chek AFB) que han sido inoculados con el sedimento proveniente del sistema Isolator, es muy importante tener en cuenta al SPS, ya que puede actuar inibiendo el proceso de amplificación genética.
En conclusión, se puede decir que las sustancias que componen el sistema lisis-centrifugación (SAP, PPG y SPS) en forma individual y combinada retardaron no solamente el crecimiento de M. avium sino también el crecimiento de M. tuberculosis, M. xenopi y M. kansasii, en concentraciones de 103 y 105 UFC/ml, en los medios de cultivos líquidos MGIT y Septi-Chek AFB. Estos resultados sugieren la necesidad de plantear estrategias para disminuir las concentraciones de estas tres sustancias, que quedan como residuos en el sedimento de la sangre procesada por el sistema Isolator, que finalmente van a ser añadidas en los medios líquidos MGIT y Septi-Chek AFB.
